FA-VD-115 復方薄荷腦鼻液微生物限度檢查方法驗證方案

1、解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院題 目：復方薄荷腦滴鼻液微生物限度檢查方法驗證方案編 號：FA-VD-115版 本 號：01頁 次：1/7頒發(fā)部門：質量管理機構生效日期：2015/5/1分發(fā)部門：質量部門制 定 人：陳飛審 核 人：黎春彤批 準 人：馬建麗制定日期：2015/4/1審核日期：2015/4/20批準日期：2015/4/30復方薄荷腦滴鼻液微生物限度檢查方法驗證方案1 目的根據(jù)中國藥典2015版草案中的相關規(guī)定，建立復方薄荷腦滴鼻液的微生物限度檢查方法，并對其進行驗證，保證其檢驗方法的科學性，使檢驗結果準確可靠。2 范圍本驗證方案適用于復方薄荷腦滴鼻液的微生物限度檢查方法的驗證。3 人員與

2、職責質量控制人員負責驗證方案與報告的起草，并按照批準的方案實施，完成檢驗相關數(shù)據(jù)的采集；質量保證人員負責驗證方案和報告的審核；質量管理負責人負責驗證方案和報告的批準。4 培訓本方案實施前應對參加驗證人員進行培訓，并做好培訓記錄確保進行驗證的人員均能熟悉、掌握驗證過程。5 驗證方案5.1 制劑信息復方薄荷腦滴鼻液為薄荷腦和樟腦溶于液體石蠟配制而成，為油性基質，臨床用于干燥性、萎縮性鼻炎。其質量標準中規(guī)定應進行微生物限度檢查，每1ml樣品中細菌數(shù)不得超過100cfu，霉菌和酵母菌數(shù)不得超過10cfu，并不得檢出大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。根據(jù)以上特點，本方案中按中國藥典2015版草案

3、非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（1105）和非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法（1106）中相關要求，決定采用稀釋劑乳化法制備供試品溶液；采用平皿法中的傾注法對供試品中的需氧菌總數(shù)及霉菌和酵母菌總數(shù)進行計數(shù)，根據(jù)草案對其質量標準中規(guī)定的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌進行檢查，并對所選用的計數(shù)和檢查方法進行驗證。解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院題 目：復方薄荷腦滴鼻液微生物限度檢查方法驗證方案編 號：FA-VD-115版 本 號：01頁 次：7/75.2 微生物限度檢查法概述5.2.1 微生物限度檢查法系檢查非滅菌制劑及其原料藥、輔料受微生物污染程度的方法。檢查項目包括需氧菌總數(shù)計

4、數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)及控制菌檢查。微生物計數(shù)法系用于能在有氧條件下生長的嗜溫細菌和真菌的計數(shù)。控制菌檢查法系用于在規(guī)定的試驗條件下，檢查供試品中是否存在特定的微生物。5.2.2 微生物計數(shù)試驗和控制菌檢查試驗應在受控潔凈環(huán)境下（D級）的局部潔凈度不低于B級的單向流空氣區(qū)域內進行。檢驗全過程必須嚴格遵守無菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物的檢出。單向流空氣區(qū)域、工作臺面及環(huán)境應定期進行監(jiān)測。5.2.3 本方案中的檢驗量即一次試驗所用的供試品量（ml）。除另有規(guī)定外，一般供試品的檢驗量為10ml。檢驗時應從2個以上最小包裝單位中抽取供試品。一般應隨機抽取供試品，取規(guī)定容器

5、數(shù)，混合，取規(guī)定量供試品進行檢驗。5.2.4 本方案中所使用的試驗菌株的傳代次數(shù)不得超過5代（從菌種保藏中心獲得的干燥菌種為第0代），并采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株的生物學特性。制備菌液時應估算菌液中的含菌量，以便于控制加入試驗菌的菌量，估算時可采用顯微鏡直接計數(shù)法確定。5.2.5 本方案中需氧菌總數(shù)是指胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括真菌菌落數(shù)），霉菌和酵母菌總數(shù)是指沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上生長的總菌落數(shù)（包括細菌菌落數(shù)）。5.2.6 本方案中微生物計數(shù)結果中需氧菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于300cfu的稀釋級、霉菌和酵母菌總數(shù)測定宜選取平均菌落數(shù)小于100cfu

6、的稀釋級，作為菌數(shù)報告（取兩位有效數(shù)字）的依據(jù)。取最高的平均菌落數(shù)，計算1ml供試品中所含的微生物數(shù)。如各稀釋級的平皿均無菌落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均菌落數(shù)小于1時，以1乘以最低稀釋倍數(shù)的值報告菌數(shù)?？刂凭鷻z查中應取相當于1mL供試品的供試液進行試驗。5.3 驗證所需培養(yǎng)基、儀器設備5.3.1 試驗用培養(yǎng)基pH 7.0 無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）；麥康凱液體培養(yǎng)基；麥康凱瓊脂培養(yǎng)基；甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基；溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基；本方案中所使用

7、的培養(yǎng)基均應為購自中國食品藥品檢定研究院或由其他單位購買但經(jīng)過適用性檢查合格的脫水培養(yǎng)基，配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。5.3.2 儀器設備100級凈化工作臺；BSC-1100-L II A型生物安全柜；BP-II型藥物天平；HHW21型電熱恒溫水浴箱；HY35型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；LRH-250A型生化培養(yǎng)箱；三洋MLS-3780型高壓滅菌鍋。5.4 微生物計數(shù)方法驗證5.4.1 菌種及菌液制備5.4.1.1 金黃色葡萄球菌CMCC（B）26 003取金黃色葡萄球菌接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上，于3035、培養(yǎng)1824小時，取其新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制

8、成每1ml含菌量約為5000cfu的菌懸液。5.4.1.2 銅綠假單胞菌CMCC（B）10 104取銅綠假單胞菌接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上，于3035、培養(yǎng)1824小時，取其新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每1ml含菌量約為5000cfu的菌懸液。5.4.1.3 枯草芽孢桿菌CMCC（B）63 501取枯草芽孢桿菌接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上，于3035、培養(yǎng)1824小時，取其新鮮培養(yǎng)物，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每1ml含菌量約為5000cfu的菌懸液。5.4.1.4 白色念珠菌CMCC（F）98 001取白色念珠菌接種于沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基上，

9、于2025、培養(yǎng)23天，取其新鮮培養(yǎng)物，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每1ml含菌量約為5000cfu的菌懸液。5.4.1.5 黑曲霉CMCC（F）98 003取黑曲霉接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，于2025、培養(yǎng)57天，或直到獲得豐富的孢子時，取其新鮮培養(yǎng)物加入35ml含0.05聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，反復吹吸將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每1ml含菌量約為5000cfu的黑曲霉孢子懸液。5.4.2 菌液的保存菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在28，

10、可在24小時內使用。穩(wěn)定的黑曲霉孢子懸液可保存在28，在驗證過的貯存期內使用。5.4.3 供試液制備取供試品10g，加入至含10g無菌的聚山梨酯80的燒杯中，于40的水浴中充分混勻，加入溫度不超過40的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，迅速攪拌乳化，制成110供試液。按下列要求進行供試液的接種和稀釋，制備微生物回收試驗用供試液。所加菌液的體積應不超過供試液體積的1%。供試液從制備至加入檢驗用培養(yǎng)基不得超過1小時。（1） 試驗組 取上述制備好的供試液，加入1ml試驗菌液，混勻，每1ml供試液中含菌量約為50cfu。（2） 供試品對照組 取制備好的供試液，以稀釋液（溫度不超過45的

11、pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）代替菌液同試驗組操作。（3） 菌液對照組 取稀釋液（溫度不超過45的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液）替代供試液，按試驗組操作加入試驗菌液并進行微生物回收試驗。5.4.4 陰性對照為確認試驗條件是否符合要求，應進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。如陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。5.4.5 供試品中微生物的回收按照“菌種及菌液制備”項中所列的各試驗菌應逐一進行微生物回收試驗。取照上述“供試液的制備”、“接種和稀釋”制備的供試液1ml，置直徑90mm的無菌平皿中，注入1520ml溫度不超過45熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞

12、菌、枯草芽孢桿菌）或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（白色念珠菌、黑曲霉），混勻，凝固，倒置培養(yǎng)（胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度3035，培養(yǎng)時間不超過3天；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度2025，培養(yǎng)時間不超過5天）。觀察菌落生長情況，點計平板上生長的所有菌落數(shù)，菌落蔓延生長成片的平皿不宜計數(shù)。每株試驗菌每種培養(yǎng)基至少制備2個平皿，以算術均值作為計數(shù)結果。同法測定供試品對照組及菌液對照組菌數(shù)，計算各試驗組的平均菌落數(shù)。5.4.6 結果判斷試驗組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值應在0.52范圍內。若各試驗菌的回收試驗均符合要求，則方法驗證通過，可照所用的供試液制備方法及計數(shù)方法進行

13、該供試品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計數(shù)；若采用上述方法還存在一株或多株試驗菌的回收達不到要求，那么可采用增加稀釋液、培養(yǎng)基體積或加入適宜的中和劑、滅活劑來消除供試品的抑菌活性，并重新進行計數(shù)方法適用性驗證，根據(jù)結果選擇回收最接近要求的方法和試驗條件進行供試品的檢查。5.5 控制菌檢查方法驗證5.5.1 大腸埃希菌檢查方法5.5.1.1 供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品10g，加入至含10g無菌的聚山梨酯80的燒杯中，于40的水浴中充分混勻，加入溫度不超過40的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，迅速攪拌乳化，制成110供試液。取10ml供試液，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基

14、中，混勻，3035培養(yǎng)1824小時。5.5.1.2 選擇和分離培養(yǎng)取上述預培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中，4244培養(yǎng)2448小時。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872小時。5.5.1.3 結果判斷若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為大腸埃希菌；若麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出大腸埃希菌。5.5.2 金黃色葡萄球菌檢查方法5.5.2.1 供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品10g，加入至含10g無菌的聚山梨酯80的燒杯中，于40的水浴中充分混勻，加入溫度不

15、超過40的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，迅速攪拌乳化，制成110供試液。取10ml供試液，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824小時。5.5.2.2 選擇和分離培養(yǎng)取上述預培養(yǎng)物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872小時。5.5.2.3 結果判斷若甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上有黃色菌落或外周有黃色環(huán)的白色菌落生長，應進行分離、純化及適宜的鑒定試驗，確證是否為金黃色葡萄球菌；若平板上沒有與上述形態(tài)特征相符或疑似的菌落生長，或雖有相符或疑似的菌落生長但鑒定結果為陰性，判供試品未檢出金黃色葡萄球菌。5.5.3 銅綠假單胞菌檢查方法

16、5.5.3.1 供試液制備和增菌培養(yǎng)取供試品10g，加入至含10g無菌的聚山梨酯80的燒杯中，于40的水浴中充分混勻，加入溫度不超過40的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，迅速攪拌乳化，制成110供試液。取10ml供試液，接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，3035培養(yǎng)1824小時。5.5.3.2 選擇和分離培養(yǎng)取上述預培養(yǎng)物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上，3035培養(yǎng)1872小時。取上述平板上生長的菌落進行氧化酶試驗，或采用其它適宜方法進一步鑒定。5.5.3.3 氧化酶試驗將潔凈濾紙片置于平皿內，用無菌玻棒取上述平板上生長的菌落涂于濾紙片上，滴加新配制

17、的1%二鹽酸二甲基對苯二胺試液，在30秒內若培養(yǎng)物呈粉紅色并逐漸變?yōu)樽霞t色為氧化酶試驗陽性，否則為陰性。5.5.3.4 結果判斷若溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基平板上有菌落生長，且氧化酶試驗陽性，應進一步進行適宜的鑒定試驗，確證是否為銅綠假單胞菌。如果平板上沒有菌落生長，或雖有菌落生長但鑒定結果為陰性，或氧化酶試驗陰性，判供試品未檢出銅綠假單胞菌。5.5.4 檢查方法驗證5.5.4.1 菌液制備取大腸埃希菌CMCC（B）44 102、金黃色葡萄球菌CMCC（B）26 003或銅綠假單胞菌CMCC（B）10 104接種于胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基上，于3035、培養(yǎng)1824小時，取其新鮮培養(yǎng)物，用pH

18、7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成每1ml含菌量約為50cfu的菌懸液。菌液制備后若在室溫下放置，應在2小時內使用；若保存在28，可在24小時內使用。5.5.4.2 適用性試驗按“大腸埃希菌檢查方法”、“金黃色葡萄球菌檢查方法”或“銅綠假單胞菌檢查方法”項，取規(guī)定量供試液及1ml相應的試驗菌液接入規(guī)定的培養(yǎng)基中；依相應的控制菌檢查方法，在規(guī)定的溫度及最短時間下培養(yǎng)，應能檢出所加試驗菌相應的反應特征。5.5.4.3 陰性對照為確認試驗條件是否符合要求，應進行陰性對照試驗，陰性對照試驗應無菌生長。如陰性對照有菌生長，應進行偏差調查。5.5.4.4 結果判斷上述試驗若檢出試驗菌，按此供試液制備法

19、和控制菌檢查方法進行供試品檢查；若未檢出試驗菌，應消除供試品的抑菌活性，并重新進行方法驗證。如果經(jīng)過試驗確證供試品對試驗菌的抗菌作用無法消除，可認為受抑制的微生物不可能存在于該供試品中，選擇抑菌成份消除相對徹底的方法進行供試品的檢查。5.6 偏差處理應嚴格按照本方案操作，如在試驗過程中微生物回收結果或控制菌檢查結果出現(xiàn)不符合要求的情況，應上報質量管理負責人，在分析問題原因后，決定是否需對本方案中設定的微生物限度檢查方法進行修改，并重新進行驗證。5.7 再驗證周期5.7.1 當復方薄荷腦滴鼻液的處方發(fā)生變動或其它因素變更導致復方薄荷腦滴鼻液的物料性質改變時，需要對本方案進行調整后作方法學再驗證。

20、5.7.2 國家相關微生物限度檢查標準修改后需要對本方法重新進行再驗證。6 參考文件中國藥典2015版草案（1105）非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法和（1106）非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法復方薄荷腦滴鼻液成品質量標準復方薄荷腦滴鼻液成品檢驗標準操作規(guī)程7 附錄附錄1 復方薄荷腦滴鼻液微生物限度檢查方法驗證報告解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院附錄1題 目：復方薄荷腦滴鼻液微生物限度檢查方法驗證報告編 號：BG-VD-115版 本 號：01頁 次：1/4復方薄荷腦滴鼻液微生物限度檢查方法驗證報告名 稱復方薄荷腦滴鼻液開始日期結束日期驗證方案復方薄荷腦滴鼻液微生物限度檢查方法驗證方案（F

21、A-VD-115）偏差情況是 否（如選是，在結果分析中詳細說明其結果和補救措施）驗證結果分析及結論：本次驗證根據(jù)中國藥典2015版草案非無菌產品微生物限度檢查：微生物計數(shù)法（1105）和非無菌產品微生物限度檢查：控制菌檢查法（1106）中相關要求，擬定了復方薄荷腦滴鼻液的微生物限度檢查方法，并使用其制劑成品（批號： ）進行了檢查方法的驗證。微生物計數(shù)的回收比值分別為：金黃色葡萄球菌： ；銅綠假單胞菌 ；枯草芽孢桿菌： ；白色念珠菌： ；黑曲霉： ；控制菌檢查的驗證結果為：大腸埃希菌：通過 未通過；金黃色葡萄球菌：通過 未通過；銅綠假單胞菌：通過 未通過。驗證結果表明本次所建立的復方薄荷腦滴鼻液

22、的微生物限度檢查方法： 。質量控制人： 日期： 年 月 日驗證報告和記錄的審核：質量保證人： 日期： 年 月 日驗證報告的批準：質量管理負責人： 日期： 年 月 日解放軍總醫(yī)院第一附屬醫(yī)院題 目：復方薄荷腦滴鼻液微生物限度檢查方法驗證報告編 號：BG-VD-115版 本 號：01頁 次：5/4微生物限度檢查方法驗證記錄名 稱批 號規(guī) 格來 源一、金黃色葡萄球菌計數(shù)方法驗證記錄試驗開始日期： 結束日期：培養(yǎng)溫度： 培養(yǎng)濕度：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（配制批號： ）培養(yǎng)箱編號：培養(yǎng)皿號試驗組供試品對照組菌液對照組陰性對照12平均菌落數(shù)結果計算試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)菌液對照組菌落數(shù)=結果判定驗證通過 驗證未通過二、銅綠假單胞菌計數(shù)方法驗證記錄試驗開始日期： 結束日期：培養(yǎng)溫度： 培養(yǎng)濕度：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（配制批號： ）培養(yǎng)箱編號：培養(yǎng)皿號試驗組供試品對照組菌液對照組陰性對照12平均菌落數(shù)結果計算試驗組菌落數(shù)-供試品對照組菌落數(shù)菌液對照組菌落數(shù)=結果判定驗證通過 驗證未通過三、枯草芽孢桿菌計數(shù)方法驗證記錄試驗開始日期： 結束日期：培養(yǎng)溫度： 培養(yǎng)濕度：胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（配制批號： ）培養(yǎng)箱編號：培養(yǎng)皿號試驗組供試品對照