兔大電導(dǎo)鈣敏感性鉀離子通道β亞基的克隆及生物信息學(xué)分析(1)

1、    兔大電導(dǎo)鈣敏感性鉀離子通道亞基的克隆及生物信息學(xué)分析(1)    】 目的：克隆新西蘭白兔大電導(dǎo)鈣敏感性鉀離子通道(BKCa)亞基基因，觀察其組織分布，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析. 方法：采用3及5cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)及RTPCR技術(shù)從兔Oddi括約肌(SO)組織獲得BKCa通道亞基的全長cDNA序列. 并應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析該基因的同源性、蛋白結(jié)構(gòu)域及跨膜拓?fù)浣Y(jié)構(gòu). 結(jié)果：兔BKCa通道亞基基因cDNA全長為1168 bp，開放讀窗長度為576 bp，編碼191個(gè)氨基酸. 生物信息學(xué)分析表明該

2、基因核酸序列及氨基酸序列與人類及其它哺乳動(dòng)物有很高的同源性；拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為兩次跨膜蛋白，具有4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，含有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)及2個(gè)N糖基化位點(diǎn). 結(jié)論：首次成功地從兔SO組織克隆出BKCa通道亞基基因，獲得新GenBank號 DQ821756，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定了基礎(chǔ). 【關(guān)鍵詞】 鈣敏感性鉀離子通道0引言大電導(dǎo)鈣敏感性鉀離子通道(large conductance Ca2 sensitive K channels, BKCa)廣泛分布于平滑肌細(xì)胞(SMC)，其主生理作用是調(diào)節(jié)SMC膜電位和肌張力1. BKCa通道是由亞基和亞基共同組成，其中亞基是結(jié)構(gòu)亞基，構(gòu)成孔道，表達(dá)量較恒定；亞基

3、是調(diào)節(jié)亞基，可提高通道對鈣離子的敏感性，表達(dá)量的高低同該通道的功能狀態(tài)密切相關(guān)2. 但目前GenBank尚未發(fā)布兔BKCa通道亞基的基因序列，因此獲得這段基因序列成為下一步研究的關(guān)鍵. 我們根據(jù)已知新西蘭白兔部分組織BKCa通道亞基保守區(qū)序列(GenBank Number: AB009313, AF107300, AY829265)設(shè)計(jì)引物，直接體外擴(kuò)增兔Oddi括約肌(sphincter of Oddi, SO)細(xì)胞BKCa通道亞基基因的cDNA全長序列，并采用生物信息學(xué)方法對該基因的特征進(jìn)行分析.1材料和方法1.1材料新西蘭白兔8只， 雌雄不拘， 體質(zhì)量2.02.5 kg（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)

4、動(dòng)物中心）； Trizol RNA抽提試劑（Invitrogen公司）；3及5 RACE試劑盒First Choice RLMRACE Kit（美國Ambion公司）；DNA Marker，RTPCR Kit，T4 DNA連接酶，Taq酶，pMD18T載體，限制性內(nèi)切酶等（大連TaKaRa公司）；IPTG，Xgal（北京鼎國生物技術(shù)公司）；瓊脂糖凝膠回收試劑盒及產(chǎn)物純化試劑盒（上海博亞生物技術(shù)公司）；PCR儀（美國BioRad公司）；寡核苷酸引物合成及測序由北京三博生物技術(shù)公司完成.1.2.1兔SO細(xì)胞總RNA的提取經(jīng)兔耳緣靜脈快速注入約10 mL空氣將兔處死，快速銳性無菌分離SO段，取出后用

5、4生理鹽水沖洗. 于解剖顯微鏡下刮除漿膜及結(jié)締組織，縱形切開SO段，刮去黏膜組織，用組織剪將其剪成約100 mg小塊，加入4 Trizol 1 mL中. 使用高速組織勻漿機(jī)將組織塊完全粉碎后，4離心10 min，棄沉淀，將上清轉(zhuǎn)移至新的1 mL離心管中. 按照Trizol一步法取試劑盒說明進(jìn)行RNA的提取. 抽提出的RNA經(jīng)凝膠電泳鑒定RNA質(zhì)量，于紫外分光光度計(jì)260 nm和280 nm處鑒定RNA的純度及濃度.1.2.23及5 cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，所采用引物見表1. 5 RACE的主步驟及反應(yīng)條件： 1 g總RNA經(jīng)CIP和TAP處理；連接5 RACE

6、接頭； 5 RACE readycDNA；巢氏PCR擴(kuò)增：以5 Race readycDNA為模板，以試劑盒提供的5 RACE Outer Primer和5 RACE Inner Primer為上游引物，在序列保守區(qū)設(shè)計(jì)了2條下游引物5OGP和5IGP. 5 RACE第1輪PCR反應(yīng)采用引物5OP和5OGP，反應(yīng)條件為: 94 3 min；94 30 s，62 30 s，72 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 7 min. 取第1輪PCR產(chǎn)物2 mL進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)，引物為5IP和5IGP，反應(yīng)條件為: 94 1 min；94 30 s，68 30 s，72 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 10

7、 min. 3 RACE的主步驟及反應(yīng)條件： 3 RACE readycDNA；巢氏PCR擴(kuò)增：以3 RACE ready cDNA為模板，以試劑盒提供的3 RACE Outer Primer和3 RACE Inner Primer為上游引物，在序列保守區(qū)設(shè)計(jì)了2條上游引物3OGP和3IGP. 3 RACE第1輪PCR反應(yīng)采用引物3OP和3OGP，反應(yīng)條件為: 94 3 min；94 30 s, 58 30 s, 72 1 min, 35個(gè)循環(huán)；72 7 min. 取第1輪PCR產(chǎn)物2 mL進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)，引物為3IP和3IGP，反應(yīng)條件為: 94 1 min；94 30 s，65 30

8、 s，72 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 10 min.PCR 擴(kuò)增BKCa通道亞基cDNA序列全長提取兔SO組織的總RNA，使用Reverse Transcriptase MMLV，以總RNA為模板，以O(shè)ligo dT為隨機(jī)引物，分別將各種組織的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA. 然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 mL；引物設(shè)計(jì)參照3和5 RACE測序結(jié)果，上下游引物分別為RUP和RLP（表1），反應(yīng)條件為：94 1 min；94 30 s, 68 30 s, 72 90s, 36個(gè)循環(huán)；72 10 min.表1本實(shí)驗(yàn)用到的引物序列略1.2.4擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆測序PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠上

9、電泳與DNA marker比較判斷產(chǎn)物的大小，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化，與pMD18T載體相連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5，轉(zhuǎn)化的菌液鋪制在IPTG和Xgal的Amp陽性LB平板上，通過藍(lán)白篩選挑選單克隆菌落，按常規(guī)方法提取質(zhì)粒，并用Hind和BamH雙酶切，鑒定正確克隆送北京三博遠(yuǎn)志公司測序.1.2.5生物信息學(xué)分析基因序列同源性分析登陸美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)，使用Blastn在核酸數(shù)據(jù)庫中對BKCa通道亞基的核酸序列進(jìn)行同源性比對；使用Blastp在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中對BKCa通道亞基編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比對. 使用保守序列數(shù)據(jù)庫(CDD)尋找亞基編碼氨基酸序列是否和已知保

10、守序列相關(guān)，在線對兔(Rabbit), 人類(Homo sapiens), 獼猴(Macaca mulatta), 黑猩猩(Pan troglodytes), 大鼠(Rattus norvegicus), 小鼠(Mus musculus), 家犬(Canis)和牛(Bos Taurus)的該基因序列進(jìn)行同源分析. 并采用蛋白分析專家系統(tǒng)ExPASy的Protein knowledgebase (UniProtKB/SwissProt)數(shù)據(jù)庫、在線軟件TMHMM Server v.2.0 ( http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 預(yù)測該蛋白的結(jié)構(gòu)域及膜蛋白拓

11、撲結(jié)構(gòu).2結(jié)果2.15 RACE擴(kuò)增以正常新西蘭白兔SO組織總RNA為模板，經(jīng)5 RACE擴(kuò)增，產(chǎn)物以10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析，擴(kuò)增條帶大小約為600 bp (圖1). 經(jīng)克隆測序，測序結(jié)果與GenBank中該基因的部分保守區(qū)序列完全一致.            作者：張孝勇，崔光彬，杜滂，馬克軍，王亞蓉，韓葦，顏真，張英起，魏經(jīng)國【摘】目的：克隆新西蘭白兔大電導(dǎo)鈣敏感性        

12、本篇論文是由3COME文檔頻道的網(wǎng)友為您在網(wǎng)絡(luò)上收集整理餅投稿至本站的，論文版權(quán)屬原作者，請不用于商業(yè)用途或者抄襲，僅供參考學(xué)習(xí)之用，否者后果自負(fù)，如果此文侵犯您的合法權(quán)益，請聯(lián)系我們。    圖1BKCa通道亞基5 RACE擴(kuò)增結(jié)果略2.23 RACE擴(kuò)增以正常新西蘭白兔SO組織總RNA為模板，經(jīng)3 RACE擴(kuò)增，產(chǎn)物以10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析為單一擴(kuò)增條帶，大小約為850 bp(圖2). 經(jīng)克隆測序，測序結(jié)果與GenBank中該基因的部分保守區(qū)序列完全一致.圖2BKCa通道亞基3 RACE 擴(kuò)增結(jié)果略2.3RTPCR擴(kuò)增BKCa通道亞基cDN

13、A序列全長從正常新西蘭白兔SO組織中提取總RNA，經(jīng)RTPCR擴(kuò)增，產(chǎn)物以10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分析為單一擴(kuò)增條帶，大小約為1200 bp(圖3). 經(jīng)克隆測序，cDNA長度為1168 bp，3及5端測序結(jié)果與RACE測序結(jié)果完全一致.圖3BKCa通道亞基cDNA全長序列擴(kuò)增結(jié)果略2.4.1同源性比對新西蘭白兔SO細(xì)胞BKCa通道亞基的cDNA序列總長度為1168 bp，由4個(gè)外顯子拼接而成，其長度分別是154，158，172，655 bp. 其中Exon1不編碼，從Exon2的第25位堿基開始編碼，ORF長度為576 bp，編碼191個(gè)氨基酸. 通過NCBI核酸同源程序Blastn及蛋

14、白同源程序Blastp分析表明，兔的不同組織間該基因編碼區(qū)核酸及氨基酸序列的同源性為100%；cDNA全長序列與兔腦、骨骼肌、腎臟連接管和主動(dòng)脈組織該亞基cDNA序列一致性分別為99%，98%，97%，99%. 通過與人類等其它哺乳動(dòng)物的同源比對，其編碼區(qū)核酸及氨基酸序列的一致性如表2所示，可見BKCa通道亞基基因在種屬間具有很高的一致性.表2兔BKCa通道亞基與其他種屬的同源性比對略2.4.2蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測經(jīng)ExPASy中的UniProtKB/SwissProt數(shù)據(jù)庫分析顯示，該蛋白有4個(gè)功能結(jié)構(gòu)域，分別位于第820，3548，7891及93107位氨基酸（圖4）. 第14位蘇氨酸T為可能的

15、蛋白激酶A(PKA)磷酸化位點(diǎn)；第80位及142位天冬酰胺為可能的N糖基化位點(diǎn).圖4兔SO細(xì)胞BKCa通道亞基氨基酸序列功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測略2.4.3跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測在線蛋白結(jié)構(gòu)拓?fù)浞治鲕浖MHMM Server v. 2.0預(yù)測顯示，該亞基有兩個(gè)跨膜區(qū)，分別位于第1636位氨基酸和158178位氨基酸區(qū)，第2外顯子部分氨基酸構(gòu)成第1跨膜段，第3外顯子全部位于細(xì)胞外，第4外顯子的部分氨基酸構(gòu)成第2跨膜段. 該蛋白的N末端和C末端均在細(xì)胞內(nèi)（圖5）.圖5兔SO細(xì)胞BKCa通道亞基的跨膜結(jié)構(gòu)示意圖略3討論亞基是BKCa通道的調(diào)節(jié)亞基，通過感受Ca2 i及電壓的變化調(diào)控BKCa的動(dòng)力學(xué)特性，在調(diào)控細(xì)胞膜電

16、位及肌張力過程中對細(xì)胞膜的極化狀態(tài)起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用3. 我們前期的研究發(fā)現(xiàn)高膽固醇條件下，兔SO細(xì)胞Ca2 i呈過載狀態(tài)4，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)高膽固醇血癥兔的BKCa通道活性降低5. 由于亞基是BKCa通道的調(diào)節(jié)亞基，對調(diào)節(jié)Ca2 i起重作用. 我們采用快速、靈敏的RACE6技術(shù)擴(kuò)增兔SO組織BKCa通道亞基序列，該技術(shù)從操作及引物設(shè)計(jì)上都有一定難度，在實(shí)驗(yàn)中我們先是根據(jù)其同源序列設(shè)計(jì)簡并引物，反復(fù)進(jìn)行RTPCR預(yù)實(shí)驗(yàn)以提高PCR擴(kuò)增的特異性，然后在PCR條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上進(jìn)行RACE實(shí)驗(yàn)，最終經(jīng)RTPCR擴(kuò)增得到這段基因序列(GenBank number: DQ821756, http:/www.

17、/entrez/viewer.fcgi?db=nucleotide&val=110087063).生物信息學(xué)分析表明兔SO組織BKCa通道亞基基因cDNA全長為1168 bp，開放讀框位于第179752位核苷酸序列， 編碼191個(gè)氨基酸， 同兔其他組織該基因的cDNA相比較組織造成的特異性幾乎不存在，他們編碼的氨基酸序列完全一致. 測序結(jié)果顯示，該基因5端的核苷酸數(shù)目和GenBank中已有的兔其他組織該基因亞基cDNA相比分別長了92160個(gè)堿基. 而3端在終止密碼子后有加尾信號和長的polyA尾. 非編碼區(qū)僅有少數(shù)堿基的突變. 這些特點(diǎn)符合基因全長cD

18、NA序列結(jié)構(gòu)的特點(diǎn). 同源性分析顯示該基因與人類、獼猴、黑猩猩、大鼠、小鼠、家犬和牛等哺乳動(dòng)物的核苷酸序列及氨基酸序列都具有很高的同源性，說明該基因序列十分保守7. 進(jìn)一步分析顯示該亞基屬于膜蛋白，具有兩個(gè)跨膜螺旋區(qū)，N端沒有信號肽存在，由位于胞內(nèi)的C末端和N末端以及一個(gè)長的胞外段組成. 該亞基存在有4個(gè)結(jié)構(gòu)功能域，并且有1個(gè)蛋白激酶A(PKA)磷酸化位點(diǎn)及2個(gè)可能的N糖基化位點(diǎn). 這些性質(zhì)和GenBank中兔的其他組織的亞基的分析結(jié)果完全相似8.總之，我們采用cDNA末端快速擴(kuò)增及RTPCR技術(shù)首次從兔SO細(xì)胞擴(kuò)增出BKCa通道亞基全長cDNA序列，并采用生物信息學(xué)的方法分析了其種屬間的同源

19、性，預(yù)測了該基因的各種功能結(jié)構(gòu)域，為進(jìn)一步研究該基因的功能和調(diào)控奠定了基礎(chǔ).【參考文獻(xiàn)】1 Martens JR, Gelband CH. Ion channels in vascular smooth muscle: alterations in essential hypertension J. Proc Soc Exp Biol Med, 1998, 218(3):192-203.2 Kotlikoff M, Hall I. Hypertension: beta testingJ. J Clin Invest, 2003,112 (5):654-656.3 Nari K, Joonyong C, Euiyong K, et al. Changes in the Ca2 activated K channels of the coronary artery during left ventricular hypertrophyJ. Circ Res, 2003, 93(6):541-547.4 Wang XJ