流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償問題

1、 1.熒光素為什么會(huì)出現(xiàn)熒光？ 2.檢測前為什么需要進(jìn)行熒光補(bǔ)償？ 3.熒光補(bǔ)償?shù)姆椒ㄓ心男?4.熒光補(bǔ)償?shù)脑瓌t是什么？熒光發(fā)生的機(jī)理 室溫下熒光素分子大部分處于“基態(tài)”，當(dāng)熒光素在一定波長（激發(fā)波長）的光的照射下吸收光能后（經(jīng)染色后的細(xì)胞在激光束的照射下），熒光染料吸收能量能級(jí)躍遷，進(jìn)入新的狀態(tài)，稱為“激發(fā)態(tài)”，處于激發(fā)態(tài)的分子極不穩(wěn)定，它可以通過在10-910-7秒的極短時(shí)間內(nèi)以發(fā)射一定波長的光量子的方式釋放所吸收的能量從而返回到基態(tài)。這一過程稱為熒光發(fā)射，也就是發(fā)光。熒光素的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜任何發(fā)熒光的物質(zhì)分子都具有這兩個(gè)特征光譜 激發(fā)光譜（Excitation，Ex）： 是指能特異

2、性地激發(fā)某種熒光素的一定波長范圍內(nèi)的光線，也稱為吸收光譜。 吸收波峰（最大吸收波長）：Ex-Max 發(fā)射光譜（Emission）： 是指某一波長激發(fā)光引起熒光素發(fā)射的一定波長范圍內(nèi)的熒光。 發(fā)射波峰（最大發(fā)射波長）：Em-Max發(fā)射波峰-最大發(fā)射波長FITC-異硫氰酸熒光素異硫氰酸熒光素PE-藻紅蛋白藻紅蛋白PE-Cy5-藻紅蛋白偶聯(lián)物藻紅蛋白偶聯(lián)物熒光染色對(duì)照的設(shè)置 陰性對(duì)照 空白對(duì)照（自發(fā)熒光） 同型（ISO)對(duì)照（自發(fā)熒光非特異熒光）實(shí)驗(yàn)樣本（特異熒光自發(fā)熒光）熒光染料平均熒光強(qiáng)度比較熒光染料平均熒光強(qiáng)度比較 PerCP APC FITC ECD PC5 PE同型對(duì)照的選擇與實(shí)驗(yàn)染色的單

3、克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型；與染色的單克隆抗體 相同種屬來源 相同免疫球蛋白及亞型 相同熒光素標(biāo)記 相同劑量和濃度分析類型管功能 加入的抗體單色分析1Isotype1-FITC2Sample1,2A-FITC雙色分析1Isotype1-FITC2a-PE2Compensation1A-FITC2a-PE3Compensation21-FITCB-PE4Sample1,2A-FITCB-PE三色分析1Isotype1-FITC2a-PE1-PC52Compensation1A-FITC2a-PE1- PC53Compensation21-FITCB-PE1- PC54Compensati

4、on31-FITC2a-PEC-PC55Sample1,2A-FITCB-PEC-PC5四色分析1Isotype1-FITC2a-PE1-ECD1- PC52Compensation1A-FITC2a-PE1- ECD1- PC53Compensation21-FITCB-PE1- ECD1- PC54Compensation31-FITC2a-PEC- ECD1- PC55Compensation41-FITC2a-PE1- ECDD-PC56Sample1,2A-FITCB-PEC-ECDD-PC5熒光補(bǔ)償（compensation）定義：指在流式細(xì)胞多色分析中，糾正熒光素發(fā)射光譜重疊（s

5、pectral overlap）的過程，即從一個(gè)被檢測的熒光信號(hào)中去除任何其他的干擾熒光信號(hào)。 補(bǔ)償方法手動(dòng)補(bǔ)償自動(dòng)補(bǔ)償（flow-set)無論手動(dòng)或自動(dòng)補(bǔ)償都需將單種熒光素標(biāo)記的單克隆抗體分別進(jìn)行單色熒光染色即幾色分析就需要制備幾個(gè)補(bǔ)償對(duì)照管現(xiàn)舉例進(jìn)行FITC、PE、PC5三色手動(dòng)補(bǔ)償1.準(zhǔn)備ISO（陰性對(duì)照管）； IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PC52.通過調(diào)節(jié)電壓，使陰性群體落在雙陰性區(qū)域； FITC與PE、FITC與PC5、PE與PC5FITC FITC與PE PE3.上單染管(CD3-PC5、CD4-FITC、CD8-PE)，準(zhǔn)備補(bǔ)償；（注：保持電壓絕對(duì)不變；開始補(bǔ)償前，將原補(bǔ)償全部歸零；）調(diào)節(jié)補(bǔ)償原則 橫平豎直 即X-mean或Y-mean相等雙色熒雙色熒光補(bǔ)償光補(bǔ)償1雙色熒雙色熒光補(bǔ)償光補(bǔ)償2 雙陰雙陽單陽CD3