獸醫(yī)生物制品作業(yè)

1、 免疫佐劑及其研究進展摘要： 免疫佐劑是指與抗原同時或預(yù)先應(yīng)用，能增強機體針對抗原的免疫應(yīng)答能力或改變免疫反應(yīng)類型的物質(zhì)。1925年，法國獸醫(yī)免疫學(xué)家Ramon首先觀察到在疫苗中加入某些與之無關(guān)的物質(zhì)可以特異地增強機體抵抗反應(yīng)。1926年，Glenny最先將鋁化合物作為免疫佐劑應(yīng)用于白喉外毒素疫苗。1951年，F(xiàn)reund將液體石蠟與羊毛脂（乳化劑）按一定比例混合后，加入抗原研制成油包水的乳膠，免疫動物后效果極佳，可產(chǎn)生高效而持久的抗體。1956年，Johnson發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性細菌的內(nèi)毒素具有佐劑活性。此后, 許多國家都不同程度地開展了這方面的研究。 目前正在開發(fā)的新型疫苗有合成肽疫苗、基因工

2、程疫苗、核酸疫苗、轉(zhuǎn)基因植物口服疫苗等，這些新型疫苗具有良好的抗原特異性和低毒性。但由于其抗原分子小，純化程度高，疫苗的免疫原性較差，所以需要安全有效的佐劑來增強疫苗的效力。近年來佐劑的發(fā)展迅猛，多種新型佐劑層出不窮，人們對佐劑的作用機理亦有更深入的認識。關(guān)鍵詞：佐劑；免疫應(yīng)答反應(yīng)；疫苗；免疫原性1 免疫佐劑作用機理Cox 等提出佐劑增強免疫應(yīng)答5種可能的機制：免疫調(diào)節(jié)，抗原提呈，誘導(dǎo)CTL，靶向傳遞和抗原儲存。佐劑增強免疫應(yīng)答的機制尚未完全闡明，其作用機制包括：在接種部位形成抗原貯存庫，使抗原緩慢釋放，延長抗原在局部組織內(nèi)的滯留時間，較長時間使抗原與免疫細胞接觸并激發(fā)對抗原的應(yīng)答。增加抗原表

3、面積，提高抗原的免疫原性，輔助抗原暴露并將能刺激特異性免疫應(yīng)答的抗原表位遞呈給免疫細胞。促進局部的炎癥反應(yīng)，增強吞噬細胞的活性，促進免疫細胞的增殖與分化，誘導(dǎo)細胞因子的分泌。2 佐劑的種類2.1 鋁佐劑鋁作為疫苗佐劑已使用 70余年 ,它為疫苗的免疫效率等諸多方面問題的解決起到了重要的作用. 鋁佐劑的作用是在組織中形成抗原貯藏庫;產(chǎn)生顆粒性抗原來促進抗原提呈給免疫細胞 ;使抗原滯留 ,緩慢釋放 ,從而吸引活性淋巴細胞 ,激活補體系統(tǒng). 鋁佐劑是目前應(yīng)用最為廣泛的一類佐劑 ,已批準(zhǔn)的含鋁佐劑疫苗包括 DTP、 無細胞百日咳疫苗 DTP (DTaP)、 b型流感桿菌 (H I B)疫苗 (不是所有

4、的 )、 乙型肝炎 (HB)疫苗 ,以及所有的 DTaP、 HI B或 HB的聯(lián)合疫苗.還包括甲型肝炎疫苗、 萊姆病疫苗、 炭疽疫苗和狂犬病疫苗. 鋁佐劑的缺點是它不能誘導(dǎo)產(chǎn)生 Th1型反應(yīng) ,干擾細胞免疫 ,并阻斷 CD8 + CT L的激活 ,使得疫苗的免疫保護不全面 ,不持久 ,并且也有一些毒副作用.盡管不斷的有報告認為鋁佐劑由于其自身的缺陷可能會引起局部的不良反應(yīng). 但由于鋁佐劑的應(yīng)用已經(jīng)有具有幾十年的歷史 ,就安全性而言相對于其它的新型佐劑還是較為安全可靠的.2.2 油乳佐劑油乳佐劑中含有油和乳化劑, 它的作用機制是抗原包被在油相形成的微結(jié)構(gòu)內(nèi), 使之形成貯存庫而緩慢釋放, 刺激機體

5、免疫細胞產(chǎn)生抗體。油乳佐劑主要有弗氏佐劑、 佐劑 -65、 白油Span 佐劑、 MF -59 等。弗氏佐劑(Freunda djuvant, FA)分為弗氏完全佐劑(Freund complete adjuvant, FCA) 和弗氏不完全佐劑( Freundin complete adjuvant, FIA) 兩種。FIA 是由低黏度的礦物油及乳化劑組成的一種貯藏性佐劑; FCA 是在不完全佐劑的基礎(chǔ)上加一定量的分枝桿菌而成。FCA 是細胞免疫的強刺激劑, 而FIA 則僅能刺激體液免疫。FCA 和 FIA 主要不足之處: 可引起局部肉芽腫和無菌性膿腫; 使用礦物油佐劑的小鼠曾發(fā)生腫瘤, 因

6、此可能有致癌問題; 穩(wěn)定性差, 難以長期保存; 有對結(jié)核菌素致敏等毒副作用, 故僅限用于獸用。佐劑 -65 在體內(nèi)可被代謝或分泌, 用于人的流感疫苗安全有效, 但較弗氏佐劑效果稍差。白油 Span 佐劑是用輕質(zhì)礦物油作油相, 用 Span -80 或Span -85 及Tween -80 作為乳化劑制成的油乳佐劑, 是當(dāng)前獸醫(yī)生物制品中最常用、 最有效的佐劑之一。MF -59 為水包角沙鯊烯乳劑配方, 由角鯊烯、 Tween -80、 Span -85 等組成, 已廣泛用作于各種亞單位疫苗佐劑, 可增強體液免疫應(yīng)答和細胞免疫應(yīng)答, 副反應(yīng)輕微。油乳劑刺激局部產(chǎn)生肉芽腫或炎癥反應(yīng), 吸引巨噬細胞

7、等聚集, 這些細胞產(chǎn)生大量活性物質(zhì), 這些活性物質(zhì)又增強了體液免疫和細胞免疫。2.3 脂質(zhì)體 脂質(zhì)體是一類以提高抗原輸送和遞呈為主要作用的佐劑。脂質(zhì)體由磷脂和固醇類組成的含雙層脂質(zhì)分子的脂質(zhì)球，其表面為疏水性結(jié)構(gòu)，而內(nèi)部為親水性結(jié)構(gòu)。其主要優(yōu)點是脂質(zhì)體膜對細胞膜具有很好的親和性，容易將包被在脂質(zhì)體上或內(nèi)部的抗原(或編碼抗原的DNA)成分輸入到細胞內(nèi)。目前可以根據(jù)要求制備直徑不同的脂質(zhì)球，也可以根據(jù)抗原分子的理化特性將抗原分子包被在脂質(zhì)體的不同部位，如將含疏水性氨基酸較多的抗原插入脂雙層中，而將含親水性基團較多的抗原包裹在脂質(zhì)球的中間區(qū)。脂質(zhì)體疫苗可經(jīng)黏膜免疫。脂質(zhì)體膜與細胞膜的親和性，非常有利

8、于將包被的抗原遞呈給抗原遞呈細胞(Antigen presenting cells， APC)，并使抗原被溶酶體所降解，進而通過MHC和MHC途徑遞呈給免疫系統(tǒng)，同時激發(fā)細胞和體液免疫應(yīng)答反應(yīng)。脂質(zhì)體在制備過程中要求一定的技術(shù)性，其費用也較其他免疫佐劑高，目前對脂質(zhì)體的應(yīng)用研究還主要集中在醫(yī)學(xué)研究方面，在獸醫(yī)疫苗研究上的應(yīng)用前景還具有一定的不確定因素。 2.4 微生物來源佐劑 CpG DNACpG DNA是指一類序列中大部分以非甲基化胞嘧啶核苷酸和鳥嘌呤核苷酸(CpG)為基元的寡聚體?？杉せ頣細胞、B細胞、NK細胞等多種免疫效應(yīng)細胞，又稱為免疫刺激DNA序列(ISS)。CpG DNA主要存在于

9、細菌源性的DNA中，能促進B細胞增殖分化并分泌IL-6，從而誘導(dǎo)IgM的分泌，也可激活單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等抗原遞呈細胞，分泌多種細胞因子(如IL-12、IFN和TNF)，間接促進CTL和NK細胞的活性，從而誘導(dǎo)對細胞內(nèi)病原體產(chǎn)生細胞免疫。CpG DNA 能增強機體的特異性和非特異性免疫效應(yīng)。CpG DNA序列作為免疫佐劑有如下特點：與常用的氫氧化鋁佐劑具有協(xié)同作用，CpG DNA可以糾正氫氧化鋁誘導(dǎo)Th2類型應(yīng)答的缺點。一些不能與鋁混合的減毒活疫苗或多價疫苗則可單獨使用CpG DNA以增強其免疫原性。應(yīng)用范圍廣：CpG DNA作為疫苗佐劑，能增強雞蛋溶菌酶、卵白蛋白、腫瘤抗原、乙肝

10、疫苗和流感疫苗等抗原的免疫效果，能加強不同DNA疫苗的免疫反應(yīng)。CpG DNA的免疫佐劑作用在小鼠和靈長類中均已得到證實。據(jù)報道，目前CpG DNA作為人乙肝疫苗佐劑已進入臨床試驗。雖然CpG DNA具有安全、有效的優(yōu)點，但還是有許多問題有待解決，如它的免疫激活機制、免疫劑量（實驗表明，高劑量CpG DNA及重復(fù)給藥可能導(dǎo)致毒性效應(yīng)）和最適免疫途徑還需要進一步研究。2.5 免疫刺激復(fù)合物免疫刺激復(fù)合物( ISCOM) 是一種有較高免疫活性的脂質(zhì)小體,由極性抗原、植物皂甙(Quil A) 和膽固醇按1 1 1 的比例混合而成。它通過表面疏水作用將極性抗原分子和脂質(zhì)分子交聯(lián)成直徑約為35 nm 的

11、微粒,呈籠狀結(jié)構(gòu),類似膜表面抗原構(gòu)型。這種結(jié)構(gòu)既固化了抗原,又模擬了體內(nèi)識別抗原的微環(huán)境,從而增強抗原的黏附性和機體的吞噬作用,有利于和抗原遞呈細胞(APC) 膜相互作用,誘導(dǎo)輔助性T 細胞的克隆和細胞毒性T 淋巴細胞(CTL)的應(yīng)答。ISCOM 對細胞免疫和體液免疫都有增強作用,能誘導(dǎo)產(chǎn)生高效價抗體,且出現(xiàn)時間早,持續(xù)時間長, 誘導(dǎo)的特異性抗體多為IgG1 、IgG2a 、IgG2b 及IgG3 ; 提高MHC 分子在APC 中的表達,誘導(dǎo)產(chǎn)生IL221 、IL222 及IFN2。除了增強細胞免疫和體液免疫作用外, ISCOM 還具有黏膜免疫活性增強作用。存放和動物試驗結(jié)果表明ISCOMs

12、的穩(wěn)定性和免疫原性均優(yōu)于鋁佐劑疫苗。2.6 細胞因子佐劑 細胞因子是具有重要生物學(xué)活性的細胞調(diào)節(jié)蛋白，它包括淋巴因子和單核因子。細胞因子在許多動物模型系統(tǒng)中都是有效的免疫佐劑，能增強和保護機體免受病毒、細菌和寄生蟲的侵襲，對腫瘤免疫和臨床應(yīng)用也有增效作用。雖然大多數(shù)情況下細胞因子沒有FCA和皂苷有效，但它可用于人體，佐劑效率也有望得到改進。細胞因子作為免疫佐劑的研究主要集中在白細胞介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)及轉(zhuǎn)移生長因子(TCF)。免疫缺陷是由于某些細胞因子減少而引起的，因此，細胞因子用于增強免疫缺陷者的免疫能力有特別重要的意義。2.7 納米

13、粒子佐劑納米粒子是指直徑一般在 101000nm之間的聚合物形成的微粒 ,它具有獨特的小尺寸效應(yīng)和界面效應(yīng).抗原物質(zhì)或能編碼免疫原多肽的 DNA或 RNA可被包裹于納米粒子內(nèi)部或是吸附在納米粒子表面 ,也可通過化學(xué)連接作用與納米粒子結(jié)合 ,納米粒子佐劑可有效提高細胞免疫、 體液免疫和黏膜免疫。2.8 天然來源佐劑蜂膠具有廣譜的生物學(xué)活性，是一種天然的免疫增強劑。應(yīng)用蜂膠或配合抗原引入機體，既能引起特異性免疫應(yīng)答，又能啟動非特異性防御機制，能刺激免疫機制和丙種球蛋白活性，增加抗體產(chǎn)量，增強補體活性和吞噬細胞的吞噬能力。用蜂膠制成的禽霍亂菌苗，具有安全可靠、保護率高（95.5%）、免疫期長（6個月

14、）、產(chǎn)生堅強免疫力的時間早（注射后第5天）和無毒副作用等優(yōu)點。蜂膠所含的成分極其復(fù)雜。研究表明，蜂膠本身無明顯抗原性和過敏性，毒副作用較小。天然來源佐劑還有多糖香菇多糖、云芝多糖、黃芪多糖、蘆薈多糖、淫羊藿等。3 存在的問題和展望3.1 存在的問題及安全性當(dāng)前使用的各類佐劑，尚有許多不夠理想之處，如某些佐劑接種引起局部炎癥、罕見的肉芽腫或無菌性膿腫。在實驗動物中觀察到的對佐劑的全身反應(yīng)包括不適、發(fā)熱、佐劑性關(guān)節(jié)炎等。這些不良反應(yīng)可能由佐劑與抗原本身的相互作用而引起，也可能由佐劑引起的對特定抗原的應(yīng)答類型所致。因此，必須對佐劑進行更加深入的了解，闡明其免疫效應(yīng)機理，合理利用，盡量使佐劑的應(yīng)用安全

15、高效。3.2 展望開發(fā)研制新型的免疫佐劑以增強疫苗的免疫效力并減少疫苗的毒副作用將是未來的發(fā)展趨勢，新型疫苗佐劑是研究其免疫性與毒性的最佳平衡。它是生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑中免疫調(diào)節(jié)劑，非特異性免疫刺激作用是發(fā)揮其免疫佐劑性，使機體產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答所必需的基本條件。隨著研究的深入，今后對免疫佐劑的研究則主要集中在以下幾個方面：進一步開展對免疫佐劑構(gòu)效關(guān)系及其活性分子結(jié)構(gòu)改造的研究，研制出化學(xué)結(jié)構(gòu)明確、分子質(zhì)量低、低毒、高效的新型免疫佐劑。在整體水平、細胞水平及分子水平上，探討新型免疫佐劑的作用機制，為進一步安全、有效、合理地使用免疫佐劑提供理論依據(jù)。開展抗原-載體-免疫佐劑的藥劑學(xué)研究，包括優(yōu)化免疫佐

16、劑配方的研究，為制備低毒、高效、速效、長效的新免疫佐劑制劑開辟新途徑；開展誘導(dǎo)黏膜免疫的口服佐劑的研究。天然藥物免疫佐劑的開發(fā)研究。免疫佐劑新用途研究。免疫佐劑的應(yīng)用范圍不斷擴大，包括了免疫治療藥物、腫瘤疫苗，增強機體對細菌、病毒、真菌、寄生蟲及一些轉(zhuǎn)移瘤的抵抗力和免疫應(yīng)答。開展宿主內(nèi)源性免疫調(diào)節(jié)劑用作免疫佐劑及其誘生劑的研究，特別是T細胞對抗原識別的分子基礎(chǔ)和控制T細胞活化和功能專職應(yīng)答的研究進展，使免疫佐劑的作用不再局限于增強免疫應(yīng)答，而更著重于誘導(dǎo)機體選擇性地產(chǎn)生有效防御相應(yīng)病原體感染的特異性免疫應(yīng)答，減少抗原的副作用?，F(xiàn)在，由于高度純化的新型疫苗的生產(chǎn)技術(shù)不斷取得突破，而常規(guī)佐劑由于其

17、自身的缺陷很難適應(yīng)新型疫苗的開發(fā)，所以新佐劑的研究已經(jīng)逐漸引起科研工作者的注意。隨著科技的進步，研究的不斷深入，相信上述諸多問題將逐一被解決，將有更多的佐劑用于疫苗制造，佐劑的有效應(yīng)用會在人類和動物疾病的預(yù)防過程中，發(fā)揮更大的作用。參考文獻：1 Dotsika E, Karagouni E, Sundquist B, et al. Influence of Quillaja saponaria triterpenoid content on the immunomodulatory capacity of Epstein -Barr virus ISCOMs J . Scand J Immun

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23、 具有十分重要和深遠的意義。關(guān)鍵詞： 反向疫苗學(xué)； 基因組序列； 病原體； 免疫原性1796年, 英國醫(yī)生琴納首先成功地接種牛痘苗來預(yù)防人類天花, 從此, 疫苗接種被認為是預(yù)防各種細菌和病毒感染的最佳選擇。傳統(tǒng)制備疫苗的方法是通過培養(yǎng)病原微生物來制備各種死疫苗, 減毒活疫苗以及亞單位疫苗。這些疫苗到目前為止已經(jīng)成功地用于預(yù)防很多傳染病的發(fā)生和流行。盡管這些傳統(tǒng)方法制備疫苗取得了顯著的效果, 但是并非所有的病原體都能成功地通過傳統(tǒng)的方法來制備其疫苗, 而且一些采用傳統(tǒng)方法制備的疫苗存在不良副反應(yīng)嚴重、 安全性沒有足夠保障、 制備工藝復(fù)雜成本較高等缺點。目前, 隨著越來越多的細菌全基因組測序工作的

24、完成和生物信息學(xué)的發(fā)展, 為開發(fā)研制新型的、 安全有效的疫苗提供了一種新的方法) 反向疫苗學(xué)(Reverse vaccinology)。 它采取大規(guī)模、 高通量、 自動化和計算機分析的研究方法, 可以在短期內(nèi)同時完成大量候選抗原的克隆表達和提純, 為過去用傳統(tǒng)疫苗學(xué)方法研究失敗而不得不放棄的那些疑難疫病的疫苗發(fā)展提供了一條新的途徑, 成為當(dāng)前預(yù)防醫(yī)學(xué)研究的前沿和熱點領(lǐng)域。1反向疫苗學(xué)進入 21 世紀， 隨著基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用， 研究人員開始從全基因水平來篩選具有保護性免疫反應(yīng)的候選抗原， 這就形成了一個嶄新的疫苗設(shè)計策略， 即 “反向疫苗學(xué)” （reversevaccinol

25、ogy）， 它通過對某一病原體的基因組測序分析， 篩選出抗原決定簇， 通過高通量技術(shù)， 在短期內(nèi)完成大量候選抗原的克隆、 表達和純化， 鑒定出具有一定免疫原性特征的蛋白質(zhì)， 為一些不能用傳統(tǒng)疫苗研究方法獲得有效疫苗的疑難疫病的防控開辟了一條新的途徑， 同時還有助于預(yù)測和發(fā)現(xiàn)以往所不知的各種免疫原， 為深入研究它們的特征及功能提供了可能。相對于常規(guī)或傳統(tǒng)的疫苗研究方法， 反向疫苗學(xué)具有如下優(yōu)勢： 便捷， 整個過程從分析基因組序列開始， 不需要培養(yǎng)微生物； 寬泛， 基于將所有的蛋白質(zhì)看做是潛在的具有免疫原性的思路， 適用于所有微生物疫苗的研究； 安全， 可以對一些危險的病原微生物進行操作， 避免病

26、原微生物的擴散； 不受病原微生物致病機理和免疫應(yīng)答的限制。2反向疫苗學(xué)的研究方法目前， 用于反向疫苗學(xué)研究的方法主要有基因組的數(shù)據(jù)庫分析、 基因產(chǎn)物的蛋白質(zhì)組學(xué)研究、高通量表達、免疫學(xué)檢測。 這些方法的設(shè)計思路和操作步驟大致相同，即通過計算機軟件分析， 在病原體基因組中篩選抗原決定簇；利用基因芯片技術(shù)對選出的基因進行高通量克隆表達；然后通過體內(nèi)、 外實驗鑒定有效的抗原蛋白， 進行相關(guān)免疫效果的評價。2.1 基因組的數(shù)據(jù)庫分析利 用 國 際 互 聯(lián) 網(wǎng) 上 豐 富 的 數(shù) 據(jù) 庫 資 源 和 BLASTX、BLASTN、 TBLASTX 等計算機程序， 對病原微生物基因組中DNA 片段的編碼能力

27、進行篩選， 對所有預(yù)測的開放閱讀框架（openreadingframe,ORF） 進行同源性搜索， 鑒定有潛在編碼蛋白能力的 DNA 片段， 并對相關(guān)編碼蛋白進行定位。Xiang 等根據(jù)反向疫苗學(xué)，創(chuàng)建了以網(wǎng)絡(luò)為基礎(chǔ)的疫苗設(shè)計系統(tǒng)，稱為 Vaxign。Vaxign 將微生物基因組和蛋白序列作為輸入數(shù)據(jù)，根據(jù)不同疫苗的設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)，來預(yù)測可能的疫苗靶位。在 Vaxign 程序的主要預(yù)測特征包括蛋白質(zhì)的亞細胞定位、跨膜區(qū)、黏附率、基因組中的保守序列、與宿主 (人或小鼠) 蛋白質(zhì)組序列相似性及主要組織相容性復(fù)合物 (major histocompatibility complex，MHC) 和表位的黏附

28、性。用戶可以從一個基因組查詢到經(jīng) Vaxign 程序預(yù)測的一個蛋白序列結(jié)果，或是完成輸入蛋白序列的動態(tài)分析。Vaxign 已經(jīng)存儲了 40 多種病原體 (例如布魯氏菌) 的計算機處理結(jié)果，分析結(jié)果說明 Vaxign能特異和敏感地預(yù)測已知的疫苗靶位，也能提供新的疫苗靶位模型。2.2 利用蛋白組學(xué)對預(yù)測蛋白進行功能分析首先對蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 （SWISS-PROT、 TrEMBL、 PIR 等） 進行 BLAST 檢索， 尋找同源蛋白。再利用二級數(shù)據(jù)庫多序列比對結(jié)果尋找序列模式、 基序、 序型、 蛋白質(zhì)指紋等結(jié)構(gòu)功能特征。再使用 ProSite、 Prnt-S、 PFam、 Smart、 Blocks

29、+、 InterPro、MetaFam 等軟件工具來預(yù)測表面相關(guān)蛋白的典型特征， 對蛋白質(zhì)進行亞細胞定位的方法。2.3 高通量表達通過芯片技術(shù)和PCR技術(shù)將篩選出的有價值的ORF快速、大量的克隆和表達， 根據(jù) ORF 設(shè)計引物， PCR 擴增， 將每個擴增產(chǎn)物克隆并在外源系統(tǒng)中表達， 一般都選擇大腸桿菌表達系統(tǒng)； 再利用 His-Tag和 GST融合表達技術(shù)快速純化重組蛋白，最后免疫小鼠， 進行相關(guān)的免疫學(xué)研究。除了常規(guī)的 PCR 方法，Liang 等介紹了一種高通量的表達方法，即有轉(zhuǎn)錄功能的多聚酶鏈反應(yīng)( transcriptionally active polymerase chain r

30、eaction，TAP) 方法。該方法合成具有轉(zhuǎn)錄功能的 PCR 片段，可以直接進行體內(nèi)和體外表達實驗。將獲得的 TAP片段通過肌肉注射入小鼠體內(nèi)，可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對編碼該抗原的超螺旋質(zhì)粒相同的抗體。同時 TAP 不需要常規(guī)的克隆，可通過體內(nèi)重組轉(zhuǎn)移到表達載體中，既不需要限制性內(nèi)切酶、也不需要胸苷腺嘌呤互補。該方法可以快速的、高通量的產(chǎn)生大量具有轉(zhuǎn)錄活性的基因。表達基因最常用的方法是將它們的融合物連接到組氨酸標(biāo)簽或是谷胱甘肽 S- 轉(zhuǎn)移酶上，這樣用簡單的親和層析柱層析就可以快速的純化重組蛋白。對于不溶性抗原，用變性試劑 (例如尿素) 純化，然后在精氨酸、甘油存在的情況下，兩步透析法復(fù)性。而對于有二

31、硫鍵的蛋白，則可加入少量氧化谷胱甘肽。對于產(chǎn)生和純化的抗原可溶性的增加，可通過洗滌劑或是改變微生物的生長溫度來達到。2.4 免疫學(xué)檢測對重組蛋白免疫小鼠后的血清進行免疫學(xué)分析， 進一步確定多肽的表面定位和免疫原性。首先應(yīng)用免疫血清進行免疫印跡， 確定蛋白質(zhì)的定位， 進一步利用酶聯(lián)免疫吸附試驗法和流式細胞儀測定血清的抗體滴度和抗血清結(jié)合于活菌表面的能力。3 反向疫苗學(xué)在疫苗研發(fā)中的應(yīng)用3.1 反向疫苗在細菌疫苗研發(fā)中的應(yīng)用 3.1.1B 群腦膜炎球菌（neisseriameningitidisserogroupB，MenB）B 群腦膜炎球菌， 為流行性腦脊髓膜炎 （流腦） 的病原菌， 可引起兒童

32、和青少年急性化膿性腦膜炎和敗血癥。由于MenB 表面蛋白基因序列存在變異性以及莢膜多糖與人類組織存在交叉反應(yīng)， 一直沒有有效的疫苗用于預(yù)防。PizzaM等首次應(yīng)用反向疫苗學(xué)原理， 研制了 B型腦膜炎球菌疫苗， 這是反向疫苗學(xué)運用的第 1 個例子。其研制方法是通過基因組數(shù)據(jù)庫和應(yīng)用分子生物學(xué)軟件對 MenB 的全基因組進行篩選分析， 從 2158 個 ORFs 中預(yù)測出有 570 個基因編碼表面暴露蛋白或分泌蛋白， 通過高通量表達和免疫原性評價后， 篩選出 29種能刺激機體產(chǎn)生抗體的抗原， 通過基因組序列比對分析、 抗異性攻擊試驗， 篩選出具有血型代表性的的 MenB 候選抗原，據(jù)此成功研制出多

33、價 MenB疫苗。3.1.2肺炎鏈球菌 （streptococcuspneumoniae） 肺炎鏈球球菌主要引起兒童的敗血病、 肺炎、 腦膜炎及中耳炎等疾病。目前, 美國有一種有效的多聯(lián)疫苗可防治肺炎鏈球菌感染, 但是這種有效的多聯(lián)肺炎球菌疫苗也只包含了肺炎鏈球菌 70 多個血清型中 7 個血清型的多聚糖莢膜, 所以它并不是對所有血清型的鏈球菌都有效。最近, 韓國的研究人員測出了肺炎鏈球菌的全基因組, 為我們利用反向遺傳學(xué)技術(shù)鑒定眾多的潛在抗原基因奠定了基礎(chǔ)。通過對所有的 2687 個閱讀框架的綜合評價, 最終確認了 130個閱讀框架。用其中的 108 種編碼產(chǎn)物接種實驗動物, 發(fā)現(xiàn)有 6 種

34、蛋白能產(chǎn)生有效的抗體以對抗肺炎鏈球菌的感染。應(yīng)用其他技術(shù)手段也證明這 6 種蛋白存在于病原體表面, 并呈現(xiàn)出免疫原性。因此, 這些鑒定出的蛋白都可以作為研制肺炎鏈球菌的有效候選抗原蛋白。 3.1.3肺炎衣原體（chlamydiapneumoniae）肺炎衣原體是一種人類專性胞內(nèi)病原體， 感染后可引起肺炎、 動脈粥樣硬化和心血管病等。由于肺炎衣原體有原體和網(wǎng)狀體兩種不同的發(fā)育階段， 人們很難用現(xiàn)有的基因操作手段對其表面蛋白進行分析。2002 年， MontigianiS 等應(yīng)用反向疫苗學(xué)的研究方法來鑒定衣原體表面蛋白， 通過分析肺炎衣原體的基因組序列，預(yù)測出157種可能的表面蛋白， 克隆表達后通

35、過免疫檢測技術(shù)，成功地定位原體期的肺炎衣原體表面蛋白， 為研制新型的肺炎衣原體疫苗奠定基礎(chǔ)。3.1.4炭疽桿菌 （bacillusanthracis）炭疽桿菌是炭疽病的病原體， 由其胞內(nèi)的大質(zhì)粒 pXO1 所編碼的保護性抗原 （PA）是目前制備炭疽桿菌疫苗的主要免疫原， 該類疫苗需多次免疫， 且有時會引起過敏反應(yīng)。ArielN 等通過運用功能基因組學(xué)分析篩選出 11 種抗原， 用炭疽桿菌抗血清評價其免疫原性， 結(jié)合生物信息學(xué)分析， 發(fā)現(xiàn) 3 種蛋白具有保護性抗原特征。這些新的蛋白可作為研制第 2 代炭疽桿菌疫苗的抗原。3.2反向疫苗學(xué)在病毒疫苗研發(fā)中的應(yīng)用3.2.1人類免疫缺陷病毒 （huma

36、nimmunodeficiencyvirus，HIV）人類免疫缺陷病毒是獲得性免疫缺陷綜合征， 即艾滋病的病原體。傳統(tǒng) HIV 疫苗的研究， 主要研究包膜蛋白和核心蛋白， 但由于 HIV 病毒的高度變異性， 該類疫苗難以產(chǎn)生有效的中和抗體和誘導(dǎo)特異性細胞免疫反應(yīng)。OsterhausAD 等研究發(fā)現(xiàn)， HIV 病毒基因組可提供一些非結(jié)構(gòu)的早期蛋白抗原，它們在病毒生活周期中含量少且短暫， 難以用傳統(tǒng)的方法作為抗原研究， 而通過基因組提供的潛在抗原信息， 將這些早期蛋白作為抗原顯示了很好的結(jié)果。 乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV) 的外膜蛋白( S) 攜帶有 B和T 淋巴細胞表位

37、, 能刺激機體產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答反應(yīng), 是引起宿主產(chǎn)生保護性應(yīng)答反應(yīng)的免疫學(xué)表位。通過基因工程手段獲得這一免疫原性蛋白,進而可研制成基因工程疫苗。目前重組乙型肝炎疫苗(HBV) 已成功應(yīng)用于乙型肝炎病毒感染, 也是迄今應(yīng)用最成功、 最廣泛的基因工程疫苗。3.3 反向疫苗學(xué)在寄生蟲疫苗研發(fā)中的應(yīng)用 瘧疾 （malaria）是通過蚊叮咬傳播的寄生蟲病， 其病原體為瘧原蟲。瘧原蟲在不同的生活周期中表達不同抗原， 使疫苗的研制非常困難。盡管已從瘧原蟲中鑒定出 20 多種抗原， 但沒有一種適合做疫苗。應(yīng)用反向疫苗學(xué)有望獲得突破。從全基因組序列預(yù)測了 6000個基因信息， 以重組蛋白形式表達或以 DNA

38、疫苗形式表達， 基因表達產(chǎn)物具有免疫原性。相信最終會研制出有效的疫苗防治瘧疾。4 展望 20世紀 90年代末是基因組時代開始的標(biāo)志, 基因組測序和分析正處于飛速發(fā)展的時期。越來越多的病原微生物完成了基因組序列的測定, 為研究新型的有效疫苗和攻克各種感染性疾病開辟了道路。反向疫苗學(xué)的特點是大規(guī)模、 高通量、 自動化, 可在短期內(nèi)完成大量候選疫苗抗原的篩選和鑒定, 而且還可發(fā)現(xiàn)具有保護性免疫反應(yīng)的新抗原。 因此, 人們都寄希望于用它來解決傳統(tǒng)疫苗學(xué)長期不能解決的某些重要傳染病的疫苗預(yù)防問題。但是反向疫苗學(xué)作為傳統(tǒng)疫苗學(xué)的發(fā)展，本身還存在著一些不足之處。首先，基因組學(xué)可以預(yù)測大部分閱讀框，但卻不能預(yù)

39、測所有的閱讀框，而且預(yù)測基因的起始密碼子也并非沒有缺點，同時預(yù)測表面或分泌性蛋白的各種算法本身也存在不足之處。其次，一些閱讀框在實際自然感染中表達的蛋白，與在實驗室培養(yǎng)的細菌感染中表達的蛋白有明顯差別，因此，出現(xiàn)抗血清與重組蛋白有強烈反應(yīng)，但是與實驗室培養(yǎng)細菌沒有反應(yīng)這種情況也不足為奇。最后，反向疫苗學(xué)方法目前只能應(yīng)用于蛋白質(zhì)抗原，不能鑒別非蛋白質(zhì)抗原，如多糖、糖脂等。盡管反向疫苗學(xué)存在著局限性和困難，但是在疫苗發(fā)展的道路上，仍起巨大的推動作用。在目前的研究中，已經(jīng)運用這種方法從大量抗原中篩選出了一些候選疫苗，彌補了傳統(tǒng)疫苗學(xué)的不足，今后也越來越成為疫苗開發(fā)中的重要手段,對疫苗的研制生產(chǎn)將會起

40、到越來越重要的作用。參考文獻：1 Rappuoli R.Reverse vaccinology J. Curropin Microbio l2000,3 : 445-450 .2 Rappuoli R. Reverse vaccinology,a genome-based approach to vaccine development J. Vaccine 2001, 19 : 2688 -2691.3 WizemannTM,HeinrichsJH,AdamouJE,etal.UseofawholegenomeapproachtoidentifyvaccinemoleculesaffordingprotectionagainststreptococcuspneumoniaeinfectionJ.InfectImmun,2001,69(3):1593-1598.4 Mora M， Veggi D， Santini L， et al Reverse vaccinology J