細胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)書

1、細胞生物學(xué)實驗指導(dǎo)書適用專業(yè)：生物科學(xué)、生物技術(shù)實驗?zāi)夸泴嶒炓?植物原生質(zhì)體的分離與融合1實驗二 動物細胞原代培養(yǎng)3實驗三 細胞傳代培養(yǎng)4實驗四 植物細胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察5實驗五 細胞凋亡的誘導(dǎo)、觀察與檢測7實驗六 環(huán)境因素誘變?nèi)旧w改組的觀察9實驗七 紅細胞膜蛋白的分離及其電泳檢測11實驗一 植物原生質(zhì)體的分離與融合實驗項目類型：綜合性所屬課程名稱：細胞生物學(xué)實驗計劃學(xué)時：7學(xué)時一、實驗?zāi)康?1.掌握原生質(zhì)體分離的原理與技術(shù)；2.了解細胞融合的基本原理及應(yīng)用；3.初步掌握PEG融合法和電融合法。二、實驗原理植物原生質(zhì)體是去除了細胞壁的裸露的細胞。原生質(zhì)體可以從培養(yǎng)的單細胞、愈傷組織和植物

2、器官（葉等）獲得。但一般認為從葉肉組織分離原生質(zhì)體是理想的材料，其優(yōu)點是材料來源方便，供應(yīng)及時，而且遺傳性較為一致。原生質(zhì)體的分離通常采用酶解法，對細胞壁成分進行降解后獲得。原生質(zhì)體培養(yǎng)的條件和對營養(yǎng)的要求與組織、細胞相似。但原生質(zhì)體由于除去了細胞壁，所以需要一定濃度的滲透壓穩(wěn)定劑來保持原生質(zhì)體的穩(wěn)定。常用的滲透壓穩(wěn)定劑包括甘露醇、山梨醇、蔗糖等。其次,還應(yīng)當(dāng)考慮取材、酶的種類和純度、酶液 的滲透壓、酶解時間及溫度等因素對分離原生質(zhì)體的影響。2個或2個以上的細胞合并成為1個細胞的現(xiàn)象稱為細胞融合。細胞融合的主要方法有病毒法、聚乙二醇（PEG）法和電融合3種方法，其原理基本相同，都是兩細胞接觸點

3、的膜分子發(fā)生重組，然后由于表面張力作用，形成一個球形細胞。原生質(zhì)體分離融合和培養(yǎng)的意義：1.除去了細胞壁為植物細胞之間的融合掃平了障礙，為制造新雜種開辟了道路。植物原生質(zhì)體融合和培養(yǎng)在植物遺傳工程和育種研究上具有廣闊的應(yīng)用前景。它是植物同源、異源多倍體獲得的途徑之一，它不僅能克服遠緣雜交有性不親和障礙，也可克服傳統(tǒng)的通過有性雜交誘導(dǎo)多倍體植株的麻煩，最終將野生種的遠緣基因?qū)朐耘喾N中，原生質(zhì)體融合技術(shù)可望成為作物改良的有力工具之一。2.原生質(zhì)體可攝入外源DNA，細胞器、細菌或病毒顆粒，這些特性與植物全能性相結(jié)合為高等植物的遺傳飾變打下基礎(chǔ)。3.獲得細胞無性系和選育突變體的優(yōu)良起始材料。三、實驗

4、儀器與材料1.材料：油菜葉子、白菜花2.溶液或試劑：（1）洗滌液：甘露醇0.7mol/L，CaCl2·2H2O 3.5mmol/L, KH2PO4 0.7mmol/L(pH 5.6)，高壓滅菌；（2）混合酶液：1.5纖維素酶，1果膠酶溶于洗滌液中(pH 5.6)。（3）50%PEG（4）高pH高鈣稀釋液：（5）20%蔗糖溶液（6）DPD培養(yǎng)基：3.儀器或其他用具：超凈工作臺、滅菌鍋、顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、鑷子、解剖刀、剪子、 接種針、鋁飯盒、錫箔紙、記號筆、橡皮筋、試劑瓶、三角瓶移液管、培養(yǎng)皿、酒精燈等。四、實驗步驟(一)原生質(zhì)體的制備:1取材：取新鮮油菜葉和白菜花瓣自來水洗凈，再用7

5、0%乙醇浸泡30S，0.5次氯酸鈉消毒10min,無菌水沖洗5次.2酶解: 材料切成1mm寬細絲,加入適量酶液,置搖床上（6070rpm），在2528黑暗條件下，酶解57h. 3分離: 用200目網(wǎng)過濾除去未完全消化的殘渣,在1000rpm條件下離心5分鐘，棄上清。加入3 4ml 洗滌液，相同條件下離心2-5分鐘，棄上清，留1ml洗液。用滴管將混有原生質(zhì)體的1ml洗液吸出，輕輕鋪于20蔗糖溶液上(5ml離心管裝3m1 20蔗糖溶液)，在1000rpm條件下離心510分鐘，由于密度梯度離心的作用，生活力強狀態(tài)好的原生質(zhì)體漂浮在20的蔗糖與洗滌液之間，破碎的細胞殘渣沉入管底。用200l移液器輕輕將

6、狀態(tài)好的原生質(zhì)體吸出(注意盡可能不要吸入下層的蔗糖溶液)，放入另一干凈的離心管中，加4ml洗滌液，1000rpm離心2-5分鐘，棄上清(二)原生質(zhì)體融合:1將原生質(zhì)體用 DPD調(diào)節(jié)濃度為1×105個/mL。2將原生質(zhì)體混合物滴入小培養(yǎng)皿，靜置810分鐘。3然后滴入50的PEG溶液，靜置2分鐘。4依次間隔5分鐘加入0.5ml、1 ml和2 ml高鈣高pH洗滌液。注意在第二、三次洗液加入前，用移液器輕輕吸走部分溶液，但不能吸干，否則原生質(zhì)體破碎死亡；最后用液體培養(yǎng)基洗l2次。制片，鏡檢。五、實驗報告 畫出觀察到的融合細胞，并計算融合率。六、思考題 1.你認為要獲得數(shù)量多、生活力強的原生質(zhì)

7、體,在實驗中應(yīng)注意那些問題? 增多數(shù)量的方法：多取材且盡量切碎，增加酶濃度，提高酶解溫度，延長酶解時間，操作輕柔，勿使原生質(zhì)體破碎等。提高生活力的方法：取新鮮材料，采用合適的酶濃度、作用溫度和時間等。 2.舉例說明原生質(zhì)體融合的應(yīng)用價值。實驗二 動物細胞原代培養(yǎng)實驗項目類型：基礎(chǔ)性所屬課程名稱：細胞生物學(xué)實驗計劃學(xué)時：4學(xué)時一、實驗?zāi)康?1.掌握動物細胞原代培養(yǎng)的基本方法和操作過程；2.熟悉原代培養(yǎng)細胞觀察方法。二、實驗原理用直接從機體獲取的細胞進行的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)是建立各種細胞系的第一步，該技術(shù)可以在體外進行各種類型細胞的增殖、遺傳、變異、分化和脫分化、惡變與去惡變等研究。分為組

8、織塊培養(yǎng)法和消化法兩種。三、實驗儀器與材料1.材料:小鼠心、肝、脾、腎等2.溶液或試劑：（1）RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清。（2）0.25胰蛋白酶、(pH 5.6)。（3）Hanks液3.儀器或其他用具：CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、高壓鍋、水浴鍋、解剖器械、培養(yǎng)瓶、微量加樣器、吸管、移液管、酒精燈、酒精棉球等。 四、實驗步驟 1.處死小鼠:將小鼠用頸椎脫臼法處死，放入75酒精種浸泡消毒。2.取材：在超凈工作臺中用滅菌的解剖器械剖開小鼠腹腔，辨認并取下肝臟、脾臟和腎臟，放入滅菌的培養(yǎng)皿中，加入Hanks液清洗，然后加入2mL胰蛋白酶液，研磨并過濾。3.將液體轉(zhuǎn)移到離心管，1200

9、rpm離心5min收集細胞，加入適量培養(yǎng)液，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.觀察：逐日在倒置鏡下觀察細胞生長情況。五、實驗報告 畫出細胞貼壁前和貼壁后的形態(tài)。六、思考題 試述細胞原代培養(yǎng)成功的條件?實驗三細胞傳代培養(yǎng)實驗項目類型：基礎(chǔ)性所屬課程名稱：細胞生物學(xué)實驗計劃學(xué)時：3學(xué)時一、實驗?zāi)康?1.熟練掌握貼壁細胞傳代的培養(yǎng)方法；2.觀察傳代細胞貼壁、生長、繁殖過程中細胞形態(tài)的變化。二、實驗原理離體培養(yǎng)的細胞群體增殖達到一定密度時，細胞的生長和分裂速度就會減慢甚至停止，如不及時分離傳代培養(yǎng)，細胞將逐漸衰老死亡。傳代培養(yǎng)是指細胞從一個培養(yǎng)瓶以1：2或其它比率轉(zhuǎn)移，接種到另一培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)。貼壁培養(yǎng)細胞的傳代通

10、常采用胰蛋白酶消化，把細胞分散成單細胞再傳代。 三、實驗儀器與材料1.材料：原代培養(yǎng)的小鼠細胞或Hela細胞2.溶液或試劑：（1）RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清。（2）0.25胰蛋白酶、(pH 5.6)。（3）Hanks液3.儀器或其他用具：CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、超凈工作臺、高壓鍋、水浴鍋、培養(yǎng)瓶、微量加樣器、吸管、移液管、酒精燈、酒精棉球等。四、實驗步驟 1將長成單層的細胞從二氧化碳培養(yǎng)箱中取出，在超凈工作臺中倒掉瓶內(nèi)的培養(yǎng)液，加入少許消化液。(以液面蓋住細胞為宜)，靜置510分鐘。2.在倒置鏡下觀察被消化的細胞，如果細胞變圓，相互之間不再連接成片，這時應(yīng)立即在超凈臺中將消化液倒掉，

11、加入35ml新鮮培養(yǎng)液，吹打，制成細胞懸液。3將細胞懸液吸出2ml左右，加到另一個培養(yǎng)瓶中并向每個瓶中分別加3ml左右培養(yǎng)液，蓋好瓶塞，送回二氧化碳培養(yǎng)箱中，繼續(xù)進行培養(yǎng)。五、實驗報告 分別畫出貼壁生長的小鼠細胞和Hela細胞,并說明二者的不同.六、思考題 寫出細胞傳代培養(yǎng)成功的條件?實驗四 植物細胞骨架的光學(xué)顯微鏡觀察實驗項目類型：基礎(chǔ)性所屬課程名稱：細胞生物學(xué)實驗計劃學(xué)時：3學(xué)時一、實驗?zāi)康?了解細胞骨架的結(jié)構(gòu)特征及其制備技術(shù)二、實驗原理細胞骨架是由蛋白質(zhì)絲組成的復(fù)雜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)其組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細胞形態(tài)的維持，細胞的生長、運動、分裂、分化，物質(zhì)運輸，

12、能量轉(zhuǎn)換，信息傳遞，基因表達等起到重要作用。用適當(dāng)濃度的Triton X-100處理細胞時，可將細胞質(zhì)膜和細胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)和全部脂質(zhì)溶解抽提，但細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)不受破壞而被保存，經(jīng)戊二醛固定，考馬斯亮藍R250染色或間接免疫熒光標(biāo)記以后，可在顯微鏡下觀察到細胞骨架結(jié)構(gòu)。三、實驗儀器與材料1.材料：洋蔥鱗莖和口腔上皮細胞2.溶液或試劑：（1）M-緩沖液（2）6mmol/L(pH 6.8)磷酸緩沖液（3）1Triton X-100（用M-緩沖液配制）（4）0.2考馬斯亮藍R250（5）3戊二醛3. 儀器或其他用具：光學(xué)顯微鏡、50ml燒杯、玻璃滴管、容量瓶、試劑瓶、載玻片、蓋玻片、鑷子、小剪刀

13、、吸水紙、擦鏡紙等。 四、實驗步驟 1.撕取洋蔥鱗葉內(nèi)表皮若干片，大小約1cm2，置于青霉素小瓶或小燒杯中。2.用磷酸緩沖液（PBS）浸泡片刻。3.吸去磷酸緩沖液，用1% TritonX-100處理20分鐘。抽提細胞骨架以外的蛋白質(zhì)，從而使骨架圖像更加清晰。4.吸去TritonX-100，用M-緩沖液洗3次，每次3分鐘。M-緩沖液有穩(wěn)定細胞骨架的作用。5.用3%戊二醛固定15-20分鐘6.用PBS洗3次，每次3分鐘7.考馬斯亮藍染色15分鐘8.蒸餾水洗2次9.置于載玻片上，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀察。五、實驗報告 繪出植物細胞骨架微絲結(jié)構(gòu)圖。六、思考題 說出各步驟的目的和一些重要試劑的在此

14、處的作用。實驗五 細胞凋亡的誘導(dǎo)、觀察與檢測實驗項目類型：創(chuàng)新設(shè)計性實驗所屬課程名稱：細胞生物學(xué)實驗計劃學(xué)時：9學(xué)時一、實驗?zāi)康?1.了解細胞凋亡的概念和原理；2.掌握細胞凋亡誘導(dǎo)的方法；3.認識細胞凋亡的特征。二、實驗原理人體內(nèi)的細胞注定是要死亡的，目前人們已經(jīng)知道細胞的死亡起碼有兩種方式，即細胞壞死與細胞凋亡。壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞無序變化的死亡過程。表現(xiàn)為細胞脹大，胞膜破裂，細胞內(nèi)容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充分，引起局部嚴重的炎癥反應(yīng)。凋亡是細胞受到內(nèi)、外因子刺激后發(fā)生的由基因調(diào)控的生理性死亡行為。其細胞及組織的變化與壞死明顯不同。細胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化：首先

15、細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離，然后胞質(zhì)密度增加，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解，胞膜形成小泡，最終為為幾個凋亡小體，無內(nèi)容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。凋亡細胞DNA的有控降解是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用的結(jié)果，該酶在核小體連接部位切斷染色體DNA，這種降解表現(xiàn)在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖譜。三、實驗儀器與材料1.雞血細胞2.溶液或試劑：生理鹽水，20mmol/LCaCl2 順鉑，姬姆薩染色劑， Tris.HCl,SDS, EDTA, 乙醇，甲醇，蛋白酶K。3.儀器或其他用具：超凈工作臺

16、、滅菌鍋、顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、鑷子、解剖刀、剪子、 接種針、鋁飯盒、錫箔紙、記號筆、橡皮筋、試劑瓶、三角瓶移液管、培養(yǎng)皿、酒精燈等。四、實驗步驟 (一)細胞凋亡的誘導(dǎo)：1.采雞血10ml，加0.85%的生理鹽水混勻，1200r/min離心5min，棄上清液（重復(fù)三次），制備紅細胞懸液，然后加入50ml血細胞保存液混勻放于4冰箱中備用。.取4個試管，各加入雞血細胞保存液2ml，在1號管中加入2ml 生理鹽水作為陰性對照，2號試管加入2ml 10ug/ml的順鉑溶液作為陽性對照；3號試管中加入2ml 20mmol/L的CaCl2溶液進行脅迫處理；4號試管不加任何物質(zhì)，實驗時煮沸5 min 使細胞壞

17、死。（二）細胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察：1處理4h 取樣，用生理鹽水稀釋5倍，各取50ul細胞懸液均勻涂布于5片載玻片上，晾干。2用甲醇固定2min，然后在載玻片上滴加適量姬姆薩染液染色10min。3用蒸餾水輕輕洗去染液，室溫晾干，在光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化。4照相，并對試驗組細胞進行凋亡計數(shù)統(tǒng)計。（三）DNA 梯狀條帶的檢測：1離心收集雞血細胞，棄上清。2加入1ml的細胞裂解緩沖液重懸，轉(zhuǎn)入1.5ml 離心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20l，混勻。3在65恒溫水浴鍋中水浴30min（也可轉(zhuǎn)入37水浴1224h），間歇振蕩離心管數(shù)次。4于臺式離心機以12000 rpm離心5min，取上

18、清液入另一離心管中。5加2倍體積異丙醇，倒轉(zhuǎn)混勻后，可以看見絲狀物，用100ul 吸頭挑出，或12,000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘,棄上清,晾干6用50ulTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，并加入RNase A(10ug/ul)5ul，于37保溫1015分鐘。71.2 %瓊脂糖凝膠，75 V電壓，電泳45 min 左右，8紫外燈下觀察并照相。（瓊脂糖凝膠電泳：稱取1.2克瓊脂糖加入100ml 1×TBE),加熱使之溶解,取一個凝膠模子,兩端用膠布封好,水平放置.將制孔器(即梳子)放在模子一側(cè)約0.5cm處,其底部距模子約1mm.待瓊脂冷至約70時,加入10ul 0.5mg/ml EB,混勻,

19、倒入模子,待冷卻凝固后,取下梳子,撕去兩端膠布,放入電泳槽中,使有加樣孔的一端放在負極一端.在電泳槽中加入1×TBE至超過凝膠表面約1mm. 加入DNA電泳樣：1.5ul DNA (DNA ladder)+3.5ul ddH2O+1ul buffer。打開電源,使電壓為10V/cm凝膠.當(dāng)溴酚藍走到凝膠的3/4處,停止電泳.紫外燈下檢測電泳的情況。）五、實驗報告 畫出凋亡細胞與壞死的形態(tài)。六、思考題 列舉3種以上檢測細胞凋亡的方法。實驗六環(huán)境因素誘變?nèi)旧w改組的觀察實驗項目類型：設(shè)計性所屬課程名稱：細胞生物學(xué)實驗計劃學(xué)時：7學(xué)時一、實驗?zāi)康?1學(xué)會鑒別外界條件誘變?nèi)旧w改組的各種類型

20、，為進行環(huán)境監(jiān)測和誘變育種提供細胞學(xué)方面的依據(jù)。2使大家認識到生活中的各種有害因素，提高自我保護和環(huán)保意識。二、實驗原理目前，由于大量新的化合物的合成，原子能的應(yīng)用，各種各樣工業(yè)廢物的排放等都存在污染環(huán)境的可能。欲了解這些因素對機體潛在的遺傳危害，就需要一套高度靈敏，技術(shù)簡單易行的系統(tǒng)來監(jiān)測環(huán)境的變化。而生物監(jiān)測技術(shù)是目前進行環(huán)境污染，化學(xué)誘變物質(zhì)以及輻射對機體損傷程度監(jiān)測的一個主要指標(biāo)。同時，它也為進行輻射防護、新藥試驗、食品添加劑的安全評價，以及染色體遺傳疾病和癌癥前期診斷等各個方面提供了很好的手段。 用于進行環(huán)境因素、誘變物質(zhì)、輻射損傷的生物檢測方法包括染色體畸變類型的檢測和微核的檢測等

21、。常用于測試的材料有鴨跖草、水蔥花、韭菜花等的花穗，以及蠶豆根尖和小白鼠等。一般來說，處于分裂過程的細胞，對環(huán)境因素最敏感，尤其是處于減數(shù)分裂時期的花粉母細胞。誘變物質(zhì)、環(huán)境污染及輻射對人類和其它高等生物的遺傳損傷，在細胞水平表現(xiàn)為染色體畸變，遺傳損傷不僅表現(xiàn)在體細胞，而且也通過生殖細胞擴散和積累。三、實驗儀器與材料1.材料：大蔥花或大蔥根尖2.溶液或試劑：（1）無水乙醇（2）鹽酸（3）甲醇（4）冰醋酸（5）改良苯酚品紅染色液3.儀器或其他用具：顯微鏡、解剖針、酒精燈、載玻片、蓋玻片、吸水紙等。 四、實驗步驟 1取材：選取處于減數(shù)分裂期的花穗剪下15-20cm的花序，或取旺盛分裂的根尖，部分插

22、在自來水中作對照，另一部分插在污水中，處理1224h，再移到自來水中恢復(fù)培養(yǎng)24h。2固定：用卡諾氏固定液固定12h，經(jīng)95%、85%乙醇各30min，70%乙醇4保存。3制片：剝?nèi)』ㄋ?，用鑷子輕輕搗碎，或?qū)⒏馑峤?0分鐘后壓片，用改良苯酚品紅染色510min ，去掉殘渣，蓋上蓋玻片。4鏡檢：用低倍鏡找到分裂期細胞，再轉(zhuǎn)用高倍鏡，可看到經(jīng)污水處理過的細胞中，染色體畸變的類型和微核的數(shù)目，分別要比對照組高。微核出現(xiàn)的多少，可作為監(jiān)測環(huán)境污染程度的指標(biāo)。五、實驗報告 畫出觀察到的微核和染色體畸變類型并計算染色體畸變率。六、思考題 列舉生活環(huán)境中可以導(dǎo)致染色體畸變的因素.實驗七、膜蛋白質(zhì)的分離與鑒

23、定實驗項目類型：綜合性所屬課程名稱：細胞生物學(xué)實驗計劃學(xué)時：8學(xué)時實驗?zāi)康?掌握血影膜的制備及膜蛋白質(zhì)的電泳分離技術(shù)。2了解以上實驗技術(shù)的原理和意義。實驗用品一、儀器超速離心機、平板式電泳架電泳儀移液器離心管注射器、長針頭注射器(50m1)、水浴鍋、微量注射器(100l)、parafilm 紙封、各類吸管、量筒、燒杯等。二、試劑及樣品備制1PBS(phosphafe buHer saline)5 mmolL Na2HP04 (Mw142)5 mmo1L NaH2P04 (Mw=140)145 mmo1L NaCl (Mw=58.5)pH7.62磷酸鹽緩沖液(pH7.6)Na2HpO4 5 mm

24、o1LNaH2P04 5mmo1L3.solution A (Acrylamide Stock Solution),100ml30%(w/v) acrylamide,0.8%(w/v) bis-acrylamideCaution: Unpolymerized acrylamide is a skin irritant and a neurotoxin.Always handle with gloves.See Safety Notes.Add distilled water to make 100ml and stir until completely dissolved .Work unde

25、r hood and keep acrylamide solution covered with Parafilm until acrylamide powder is completely dissolved.Can be stored for months in the refrigerator.4.Solution B (4× Separating Gel Buffer),100mla.75ml 2M Tris-HCL (pH8.8) 1.5Mb.4ml 10%SDS 0.4%c.46ml H2OStable for month in the refrigerator.5.So

26、lution C(4× Separating Gel Buffer),100mla.50ml 1M Tris-HCL(Ph 6.8) 0.5Mb.4ml 10% SDS 0.4%c.46ml H2OStable for months in the refrigerator.6.10% ammonium persulfate ,5mlb.5ml H2OStable for months in a capped tube in the refrigerator.7.Electrophoresis Buffer ,1 liter (2L)a.3g Tris 25mMc.1g SDS 0.1

27、%d.H2O to make 1 LpH should be approximately 8.3.Can also make a 10× stock solution.Stable indefinitely at room temperature.8.5× Sample Buffer ,10mlb.5ml 50% glycerol 25%c.2ml 10% SDS 2%e.1ml 1% bromophenol blue 0.1%2OStable for weeks in the refrigerator or for months at -20.9.Calculation

28、for X% Separating GelSolution A x/3mlSolutionB 2.5mlH2O (7.5-x/3)ml10% Ammonium Persulfate 50ulTEMED 5ul(10ul if x<8%)Total Volume 10ml10.Example of Stacking Gel PreparationTwo 5% Stacking Gels(6×8cm×0.75mm),4ml2.3mlH2O0.67ml Solution A1.Oml Solution C 30ul 10% Ammonium Persulfate5ul TE

29、MED11染色液0.04 Comassie brilliant blue R25010HAC25Isopropl alcohol12脫色液7.5 HAC5 MeOH實驗方法一、血影膜制備方法實驗步驟：1取全血5ml 置入離心管中；2加入1ml的磷酸鹽緩沖液(PBS)，再以1 000rmin 離心5min，溫度為4；3離心后呈現(xiàn)圖左所示：棄去上清液和中間的一層淡黃色帽狀物(bully coat)，在上清液中主要包括血清和PBS 成份，帽狀物中包括白細胞和血小板等，只留下最下層的壓積的紅細胞(packed RBC)；4再重復(fù)以上l2 次，洗滌被壓積的紅細胞；5洗滌后，去上清液，只留下被濃縮的RBC

30、 部份；6加入15(20 倍的的磷酸鹽緩沖液，并將其與RBC 混合均勻，在常溫下(20)靜置 2025min 進行低滲處理，然后置入高速離心機內(nèi)(4)以10 00015 000rmin 離心1520min。7離心后呈圖左所示:棄上清液和最下層的一塊粉紅色紐狀沉淀，這時在上清液中主要包括PBS 和血紅蛋白，在最下層的鈕扣狀沉淀中含有大量的蛋白酶，要清除干凈，否則會影響以后的電泳結(jié)果，只留下中間的一層血影膜。8將團塊狀的沉淀，重復(fù)(按6)洗滌12 次，直至血影膜呈乳白色，去上清液后，即為所制備的樣品。二、樣品的電泳分離1制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠（1）配制9%分離膠（15ml）：雙蒸水6.55ml

31、，1.5M Tris-HCl（pH8.8）3.75ml，30%丙烯酰胺儲存液（Acry/Bis）4.5ml，10%SDS 150ml，10%過硫酸銨（APS）50ml，混勻后加入3.75ml TEMED，立即混勻，灌入裝好的垂直板中，至距離短玻璃頂端約2cm處。檢查是否有氣泡，如果有，用濾紙條吸出。在膠液上面加一層雙蒸水，靜置，待凝膠與水的界面清晰時，說明分離膠已聚合（約30分鐘），去除水相，用濾紙吸干殘存的液體。（2）配制4%濃縮膠（10ml）：雙蒸水6.1ml，0.5M Tris-HCl（pH6.8）2.5ml，30%丙烯酰胺儲存液（Acry/Bis）1.3ml，10%SDS 100ml，

32、10%過硫酸銨（APS）50ml，混勻后加入10ml TEMED，立即混勻，灌入垂直板中至短玻璃頂端，插入梳子，避免產(chǎn)生氣泡，靜置，約60分鐘后，膠聚合，拔去梳子，用電極緩沖液沖洗加樣孔，以去除未聚合的丙烯酰胺。（3）將凝膠固定在電泳槽中，上下槽各加入1´Tris-甘氨酸電泳緩沖液，驅(qū)除兩玻璃板間凝膠底部的氣泡。樣品處理及上樣：在Ependorf管中加入蛋白提取液16ml，5×上樣緩沖液4ml，充分混勻，與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)一起放在100°C沸水中煮5分鐘后，用微量加樣器上樣。為了便于比較蛋白電泳結(jié)果和免疫印跡結(jié)果，采取對稱加樣。將電泳裝置接通電源。開始電泳時，電壓為80V，當(dāng)樣品進入分離膠后，將電壓調(diào)到150V。繼續(xù)電泳至樣品前沿抵達分離膠底部，斷開電源。采用平板電泳，將膠用注射器注入電泳管或平板腔內(nèi)，使膠液高度為110mm 左右，如發(fā)現(xiàn)膠液內(nèi)留有氣泡