第五章酶的化學(xué)修飾

1、第五章第五章 酶的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾n第一節(jié)第一節(jié) 什么是酶分子修飾什么是酶分子修飾n第二節(jié)第二節(jié) 化學(xué)修飾的原理化學(xué)修飾的原理n第三節(jié)第三節(jié) 酶化學(xué)修飾的酶化學(xué)修飾的基本要求和條件基本要求和條件n第第四四節(jié)節(jié) 酶分子酶分子的修飾方法的修飾方法n第五節(jié)第五節(jié) 修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)n第六節(jié)第六節(jié) 酶化學(xué)修飾的應(yīng)用酶化學(xué)修飾的應(yīng)用第一節(jié)第一節(jié) 什么是酶分子修飾什么是酶分子修飾?n通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，通過(guò)各種方法使酶分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些改變，從而改變酶的從而改變酶的某些特性和功能某些特性和功能的技術(shù)過(guò)程稱的技術(shù)過(guò)程稱為酶分子修飾。為酶分子修飾。n即：在體外將酶分子

2、通過(guò)人工的方法與一些即：在體外將酶分子通過(guò)人工的方法與一些化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的物質(zhì)，化學(xué)基團(tuán)，特別是具有生物相容性的物質(zhì)，進(jìn)行共價(jià)連接，或除去酶分子中的某些集團(tuán)，進(jìn)行共價(jià)連接，或除去酶分子中的某些集團(tuán)，從而從而改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)改變酶的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)。酶分子的化學(xué)修飾酶分子的化學(xué)修飾n穩(wěn)定性穩(wěn)定性不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)條件的不夠，不能適應(yīng)大量生產(chǎn)條件的需要。需要。n作用的作用的最適條件最適條件不符。不符。n酶的主要酶的主要?jiǎng)恿W(xué)性質(zhì)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)的不適應(yīng)。的不適應(yīng)。n臨床應(yīng)用臨床應(yīng)用的特殊要求。的特殊要求。酶在應(yīng)用中可能出現(xiàn)的問(wèn)題酶在應(yīng)用中可能出現(xiàn)的問(wèn)題:酶分子改造的方向酶分子改造的方向n

3、核酸水平核酸水平：利用基因操作技術(shù)對(duì)：利用基因操作技術(shù)對(duì)DNA 或或mRNA 進(jìn)行進(jìn)行改造或修飾，以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)（一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間改造或修飾，以期獲得化學(xué)結(jié)構(gòu)（一級(jí)結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)）更為合理的酶。結(jié)構(gòu)）更為合理的酶。生物酶工程生物酶工程內(nèi)容之一內(nèi)容之一n蛋白質(zhì)水平蛋白質(zhì)水平：人們用化學(xué)法或酶法對(duì)酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)人們用化學(xué)法或酶法對(duì)酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行進(jìn)行改造改造，這包括酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸的置換，這包括酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸的置換，包括用酶將肽鏈切斷或部分切除，使酶的空間構(gòu)象包括用酶將肽鏈切斷或部分切除，使酶的空間構(gòu)象變得更為穩(wěn)定。另一方面是對(duì)酶分子中氨基酸殘基變得更為穩(wěn)定。另一方面是對(duì)酶分子中氨基酸殘基

4、的修飾，即的修飾，即酶的化學(xué)修飾酶的化學(xué)修飾。酶分子的化學(xué)修飾定義：酶分子的化學(xué)修飾定義：n廣義上說(shuō)：凡涉及共價(jià)鍵的形成或破壞廣義上說(shuō)：凡涉及共價(jià)鍵的形成或破壞的轉(zhuǎn)變都可以看作是酶的化學(xué)修飾。的轉(zhuǎn)變都可以看作是酶的化學(xué)修飾。n狹義上說(shuō)：是指在狹義上說(shuō)：是指在較溫和的條件較溫和的條件下，以下，以可控制可控制的方式使酶同化學(xué)試劑發(fā)生的方式使酶同化學(xué)試劑發(fā)生特異特異反應(yīng)反應(yīng)，從而引起單個(gè)氨基酸殘基或功能，從而引起單個(gè)氨基酸殘基或功能發(fā)生共價(jià)的發(fā)生共價(jià)的化學(xué)變化化學(xué)變化。酶化學(xué)修飾的目的酶化學(xué)修飾的目的1. 1. 研究酶的研究酶的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。（。（5050年代末）年代末）2. 2

5、. 人為改變天然酶的某些性質(zhì)，人為改變天然酶的某些性質(zhì)，擴(kuò)大酶的應(yīng)用擴(kuò)大酶的應(yīng)用 范圍范圍。（。（7070年代末之后）年代末之后）1 1）提高酶的生物活性（酶活力）。）提高酶的生物活性（酶活力）。2 2）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。）增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（熱穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期）。3 3）消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能力）。）消除抗原性（針對(duì)特異性反應(yīng)降低生物識(shí)別能力）。4 4）產(chǎn)生新的催化能力。）產(chǎn)生新的催化能力。第二節(jié)第二節(jié). 酶化學(xué)修飾的基本原理酶化學(xué)修飾的基本原理*1 如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性2 如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑如何

6、保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑3 如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶4 如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境酶化學(xué)修飾的原理酶化學(xué)修飾的原理一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性一、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性 修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性剛性”結(jié)構(gòu)。結(jié)構(gòu)。二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑二、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑 大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻

7、擋抑制劑，或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋遮蓋”了酶的活性部了酶的活性部位。位。三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶三、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶化學(xué)修飾后通過(guò)兩種途徑抗蛋白水解酶：酶化學(xué)修飾后通過(guò)兩種途徑抗蛋白水解酶：大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子。近酶分子?！罢谏w遮蓋”酶分子上敏感鍵免遭破壞。酶分子上敏感鍵免遭破壞。2. 2. 酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。受蛋白水解酶破壞的可能性。四、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境四、如何消除酶

8、的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1. 1. 酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成 了共價(jià)鍵。了共價(jià)鍵。 破壞了抗原決定簇破壞了抗原決定簇抗原性降低乃至消除抗原性降低乃至消除 “遮蓋遮蓋”了抗原決定簇了抗原決定簇阻礙抗原、抗體結(jié)合阻礙抗原、抗體結(jié)合2. 2. 大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成形成“緩沖外殼緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。第三節(jié)第三節(jié) 酶化學(xué)修飾的基本要求和條件酶化學(xué)修飾的基本要求和條件 n一修

9、飾劑的要求一修飾劑的要求n二酶性質(zhì)的了解二酶性質(zhì)的了解n三反應(yīng)條件的選擇三反應(yīng)條件的選擇n四酶修飾方法四酶修飾方法一一 修飾劑的要求修飾劑的要求n1 1 修飾劑具有較大的相對(duì)分子量；對(duì)蛋修飾劑具有較大的相對(duì)分子量；對(duì)蛋 白質(zhì)的吸附有良好的生物相容性和水溶性。白質(zhì)的吸附有良好的生物相容性和水溶性。n2 2 修飾劑分子表面具有較多的活性反應(yīng)修飾劑分子表面具有較多的活性反應(yīng)基團(tuán)?；鶊F(tuán)。n3 3 修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件。修飾劑上反應(yīng)基團(tuán)的活化方法與條件。 了解了解被修飾酶的性質(zhì)被修飾酶的性質(zhì)酶的穩(wěn)定性：酶的穩(wěn)定性：包括熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，包括熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性，作用溫度以及作用溫度以及p

10、HpH，酶蛋白解離時(shí)的電化學(xué)性質(zhì)，酶蛋白解離時(shí)的電化學(xué)性質(zhì)，抑制劑的性質(zhì)等。抑制劑的性質(zhì)等。酶活性中心的狀況：酶活性中心的狀況：包括酶分子活性中心的包括酶分子活性中心的組成，如參與活性中心的氨基酸殘基、輔因子組成，如參與活性中心的氨基酸殘基、輔因子等。酶分子的形狀、大小以及寡聚酶的亞基組等。酶分子的形狀、大小以及寡聚酶的亞基組成。成。二二. 酶化學(xué)修飾的基本要求酶化學(xué)修飾的基本要求pH與離子強(qiáng)度：與離子強(qiáng)度： 一般在酶穩(wěn)定的條件下進(jìn)行，盡可能減少破壞酶的必需集團(tuán)，選擇酶與修飾劑的結(jié)合率和酶活回收率都較高的反應(yīng)條件。 pH決定了酶分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)，決定了酶分子中反應(yīng)基團(tuán)的解離狀態(tài)，酶的解

11、離狀態(tài)酶的解離狀態(tài)不同不同，其，其反應(yīng)性能也不同反應(yīng)性能也不同；另一方面，有些修飾試劑在；另一方面，有些修飾試劑在不不同同pH下下，與同一種基團(tuán)反應(yīng)可以，與同一種基團(tuán)反應(yīng)可以形成不同的產(chǎn)物形成不同的產(chǎn)物。離子。離子強(qiáng)度對(duì)修飾反應(yīng)也有重要影響。強(qiáng)度對(duì)修飾反應(yīng)也有重要影響。修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間：修飾反應(yīng)的溫度與時(shí)間：嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時(shí)間可嚴(yán)格控制反應(yīng)溫度和時(shí)間可以以減少或消除減少或消除一些非專一性的修飾反應(yīng)。一些非專一性的修飾反應(yīng)。反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例：反應(yīng)體系中酶與修飾劑的比例：酶與修飾試劑的比酶與修飾試劑的比例可以控制酶分子的修飾程度例可以控制酶分子的修飾程度。三、選擇修飾反應(yīng)條件三、

12、選擇修飾反應(yīng)條件(1)酶的表面修飾酶的表面修飾(2)酶分子的內(nèi)部修飾酶分子的內(nèi)部修飾(3)與輔因子相關(guān)的修飾與輔因子相關(guān)的修飾(4)金屬酶的金屬取代金屬酶的金屬取代第四節(jié)第四節(jié). 酶分子的化學(xué)修飾方法酶分子的化學(xué)修飾方法*反相膠團(tuán)微囊化反相膠團(tuán)微囊化脂質(zhì)體包埋脂質(zhì)體包埋分子間交聯(lián)分子間交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián)分子內(nèi)交聯(lián)酶的大分子修飾作用酶的大分子修飾作用酶的小分子修飾作用酶的小分子修飾作用化學(xué)固定化化學(xué)固定化(1)酶的表面修飾酶的表面修飾（1）酶的表面修飾）酶的表面修飾 化學(xué)固定化化學(xué)固定化：一般是直接通過(guò)酶表面的氨基一般是直接通過(guò)酶表面的氨基酸殘基將酶分子共價(jià)連接到酸殘基將酶分子共價(jià)連接到惰性載體惰性

13、載體上；由于載體上；由于載體的引入，使酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而改變了的引入，使酶所處的微環(huán)境發(fā)生改變，進(jìn)而改變了酶的性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。酶的性質(zhì)，特別是動(dòng)力學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。酶的小分子修飾作用：酶的小分子修飾作用：主要是利用一些小主要是利用一些小分子修飾試劑，通過(guò)共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾酶的一些分子修飾試劑，通過(guò)共價(jià)結(jié)合來(lái)修飾酶的一些基團(tuán)（如基團(tuán)（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基、咪唑基等），提高酶的穩(wěn)定性。常用的小分子修飾試等），提高酶的穩(wěn)定性。常用的小分子修飾試劑有劑有乙基、糖基和甲基乙基、糖基和甲基等。等。例如例如:將將胰凝乳蛋白酶表面的胰凝乳蛋白酶表面的氨基氨基

14、修飾后，酶修飾后，酶的熱穩(wěn)定性在的熱穩(wěn)定性在60時(shí)，提高了時(shí)，提高了1000倍，溫度倍，溫度更高時(shí)穩(wěn)定化效應(yīng)更強(qiáng)烈。這個(gè)穩(wěn)定的酶能經(jīng)更高時(shí)穩(wěn)定化效應(yīng)更強(qiáng)烈。這個(gè)穩(wěn)定的酶能經(jīng)受滅菌的極端條件而不失活，因而有利于醫(yī)療受滅菌的極端條件而不失活，因而有利于醫(yī)療用酶。用酶。酶的大分子修飾作用：酶的大分子修飾作用：可分為非共價(jià)修飾可分為非共價(jià)修飾和共價(jià)修飾兩大類：和共價(jià)修飾兩大類：大分子非共價(jià)修飾：大分子非共價(jià)修飾：大分子共價(jià)修飾：大分子共價(jià)修飾：大分子非共價(jià)修飾：大分子非共價(jià)修飾：利用一些大分子試劑通過(guò)與酶非共價(jià)相互作用，利用一些大分子試劑通過(guò)與酶非共價(jià)相互作用，對(duì)酶進(jìn)行有效的保護(hù)。對(duì)酶進(jìn)行有效的保護(hù)。

15、 例如例如聚乙二醇、右旋糖苷聚乙二醇、右旋糖苷等通過(guò)氫鍵固定于酶分等通過(guò)氫鍵固定于酶分子的表面，同時(shí)又有效地與外部水相連，從而保子的表面，同時(shí)又有效地與外部水相連，從而保護(hù)酶的活力；護(hù)酶的活力； 一些一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通過(guò)等能通過(guò)調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來(lái)保護(hù)酶活力；調(diào)節(jié)酶的微環(huán)境來(lái)保護(hù)酶活力； 另外一些另外一些蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)可以通過(guò)相互作用，排除分子表可以通過(guò)相互作用，排除分子表面的水分子，降低介電常數(shù)，使酶的穩(wěn)定性增加。面的水分子，降低介電常數(shù)，使酶的穩(wěn)定性增加。大分子共價(jià)修飾：大分子共價(jià)修飾：利用一些可溶性大分子，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子利用一些可溶性

16、大分子，通過(guò)共價(jià)鍵連接于酶分子的表面，形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許的表面，形成一層覆蓋層，形成的可溶性酶具有許多有用的性質(zhì)。多有用的性質(zhì)。 例如用例如用聚乙二醇聚乙二醇共價(jià)修飾超氧化物歧化酶（共價(jià)修飾超氧化物歧化酶（SODSOD），），不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了半衰期，從而提高了藥效。白酶的能力，延長(zhǎng)了半衰期，從而提高了藥效。大分子（共價(jià)）修飾的過(guò)程大分子（共價(jià)）修飾的過(guò)程 修飾劑的選擇修飾劑的選擇 根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修根據(jù)酶分子的結(jié)構(gòu)和修飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。飾劑的特性選擇適宜的水溶性大分子。

17、 修飾劑的活化修飾劑的活化 修飾劑中含有的基團(tuán)需修飾劑中含有的基團(tuán)需要經(jīng)過(guò)活化才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)要經(jīng)過(guò)活化才可以與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)進(jìn)行反應(yīng)。進(jìn)行反應(yīng)。 修飾修飾 將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過(guò)將帶有活化基團(tuán)的大分子修飾劑與經(jīng)過(guò)分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的分離純化的酶液，以一定的比例混合，在一定的溫度、溫度、pH值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的值等條件下反應(yīng)一段時(shí)間，使修飾劑的活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，活化基團(tuán)與酶分子的某側(cè)鏈基團(tuán)以共價(jià)鍵結(jié)合，對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。對(duì)酶分子進(jìn)行修飾。 分離分離 需要通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分離，需要通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分

18、離，將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有將具有不同修飾度的酶分子分開，從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶。較好修飾效果的修飾酶。分子內(nèi)交聯(lián)：分子內(nèi)交聯(lián)： 增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性增加酶分子表面的交聯(lián)鍵數(shù)目是提高酶穩(wěn)定性的有效方法之一，例如的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶上的羧基上的羧基經(jīng)過(guò)經(jīng)過(guò)羰二亞胺羰二亞胺活化后，可以與一系列活化后，可以與一系列二胺二胺發(fā)生發(fā)生作用，使酶的穩(wěn)定性得到改善。作用，使酶的穩(wěn)定性得到改善。分子間交聯(lián)：分子間交聯(lián)： 利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶交聯(lián)在利用一些雙功能或多功能試劑將不同的酶交聯(lián)在一起形成雜化酶。例如用一起形成雜化酶

19、。例如用戊二醛戊二醛把把胰蛋白酶胰蛋白酶和和胰胰凝乳蛋白酶凝乳蛋白酶交聯(lián)在一起，可以降低交聯(lián)在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶的自溶性的自溶性；將胰蛋白酶與堿性磷酸脂酶交聯(lián)形成；將胰蛋白酶與堿性磷酸脂酶交聯(lián)形成的雜化酶可作為部分代謝途徑的模型。的雜化酶可作為部分代謝途徑的模型。脂質(zhì)體包埋：脂質(zhì)體包埋：一些醫(yī)藥用酶，如一些醫(yī)藥用酶，如 SODSOD、溶菌酶溶菌酶等，由于分子量較大，不易進(jìn)入等，由于分子量較大，不易進(jìn)入人體細(xì)胞內(nèi)，而且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)人體細(xì)胞內(nèi)，而且在體內(nèi)半衰期短，產(chǎn)生免疫原性反應(yīng)；用脂質(zhì)體包埋法即可生免疫原性反應(yīng)；用脂質(zhì)體包埋法即可解決這些問(wèn)題。解決這些問(wèn)題。 脂質(zhì)體是天

20、然脂類或類脂質(zhì)體是天然脂類或類固醇組成的微球體，酶固醇組成的微球體，酶分子包埋在其內(nèi)部，可分子包埋在其內(nèi)部，可以通過(guò)與細(xì)胞的膜融合以通過(guò)與細(xì)胞的膜融合或內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞或內(nèi)吞作用而進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。內(nèi)。反相膠團(tuán)微囊化：反相膠團(tuán)微囊化：這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酶在這是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的酶在有劑相中進(jìn)行催化的技術(shù)，反相膠團(tuán)中酶的穩(wěn)定性有劑相中進(jìn)行催化的技術(shù)，反相膠團(tuán)中酶的穩(wěn)定性大大提高；一些表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑大大提高；一些表面活性劑溶解在非極性有機(jī)溶劑中時(shí)可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團(tuán)，反相膠團(tuán)中時(shí)可自發(fā)地形成近似球狀的反相膠團(tuán)，反相膠團(tuán)是表面活性劑的疏水尾部朝外而極性頭部朝內(nèi)的微是表面活性劑的

21、疏水尾部朝外而極性頭部朝內(nèi)的微膠團(tuán)，其內(nèi)部可容納一定量的水，酶溶解在其中避膠團(tuán)，其內(nèi)部可容納一定量的水，酶溶解在其中避免變性（見圖）。免變性（見圖）。有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑 疏水尾部疏水尾部 親水頭部親水頭部 加酶液加酶液 S PEEE 圖：反相膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)和酶的分布圖：反相膠團(tuán)的結(jié)構(gòu)和酶的分布(1)酶的表面修飾酶的表面修飾(2)酶分子的內(nèi)部修飾酶分子的內(nèi)部修飾(3)與輔因子相關(guān)的修飾與輔因子相關(guān)的修飾(4)金屬酶的金屬取代金屬酶的金屬取代酶分子的化學(xué)修飾方法酶分子的化學(xué)修飾方法(2) 酶分子的內(nèi)部修飾酶分子的內(nèi)部修飾非催化活性基團(tuán)的修飾：非催化活性基團(tuán)的修飾： 通過(guò)對(duì)通過(guò)對(duì)非催化殘基的修飾非催化殘基

22、的修飾可以改變酶的動(dòng)可以改變酶的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，力學(xué)性質(zhì)，改變酶對(duì)特殊底物的親和力改變酶對(duì)特殊底物的親和力； 通?？杀恍揎椀陌被釟埢瓤梢允怯H核通常可被修飾的氨基酸殘基既可以是親核的，也可以是親電子的，還可以是可氧化的，也可以是親電子的，還可以是可氧化殘基。殘基。催化活性基團(tuán)的修飾：催化活性基團(tuán)的修飾：通過(guò)選擇性修飾催化活性氨通過(guò)選擇性修飾催化活性氨基酸的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基基酸的側(cè)鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸殘基的取代，使一種氨基酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種氨基酸側(cè)鏈，這種方法又稱為酸側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為另一種氨基酸側(cè)鏈，這種方法又稱為化學(xué)突變法化學(xué)突變法。酶蛋白主鏈的修飾：酶蛋白主鏈的修飾：主要是靠酶法進(jìn)行

23、修飾，用蛋主要是靠酶法進(jìn)行修飾，用蛋白酶對(duì)主鏈進(jìn)行部分水解，可以改變酶的催化特性。白酶對(duì)主鏈進(jìn)行部分水解，可以改變酶的催化特性。肽鏈伸展后的修飾：肽鏈伸展后的修飾：酶蛋白經(jīng)過(guò)脲、鹽酸胍處理，酶蛋白經(jīng)過(guò)脲、鹽酸胍處理，使肽鏈充分伸展，對(duì)酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修使肽鏈充分伸展，對(duì)酶分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)進(jìn)行修飾，然后在適當(dāng)條件下，飾，然后在適當(dāng)條件下，重新進(jìn)行折疊重新進(jìn)行折疊。(1)酶的表面修飾酶的表面修飾(2)酶分子的內(nèi)部修飾酶分子的內(nèi)部修飾(3)與輔因子相關(guān)的修飾與輔因子相關(guān)的修飾(4)金屬酶的金屬取代金屬酶的金屬取代酶分子的化學(xué)修飾方法酶分子的化學(xué)修飾方法(3)(3)與輔因子相關(guān)的修飾與輔因子

24、相關(guān)的修飾 對(duì)依賴輔因子的酶可用兩種方法進(jìn)行修飾：對(duì)依賴輔因子的酶可用兩種方法進(jìn)行修飾： 如果輔因子與酶是非共價(jià)結(jié)合的如果輔因子與酶是非共價(jià)結(jié)合的, ,可以將輔因可以將輔因子子共價(jià)共價(jià)結(jié)合于酶分子上；結(jié)合于酶分子上； 引入新的具有引入新的具有更強(qiáng)反應(yīng)更強(qiáng)反應(yīng)的輔因子。的輔因子。(1)酶的表面修飾酶的表面修飾(2)酶分子的內(nèi)部修飾酶分子的內(nèi)部修飾(3)與輔因子相關(guān)的修飾與輔因子相關(guān)的修飾(4)金屬酶的金屬取代金屬酶的金屬取代酶分子的化學(xué)修飾方法酶分子的化學(xué)修飾方法(4) 金屬酶的金屬取代：金屬酶的金屬取代： 把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶把酶分子中的金屬離子換成另一種金屬離子，使酶

25、的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法。的特性和功能發(fā)生改變的修飾方法。適用范圍適用范圍 ： 只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)本來(lái)含有金屬離子的只適用于那些在分子結(jié)構(gòu)本來(lái)含有金屬離子的酶。酶。 用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是用于金屬離子置換修飾的金屬離子，一般都是二價(jià)金屬離子。二價(jià)金屬離子。若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶若從酶分子中除去其所含的金屬離子，酶往往會(huì)喪失其催化活性。往往會(huì)喪失其催化活性。 如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化如果重新加入原有的金屬離子，酶的催化活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。活性可以恢復(fù)或者部分恢復(fù)。 若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶若用另一種金屬離子進(jìn)行置換，則可使酶

26、呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性呈現(xiàn)出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提降低甚至喪失，有的卻可以使酶的活力提高或者增加酶的穩(wěn)定性。高或者增加酶的穩(wěn)定性。金屬金屬B金屬離子置換修飾的過(guò)程金屬離子置換修飾的過(guò)程 酶的分離純化酶的分離純化 除去原有的金屬離子除去原有的金屬離子 加入置換離子加入置換離子發(fā)酵液發(fā)酵液酶酶分離純化分離純化A酶酶EDTAEDTA-A+酶酶B第五節(jié)第五節(jié)* 修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn)修飾酶的性質(zhì)及特點(diǎn) 一熱穩(wěn)定性一熱穩(wěn)定性 二抗原性二抗原性 三三對(duì)各類失活因子的抵抗力對(duì)各類失活因子的抵抗力 四體內(nèi)半衰期四體內(nèi)半衰期 五最適五最適pH 六六Km 的變

27、化的變化:修飾酶的化學(xué)性質(zhì)修飾酶的化學(xué)性質(zhì)（）熱穩(wěn)定性（）熱穩(wěn)定性： 一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的酶，熱一般來(lái)說(shuō)，經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾的酶，熱穩(wěn)定性有較大的提高。主要是由于修飾穩(wěn)定性有較大的提高。主要是由于修飾試劑的多個(gè)功能基團(tuán)與酶分子的多個(gè)功試劑的多個(gè)功能基團(tuán)與酶分子的多個(gè)功能基團(tuán)相互交聯(lián)增加了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)能基團(tuán)相互交聯(lián)增加了酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定性。定性。天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較 酶酶 修飾劑修飾劑 修飾酶修飾酶 天然酶天然酶 處理?xiàng)l件處理?xiàng)l件(/(/時(shí)間時(shí)間) ) 殘留酶活殘留酶活(%)(%)酰苷脫氫酶酰苷脫氫酶 胰蛋白酶胰蛋白酶 過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶 溶菌酶溶菌酶 尿激

28、酶尿激酶糜蛋白酶糜蛋白酶 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 右旋糖苷右旋糖苷 人血清白蛋白人血清白蛋白 肝肝 素素 37/100min37/100min 100/30min100/30min 50/10min50/10min 100/30min100/30min 37/48h37/48h 37/24h37/24h 7070 100100 4646 6464 4040 9090 2020 9999 8080 0 0 9595 5050二抗原性二抗原性（）抗原性）抗原性：修飾酶的抗原性與修飾劑有關(guān)，目修飾酶的抗原性與修飾劑有關(guān)，目前比較公認(rèn)的是前比較公認(rèn)的是PEGPEG和和人血

29、清白蛋白人血清白蛋白在消除酶分子在消除酶分子抗原性方面效果較好?？乖苑矫嫘Ч^好。酶酶L-Asn L-Asn 酶酶SODSOD酶酶 Gln-Aln Gln-Aln 酶酶尿酸酶尿酸酶腺苷脫氫酶腺苷脫氫酶Arg Arg 酶酶過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶胰蛋白酶胰蛋白酶抗原性抗原性修飾劑修飾劑 - - 葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶核糖核酸酶酶核糖核酸酶酶PEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-AlaPoly-DL-Ala消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除消消 除除降降 低低降降 低低消消 除除修飾酶的抗原

30、性變化修飾酶的抗原性變化三三. 對(duì)各類失活因子的抵抗力對(duì)各類失活因子的抵抗力: 化學(xué)修飾酶與天然酶相比，對(duì)蛋白酶、化學(xué)修飾酶與天然酶相比，對(duì)蛋白酶、抑制劑等失活因子的抵抗力均有不同程抑制劑等失活因子的抵抗力均有不同程度的提高。度的提高。天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較酶酶抗抑制劑抗抑制劑抗蛋白酶抗蛋白酶修飾劑修飾劑抗失活劑抗失活劑過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶核糖核酸酶核糖核酸酶溶菌酶溶菌酶胰蛋白酶胰蛋白酶 - - 葡萄糖苷葡萄糖苷酶酶尿激酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷白蛋白白蛋白右旋糖苷右旋糖苷抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗蛋白酶抗蛋白

31、酶抗糜蛋白酶抗糜蛋白酶抗胰蛋白酶抗胰蛋白酶抗抗SDSSDS抗大豆抑制劑抗大豆抑制劑抗胃蛋白酶抗胃蛋白酶抗胎盤抑制劑抗胎盤抑制劑抗尿素抗尿素抗抗SDSSDS四四. 修飾酶在體內(nèi)的半衰期：修飾酶在體內(nèi)的半衰期：多數(shù)修飾酶在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。多數(shù)修飾酶在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。天然酶與修飾酶的半衰期比較天然酶與修飾酶的半衰期比較酶酶羧肽酶羧肽酶Arg Arg 酶酶Gln-AsnGln-Asn酶酶尿酸酶尿酸酶超氧化物岐化酶超氧化物岐化酶過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化氫酶修飾劑修飾劑半衰期半衰期天然酶天然酶修飾酶修飾酶白蛋白白蛋白白蛋白白蛋白糖肽糖肽右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷PEGPEG3.5h3.5h17h17h1.4h1.4h1h1h4h4h6min6min6h6h12h12h8h8h20h20h4h4h8h8h五最適五最適pH最適最適pH: 大多數(shù)酶經(jīng)化學(xué)修飾后，最適大多數(shù)酶經(jīng)化學(xué)修飾后，最適pH發(fā)生發(fā)生了變化，這在應(yīng)用上具有重要意義。了變化，這在應(yīng)用上具有重要意義。天然酶與修飾酶的最適天然酶與修飾酶的最適pHpH酶酶修飾酶修飾酶天然酶天然酶修飾劑修飾劑糜蛋白酶