SNP檢測(cè)方法(講課版)1

1、1SNPs的檢測(cè)方法 唐敏2005.8.122主要內(nèi)容nSNPs的定義nSNPs的研究意義nSNPs的研究進(jìn)展和方向nSNPs的檢測(cè)方法3SNPs的定義定義：?jiǎn)魏塑账岫鄳B(tài)性 ( single nucleotide polymorphisms ,SNPs) 主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列序列多態(tài)性多態(tài)性。 (99.9%)4SNPs的研究意義1. SNPs作為第三代遺傳標(biāo)記（已知性、可遺傳性、可檢測(cè)性），用于疾病基因的定位、克隆和鑒定。_路標(biāo)的作用傳統(tǒng)研究策略（表征、蛋白、基因）逆向遺傳學(xué)（表型、基因、蛋白），52.基因多態(tài)性研究 研究SNPs本身對(duì)機(jī)體的影響（生理特征

2、、病理?xiàng)l件下的千差萬(wàn)別） 6SNPs研究進(jìn)展和方向1. SNPs數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)2. SNPs功能的研究（在1的基礎(chǔ)上）7SNPs檢測(cè)方法1.理想的檢測(cè)SNPs的方法 發(fā)現(xiàn)未知的SNPs，或檢測(cè)已知的SNPs(1) 靈敏度和準(zhǔn)確度的要求（反應(yīng)原理嚴(yán)緊）(2) 快速、簡(jiǎn)便、高通量 (操作和分析的自動(dòng)化程度高） (3) 費(fèi)用相對(duì)低廉82.現(xiàn)狀： 到現(xiàn)在還沒有一個(gè)符合以上條件的理想方法出現(xiàn),但根據(jù)實(shí)際情況,可以選擇出較合適方法。93.每種SNPs的檢測(cè)方法都可將之看成由 區(qū)分SNPs特異位點(diǎn)的原理方法 和 數(shù)據(jù)的檢測(cè)分析手段 兩部分組成。10SNPs檢測(cè)方法的分類一、區(qū)分一、區(qū)分SNPs 位點(diǎn)的位點(diǎn)

3、的方法方法 1.基于雜交的方法 2.基于酶的方法 3.以構(gòu)象為基礎(chǔ)的方法 4.直接測(cè)序的方法二、檢測(cè)分析技術(shù)二、檢測(cè)分析技術(shù) 1.凝膠分析技術(shù) 2.熒光檢測(cè)技術(shù) 3. DNA 芯片 4.質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù) 111.基于雜交的方法基于雜交的方法n原理: 短的核苷酸探針在和互補(bǔ)的目的片段進(jìn)行雜交時(shí)，完全匹配和有錯(cuò)配兩種情況下，根據(jù)雜交復(fù)合體穩(wěn)定性的不同而將SNPs 位點(diǎn)檢測(cè)出來(lái)。 （差異越大，檢測(cè)的特異性就越好）121）利用Tmn固定溫度 等位基因特異核苷酸探針 (Allele-specific oligonucleotide ，ASO) 。 修飾過的探針：引入一個(gè)錯(cuò)配的堿基、 PNA、 LNAs 等n

4、 動(dòng)態(tài)的加熱過程 動(dòng)態(tài)等位基因特異雜交 (dynamic allele-specific hybridization, DASH) 13核酸肽探針（Peptide nucleic acids，PNA)n其骨架是肽鍵n特點(diǎn)：1、與靶分子高特異性地結(jié)合（3個(gè)方面的影響）2、鏈擠入 （形成三鏈復(fù)合結(jié)構(gòu)）（表達(dá)調(diào)控以及反義治療方面）3、對(duì)核酸酶和蛋白酶均不敏感（體外應(yīng)用）141、與靶分子高特異性地結(jié)合nTm值高n受鹽濃度影響?。ǖ望}濃度的體系）nTm更大（一個(gè)PNA堿基的錯(cuò)配會(huì)使其Tm值降低8-20度）所以，PNA/DNA的非特異結(jié)合能得到很好的排除。15 LNA(locked nucleic aci

5、ds) n其結(jié)構(gòu)是在RNA分子的2羥基和核糖環(huán)的4碳原子間連入一個(gè)亞甲基的“橋”。n特點(diǎn)： 1.能以很高的親和性和互補(bǔ)的DNA、RNA 或LNA 結(jié)合（構(gòu)象更利于雜交的穩(wěn)定） 2.匹配和不匹配的Tm增加16DASH(dynamic allele-specific hybridization）172）雜交+熒光共振分子信標(biāo)（雙分子間雜交） 蝎狀探針（分子內(nèi)雜交）18分子信標(biāo)（Molecular beacons）19蝎狀探針 （Scorpion primer） 202.基于酶的方法基于酶的方法1）DNA聚合酶2）連接酶3）限制性內(nèi)切酶4）外切酶FEN5）RNase H211）DNA聚合酶n等位基因

6、特異性PCRn多重等位基因特異性PCRnTaqman法n引物延伸法n焦磷酸測(cè)序法22等位基因特異性PCR23Taqman 法24微測(cè)序法/引物延伸法25基本步驟（液相）1.設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增含SNPs位點(diǎn)的一段DNA2.對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化（去除引物和dNTP)3.引物延伸4.延伸產(chǎn)物檢測(cè)（ 放射性同位素標(biāo)記法、發(fā)光檢測(cè)法、凝膠為基礎(chǔ)的熒光檢測(cè)法、 質(zhì)譜分析法、變性高壓液相色譜法等）26APEX (arrayed primer extension)固相27焦磷酸測(cè)序法(Pyrosequencing )nDNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶(ATP sulfurylase) 、熒光素酶(lucifera

7、se) 和三磷酸腺苷雙磷酸酶( apyrase) 。n原理：DNA 聚合酶在一種dNTP的存在下進(jìn)行引物延伸反應(yīng),而引物的成功延伸將伴隨焦磷酸的釋放,焦磷酸在熒光素酶的存在下能引一種發(fā)化學(xué)發(fā)光反應(yīng),通過發(fā)光計(jì)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)來(lái)達(dá)到檢測(cè)的目的。28基本步驟1. 1.測(cè)序引物和DNA模板雜交（PCR擴(kuò)增的、單鏈的），與酶和底物孵育。2.2.四種dNTP（dATPS，dTTP，dCTP，dGTP）之一被加入反應(yīng)體系，如與模板配對(duì)，與引物的末端形成共價(jià)鍵，dNTP的焦磷酸基團(tuán)（PPi）釋放出來(lái)。3.一系列的酶學(xué)反應(yīng)，發(fā)出可見光信號(hào)。每個(gè)光信號(hào)的峰高與反應(yīng)中摻入的核苷酸數(shù)目成正比。4. 4. ATP和未摻入的dNTP由三磷酸腺苷雙磷酸酶降解，淬滅光信號(hào)，并再生反應(yīng)體系。5.然后加入