PCR法突變體質(zhì)粒構(gòu)建

1、PCRPCR法法突變質(zhì)粒構(gòu)建突變質(zhì)粒構(gòu)建 PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)的PCRPCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系4種dNTP混合物 各200umol/L引物 各10100pmol模板DNA 0. .12ugTaq DNA聚合酶 2. .5uMg2+ 1. .5mmol/L1234522557294時間（min）溫度（）PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)

2、1234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴(kuò)增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性子鏈延伸DNA加倍DNA變性形成2條單鏈模板DNA95PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)9550引物1引物2DNA引物PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)72第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)955072TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR

3、過程PCR的特點(diǎn)72第2輪結(jié)束PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)模板DNA第1輪擴(kuò)增第2輪擴(kuò)增第3輪擴(kuò)增第4輪擴(kuò)增第5輪擴(kuò)增第6輪擴(kuò)增PCR的基本原理PCR反應(yīng)條件PCR過程PCR的特點(diǎn)靈敏度高1.皮克(pg=10-12)量級擴(kuò)增到微克(ug=10-6)水平2. 能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞3.病毒檢測的靈敏度可達(dá)3個RFU4.細(xì)菌檢測的最小檢出率為3個細(xì)菌簡便、快速1.一次性加好反應(yīng)液，24 小時完成擴(kuò)增2.擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析對標(biāo)本的純度要求低u血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等組織的粗提DNA3PCR的類型和應(yīng)用 研究基因克隆，DNA測序，分析突變 診斷

4、細(xì)菌、病毒、寄生蟲檢測，診斷 人類基因組工程遺傳圖譜的構(gòu)建，DNA測序，表達(dá)圖譜 法醫(yī)犯罪現(xiàn)場標(biāo)本分析 腫瘤各種腫瘤檢測 其他3實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理雙酶切雙酶切連接實(shí)驗(yàn)原理Xho I/BamH IXho I/BamH I引物引物1和和4分別帶分別帶有有Xho I/BamH I轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 Amp平板篩選無菌落挑取單菌落擴(kuò)增質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)原理酶切驗(yàn)證引物1：5-CCG CTC GAG CCA GGA GGA ACA CGA GA-3引物2：5- GTAGAGAATGAATTCAGAGTCCTG -3引物3：5- CAGGACTCTGAATTCATTCTCTAC-3引物4：5-CGC GGA TCC

5、CAG CAT AGG AAG GGA GAC -3引物設(shè)計(jì)思考題：1. 酶切位點(diǎn)怎樣選擇？2. 選擇雙酶切有什么優(yōu)點(diǎn)？3. 為什么要設(shè)計(jì)保護(hù)堿基？4. 載體的Amp抗性有什么作用？Xho BamH EcoR 預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論圖1：產(chǎn)物I 電泳圖2：產(chǎn)物II 電泳圖3：產(chǎn)物I 回收圖4：產(chǎn)物II 回收思考題：圖1下方比較模糊的條帶成因？446bp314bp預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論圖5：全長片段電泳圖6：全長片段電泳回收圖8：載體酶切電泳圖9：載體酶切電泳回收圖7：全長片段酶切醇沉回收736bp思考題：1. 電泳膠濃度及marker選擇原則？736bp圖10：小提質(zhì)粒1-3：不同單克隆4： EcoR14 marker5-8：不同單克隆13246578圖11：BamHI/XhoI酶切驗(yàn)證1-7不同單克隆酶切8. DL2000 marker12345678736bp 預(yù)期實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論思考題：1. 質(zhì)粒電泳為什么有多條帶？2. 圖11未切出片段可能原因？圖12：EcoRI單酶切陽性結(jié)果1-2. 單克隆1酶切3-4. 單克隆3酶切5. DL2000 marker12345245bp 預(yù)期實(shí)