2019年現(xiàn)代生物技術(shù)概論

1、生物技術(shù)原理與方法wzjhaust生物技術(shù)，也稱生物工程，是指人們以現(xiàn)代生命科學(xué)為基礎(chǔ)，結(jié)合先進(jìn)的工程技術(shù)手段和其他基礎(chǔ)學(xué)科的科學(xué)原理，按照預(yù)先的設(shè)計(jì) 改造生物體或加工生物原料，為人類生產(chǎn)出所需產(chǎn)品或達(dá)到某種目的。1.2生物技術(shù)發(fā)展簡(jiǎn)史現(xiàn)代生物技術(shù)是以 70年代DNA重組技術(shù)的建立為標(biāo)志1944年闡明了 DNA是遺傳信息的攜帶者。1953年提出了 DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型，闡明了 DNA的半保留復(fù)制模式，從而開辟了分子生物學(xué)研究的新紀(jì)元。1961年等破譯了遺傳密碼，揭開了 DNA編碼的遺傳信息是如何傳遞給蛋白質(zhì)這一秘密。1972年首先實(shí)現(xiàn)了 DNA體外重組技術(shù)，標(biāo)志著生物技術(shù)的核心技術(shù)一一基因工

2、程技術(shù)的開始基因工程技術(shù)向人們提供了一種全新的技術(shù)手段，使人們可以按照意愿在試管內(nèi)切割DNA、分離基因并經(jīng)重組后導(dǎo)人其他生物或細(xì)胞，藉以改造農(nóng)作物或畜牧品種；也可以導(dǎo)人細(xì)菌這種簡(jiǎn)單的生物體，由細(xì)菌生產(chǎn)大量的有用的蛋白質(zhì)，或作為藥物，或作為疫苗；也可以 直接導(dǎo)人人體內(nèi)進(jìn)行基因治療。顯然，這是一項(xiàng)技術(shù)上的革命。以基因工程為核心，帶動(dòng)了現(xiàn)代發(fā)酵工程、現(xiàn)代酶工程、現(xiàn)代細(xì)胞工程的發(fā) 展，形成了具有劃時(shí)代意義和戰(zhàn)略價(jià)值的現(xiàn)代生物技術(shù)。1.4生物技術(shù)應(yīng)用前景生物技術(shù)與其他高新技術(shù)一樣具有六高”的基本特征：即高效益、高智力、高投入、高競(jìng)爭(zhēng)、高風(fēng)險(xiǎn)、高勢(shì)能 .另一方面，生物技術(shù)廣闊的應(yīng)用前景，高額的利潤(rùn)也促使生

3、物技術(shù)的快速發(fā)展。生物技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域非常廣泛，它包括醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、食品、化工、林業(yè)、 環(huán)境保護(hù)、采礦冶金、材料、能源等領(lǐng)域。這些領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用必然帶來了經(jīng)濟(jì)上的巨大利益。二、生物技術(shù)在醫(yī)藥方面的應(yīng)用1、生物工程藥物2、基因診斷和治療3、基因保鍵、器官移植與干細(xì)胞基因診斷法，又稱分子診斷法或DNA探針檢測(cè)法：應(yīng)用專用的 DNA分子探針，對(duì)受檢者的特定基因（ DNA）或其轉(zhuǎn)錄本（mRNA）進(jìn)行雜交分析，從而對(duì)遺傳疾病作出診斷的技術(shù)。人類基因組計(jì)劃（HGP）1986年美國(guó)生物學(xué)家諾貝爾獎(jiǎng)獲得者Dulbecco首先倡議，全世界的科學(xué)家聯(lián)合起來從整體上研究人類的基因組，分析人類基因組的全部序列以獲

4、得人類基因所攜帶的全部遺傳信息。毫無疑問，該項(xiàng)工作的完成，將使人們深入認(rèn)識(shí)許多困擾人類 的重大疾病的發(fā)病機(jī)理；90年代的人類基因組計(jì)劃的科學(xué)意義如同60年代的登月計(jì)劃。所以繼美國(guó)之后，歐盟國(guó)家、日本、俄羅斯、加拿大、澳大利亞和我國(guó)也相繼啟動(dòng)了人類基因組計(jì)劃。三、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、乳腺反應(yīng)器及動(dòng)物克隆四、能源與環(huán)保選育可大量生產(chǎn)能源化學(xué)物質(zhì)的工程菌，開發(fā)生物來源的石油替代產(chǎn)品；選育可降解工業(yè)和生活廢棄物的工程菌，用以處理垃圾，變廢 為寶；處理工業(yè) 三廢”，石油泄漏等，解決環(huán)境污染問題。自然界有取之不盡的植物纖維生物學(xué)家們正嘗試運(yùn)用生物技術(shù)開發(fā)出能夠?qū)⒅参镏械睦w維素降解進(jìn)而轉(zhuǎn)化為可以燃燒的酒精等新能源。

5、 素資源，這項(xiàng)技術(shù)的突破有可能成為能源技術(shù)的新方向。我國(guó)麻瘋樹、黃連木等油料植物可滿足500萬t/a生物柴油裝置的原料需求微生物降解農(nóng)藥殘留1.5生物技術(shù)安全性1234人身健康道德倫理社會(huì)安定生態(tài)安全生物武器是窮弱國(guó)家的基因的食物鏈轉(zhuǎn)移器官移植（頭顱移植）克隆人、生物武器試驗(yàn)室安全、基因漂移 殺手銅”。1.6生物技術(shù)在國(guó)民社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中的地位人類基因組計(jì)劃（HGP）解決能源危機(jī)、治理環(huán)境污染；環(huán)境保護(hù)，制造工業(yè)原料；生產(chǎn)貴重金屬國(guó)家安全生物武器和反生物武器經(jīng)濟(jì)發(fā)展政治地位2植物組織培養(yǎng)技術(shù)原理及操作1、植物組織培養(yǎng)：是指在離體條件下利用人工培養(yǎng)基對(duì)植物器官、組織、細(xì)胞、原生質(zhì)體等進(jìn)行培養(yǎng)，使其

6、長(zhǎng)成完整的植株。2、應(yīng)用領(lǐng)域：（1）、快速繁殖（2）、種苗脫毒（3）、遠(yuǎn)緣雜交（4）、突變育種（5）、基因工程（6）、生物制品（7）、遺傳、生理、生化、病理研究（8）、植物種質(zhì)資源保存和交換外植體：在植物細(xì)胞組織培養(yǎng)中，由活體植物體上提取下來的，接種在培養(yǎng)基上的無菌細(xì)胞、組織、器官等均稱為外植體。愈傷組織：在植物細(xì)胞組織培養(yǎng)中，愈傷組織則指在人工培養(yǎng)基上由外植體形成的一團(tuán)無序生長(zhǎng)的薄壁細(xì)胞。3、廣義的組培依外植體不同可分為：器官培養(yǎng)；莖尖分生組織培養(yǎng)；愈傷組織培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)；原生質(zhì)體培養(yǎng)4、植物組培特點(diǎn)培養(yǎng)條件可以人為控制生長(zhǎng)周期短，繁殖率高管理方便，利于工廠化生產(chǎn)和自動(dòng)化控制5、植物細(xì)胞的全

7、能性：植物細(xì)胞具有該植物體全部遺傳的可能性，在一定條件下具有發(fā)育成完整植物體的潛在能力。1原理：生物體的每一個(gè)細(xì)胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個(gè)體所必需的全部基因，從理論上講，生物 體的每一個(gè)活細(xì)胞都應(yīng)該具有全能性。2差異：（1）受精卵的全能性最高（2）受精卵分化后的細(xì)胞中，體細(xì)胞的全能性比生殖細(xì)胞的低。3潛在全能性的原因：基因表達(dá)的選擇性6、脫分化：來自已分化組織的已停止分裂的細(xì)胞從植物體部分的抑制性影響下解脫出來，恢復(fù)細(xì)胞的分裂活性。7、再分化）：經(jīng)脫分化的組織或細(xì)胞在一定的培養(yǎng)條件下可有轉(zhuǎn)變?yōu)楦鞣N不同細(xì)胞類型的能力。8、一個(gè)成熟細(xì)胞或分化細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為分生狀態(tài)的過程

8、，即形成愈傷組織的過程 ，叫做脫分化9、再分化： 由愈傷組織能再形成完整的植株，這一過程叫做再分化，或簡(jiǎn)單地叫做分化或再生。10、細(xì)胞全能性：指一個(gè)完整的植物細(xì)胞擁有形成一個(gè)完整植株所必需的全部遺傳信息。11、細(xì)胞分裂：植物組織培養(yǎng)屬無性繁殖，有絲分裂保證組織培養(yǎng)過程中細(xì)胞數(shù)量的增加。而減數(shù)分裂屬于有性繁殖細(xì)胞分裂方式的一種。12、位置效應(yīng)：植物離體活組織，延續(xù)表現(xiàn)出來原生長(zhǎng)部位的形態(tài)和特性的現(xiàn)象。因此，要根據(jù)培養(yǎng)目的選擇適宜的外值體。13、脫（去）分化和再分化：去處外植體原有的分化性狀，重新進(jìn)入新的發(fā)育分化狀態(tài)。14、組織培養(yǎng)的難易規(guī)律（易 一 > 難）1生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞 形成層細(xì)胞 薄壁細(xì)

9、胞 厚壁細(xì)胞 纖維細(xì)胞 退 化細(xì)胞2 種子花器莖下部組織 莖中部組織 冠內(nèi)部枝葉 冠外部枝葉3組培時(shí)間長(zhǎng)的植物組培時(shí)間短的植物15、植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)條件：營(yíng)養(yǎng)條件、環(huán)境條件、培養(yǎng)基配制16、培養(yǎng)基：在離體培養(yǎng)條件下，不同種植物的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)有不同的要求，甚至同一種植物不同部位的組織對(duì)營(yíng)養(yǎng)的要求也不相同，只 有滿足了它們各自的特殊要求，它們才能很好地生長(zhǎng)。因此，沒有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系 統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。17、培養(yǎng)基的種類：（1） MS培養(yǎng)基（2） B5培養(yǎng)基（3） White培養(yǎng)基（4）心培養(yǎng)基（5） KM8P培養(yǎng)基

10、18、MS培養(yǎng)基 它是1962年由Murashige和Skoog為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。特點(diǎn)是無機(jī)鹽和離子濃度較高，為較穩(wěn)定的平衡溶液。 其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適，可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要。它的硝酸鹽含量較其他培養(yǎng)基為高，廣泛地用于植物的器官、花藥、細(xì)胞和原 生質(zhì)體培養(yǎng)，效果良好。有些培養(yǎng)基是由它演變而來的。19、培養(yǎng)基的成分：（1）水（2）、大量元素（3）、微量元素（4）、有機(jī)化合物（5）、碳水化合物（6）、維生素（7）、生長(zhǎng)素類（8）、肌 醇（9）、氨基酸20、大量元素，指濃度大于 0.5mmol/L的元素等；包括（1）N（2）P（3）K（3）K21、微量元素， 指小于0.5mmol/L

11、的元素，F(xiàn)e, B , Mn , Cu, Mo, Co等。22、在培養(yǎng)基的各成分中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物是培養(yǎng)基的關(guān)鍵物質(zhì)，對(duì)植物組織培養(yǎng)起著決定性作用。IAA（ 引噪乙酸）NAA（泰乙酸）NAA和舊A廣泛用于生根，并與細(xì)胞分裂素互作促進(jìn)芽的增殖和生長(zhǎng)。IBA（ 引噪丁酸）是促進(jìn)發(fā)根能力較強(qiáng)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。在培養(yǎng)基中添加細(xì)胞分裂素有三個(gè)作用：誘導(dǎo)芽的分化促進(jìn)側(cè)芽萌發(fā)生長(zhǎng)。促進(jìn)細(xì)胞分裂與擴(kuò)大。抑制根的分化。因此，細(xì)胞分裂素多用于誘導(dǎo)不定芽的分化和莖、苗的增殖，而在生根培養(yǎng)時(shí)使用較少或用量較低。激素配比模式生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例決定著發(fā)育的方向，是愈傷組織、長(zhǎng)根還是長(zhǎng)芽。如為了促進(jìn)芽器官的分化，應(yīng)除去

12、或降低生長(zhǎng)素的濃度，或者調(diào)整培養(yǎng)基中生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的比例：高有利于根的形成和愈傷組織的形成；適中有利于根芽的分化；低有利于芽的形成。生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用甚微，一般用mg/L表示濃度。在組織培養(yǎng)中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用濃度，因植物的種類、部位、時(shí)期、內(nèi)源激素等的不同而異，一般生長(zhǎng)素濃度的使用為0.05-5mg/L,細(xì)胞分裂素0.05 10mg/Lo瓊脂的用量在6 10g/L之間，若濃度太高，培養(yǎng)基就會(huì)變得很硬，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)難以擴(kuò)散到培養(yǎng)的組織中去。若濃度過低，凝固性不好。固體培養(yǎng)基 優(yōu)點(diǎn)：在于操作簡(jiǎn)便，通氣問題易于解決，便于經(jīng)常觀察研究等；缺點(diǎn)：如培養(yǎng)物與培養(yǎng)基的接觸（即吸收）面積小，各種養(yǎng)分在瓊脂中

13、擴(kuò)散較慢，影響?zhàn)B分的充分利用，同時(shí)培養(yǎng)物排出的一些代謝廢物，聚集在吸收表面，對(duì)組織產(chǎn)生毒害作用。市售的各種瓊脂幾 乎都含有雜質(zhì)，特別是 Ca、Mg及其他微量元素。環(huán)境條件：溫度濕度滲透壓 pH值氧氣組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一，主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面29、母液（stock solution）的配制和保存在植物組織培養(yǎng)工作中，配制培養(yǎng)基是日常必備的工作。為簡(jiǎn)便起見，通常先配制一系列母液，即貯備液。所謂母液是欲配制液的濃縮液，這樣不但可以保證各物質(zhì)成分的準(zhǔn)確性及配制時(shí)的快速移取，而且還便于低溫保藏。一般母液配成比所需濃度高10-100倍。母液配制時(shí)可分別配成大量元素、微量元素、

14、鐵鹽、有機(jī)物和激素類等。配制時(shí)注意一些離子之間易發(fā)生沉淀，如Ca 2+和S042+, Ca2+、Mg2+和PO43- 一起溶解后，會(huì)產(chǎn)生沉淀，一定要充分溶解再放入母液中！。配制母液時(shí)要用蒸儲(chǔ)水或重蒸儲(chǔ)水。藥品應(yīng)選取等級(jí)較高的化學(xué)純或分析純。藥品的稱量及定容都要準(zhǔn)確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液，其中維生素、氨基酸類可以 分別配制，也可以混在一起。母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。30、母液的配制方法：1）、單配法：將培養(yǎng)基配方中的各種成分分別配成一定濃度的母液。一般用 a:b表示，即每b毫升溶液中含有a毫克溶質(zhì)。2）

15、、混配法：將幾類營(yíng)養(yǎng)成分按配方中的用量擴(kuò)大一定倍數(shù)稱量，分別溶解后每一類混合在一起定容到一定體積配成混合母液，濃度可 用a mg/L表示，即配制一升培養(yǎng)基吸取該母液a ml.生長(zhǎng)素配制時(shí)可先用少量 95%酒精助溶。2, 4D可用0.1mol/L的NaOH或KOH助溶，加入溫水定容。生長(zhǎng)素常配成1mg/ml的溶液貯于冰箱中備用。細(xì)胞分裂素類一般先用少量1N鹽酸溶解后，再加入溫水冷卻后定容，3）、鐵鹽配法（MS為例）：在裝有400ml蒸儲(chǔ)水的燒杯中加入 2粒苛性鈉，溶解后加入 3.73g EDTA-Na2 ,加熱使其全部溶解，然后 邊攪拌邊慢慢加入2.78g FeSO4.7H2O直至全部溶解，冷卻

16、后定容至500ml,置于冰箱中備用。31、培養(yǎng)基的配制：按表用量筒移取大量元素母液100ml,用專一對(duì)應(yīng)的移液管分別吸取微量元素母液10mi、鐵鹽母液10ml、有機(jī)物母液10ml,均置人1000ml定容瓶中，若不加任何激素，則為 MSo培養(yǎng)基；若需加激素按配方移取激素母液即可。將已裝母液的定容瓶用 蒸儲(chǔ)水或自來水定容到 1000ml,取1/3左右倒人小鋁鍋中加熱。同時(shí)，稱好 30g蔗糖，稱瓊脂絲7g（或瓊脂粉），也傾人小鋁鍋中，邊加熱 邊攪拌，防止糊底。旺火煮開，再用文火加熱，直至瓊脂全部融化即清澈見底為度。（若用瓊脂粉，應(yīng)加入 100ml左右的液體培養(yǎng)基，并攪 拌均勻）o然后再傾人定容瓶余下

17、的液體培養(yǎng)基，搖晃均勻即可。培養(yǎng)基配好后，要調(diào)整 pH值。用0. 1M的NaOH或HCl液調(diào)成5. 8pH值左右。在培養(yǎng)基配方不大變動(dòng)的情況下可用經(jīng)驗(yàn)法?？梢詫?連續(xù)三次測(cè)定所加入的酸或堿液的平均值作為以后調(diào)整的用量值。調(diào)后注意一定要搖動(dòng)均勻，還要注意酸或堿液不要放置時(shí)間太久。33、培養(yǎng)基的分裝與滅菌1）、培養(yǎng)基合成后要趁熱分裝，100ml的容器約裝入30-40ml培養(yǎng)基，即1L培養(yǎng)基約裝35瓶左右。太多則浪費(fèi)培養(yǎng)基，太少不易接種 和影響生長(zhǎng)。但要根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象來決定。如果培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)適當(dāng)多裝培養(yǎng)基，生根等短期培養(yǎng)時(shí)，可適當(dāng)少加培養(yǎng)基。分裝時(shí)不要把 培養(yǎng)基弄到管壁上，以免日后污染。裝后用封

18、口材料包上瓶口，扎口后，寫上培養(yǎng)基種類，準(zhǔn)備滅菌。注意不能放置時(shí)間過長(zhǎng)，以免產(chǎn)生污 染。2）、培養(yǎng)基用高壓滅菌。打開鍋蓋，加水至水位線。把已裝好培養(yǎng)基的三角瓶，連同蒸儲(chǔ)水及接種用具等放人鍋筒內(nèi)，裝時(shí)不要過分傾斜培養(yǎng)基，以免弄到瓶口上或流出。然后蓋上鍋蓋，對(duì)角旋緊螺絲，接通電源加熱，當(dāng)升至0. 05MPa時(shí)，打開放氣閥放氣，回 “0,'后關(guān)閉放氣閥。當(dāng)氣壓上升到 0. 10MPa時(shí)，保壓滅菌20min,到時(shí)停止加熱。當(dāng)氣壓回” 0后打開鍋蓋，取出培養(yǎng)基，放于平臺(tái)上冷凝。滅好的培 養(yǎng)基不要放置時(shí)間太長(zhǎng)，最多不能超過1周，否則，冰箱中4c保存。2.4 無菌操作技術(shù)2.4.1 滅菌滅菌是組織培

19、養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者首先要清楚有菌和無菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體，接觸自然水源的物 體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點(diǎn)，無菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺(tái)表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、 我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無論洗得多干凈等等都是有菌的。這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類及其他微生物。茵的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見。無處不在，無時(shí)不有，無孔不人。在 自然條件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量滋生。無菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過后的物體，經(jīng)其他物

20、理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體（當(dāng)然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的），高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部等等都是無菌的。 從以上可以看出：在地球表面無菌世界要比有菌世界小得多。菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消 毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過消毒，許多細(xì)菌芽抱、霉菌的厚垣抱子等不會(huì)完全殺死，即 由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過嚴(yán)格滅菌的操作空間（接種室、超凈臺(tái)、等）和使用的器皿，以及操作者

21、的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作，就叫做無菌操作。常用的滅菌方法常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，即：物理方法如干熱（烘燒和灼燒卜濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（紫外線、超聲波、微波）、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施；化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高鎰酸鉀、來蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、 酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。濕熱滅菌（培養(yǎng)基）培養(yǎng)基在制備后的24h內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是：在密閉的蒸鍋內(nèi)，其中的蒸氣不能外溢，壓力不斷上升，使水的沸點(diǎn)不斷提高，從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在o. 1MPa的壓力下

22、，鍋內(nèi)溫度達(dá)121 C。在此蒸氣溫度下，可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽抱。注意完全排除鍋內(nèi)空氣，使鍋內(nèi)全部是水蒸氣，滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法，但目的都是要排凈空氣，使鍋內(nèi)均勻升溫，保證滅菌徹底。常用方法是：關(guān)閉放氣閥，通電后，待壓力上升到O. 05MPa時(shí)，打開放氣閥，放出空氣，待壓力表指針歸零后，再關(guān)閉放氣閥。關(guān)閥再通電后，壓力表上升達(dá)到0. 1MPa時(shí)壓力0. 1-0. 15MPa, 20min。對(duì)高壓滅菌后不變質(zhì)的物品，如無菌水、栽培介質(zhì)、接種用具，可以延長(zhǎng)滅菌時(shí)間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間，既要保 壓徹底，又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低，不能隨

23、意延長(zhǎng)時(shí)間。對(duì)于一些布制品，如實(shí)驗(yàn)服、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好，高壓滅菌20-30min。高壓滅菌前后的培養(yǎng)基， 其pH值下降0.2-0.3單位。高壓后培養(yǎng)基pH值的變化方向和幅度取決于多種因素。 在高壓滅菌前用堿調(diào)高 pH 值至預(yù)定值的則相反。培養(yǎng)基中成分單一時(shí)和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時(shí)，高壓滅菌后的pH值變化幅度較大，甚至可大于 2個(gè)pH值單位。環(huán)境pH值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。高壓滅菌通常會(huì)使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖，從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi)，高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0. 43倍。培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時(shí)會(huì)催

24、化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于5.5,其水解量更多，培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時(shí)，高壓下蔗糖水解大大增強(qiáng)，添加1%活性炭，蔗糖水解率可達(dá) 5%。防止高壓滅菌培養(yǎng)基變化的方法：（1）經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料，及時(shí)采取有效措施。（2）設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方時(shí)盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準(zhǔn)確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇，以舊A代替IAA ,控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意pH值對(duì)高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。（3）配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意成分的適當(dāng)分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。（4）注意高壓滅菌后培養(yǎng)基 pH值的變化及

25、回復(fù)動(dòng)態(tài)。如高壓滅菌后的pH值常由5.80升高至6.48。而96h后又回降至5.8左右。這樣在實(shí)驗(yàn)中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。灼燒滅菌（用于無菌操作的器械 ）在無菌操作時(shí)，把鐐子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精燈火焰卜灼燒火菌。冷卻后，立即使用。操作中可采用250或500ml的廣口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。干熱滅菌（玻璃器皿及耐熱用具）干熱滅菌是利用烘箱加熱到 160-180C的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下，細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性大為提高，接近芽抱的抗熱 水平，通常采用170 c持續(xù)90min來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥，工具等要妥為包扎，以免

26、滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用 耐高溫的塑料。滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫，達(dá)到頂定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多，以免妨礙熱對(duì)流和穿透，到指定時(shí)間斷 電后，待充分冷涼，才能打開烘箱，以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大，浪費(fèi)時(shí)間。過濾滅菌（不耐熱的物質(zhì)）一些生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些維生素是不耐熱的，不能用高壓滅菌處理，通常采用過濾滅菌方法。防細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為 0.45 “m以下，當(dāng)溶液通過濾膜后，細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的抱子等因大于濾膜直徑而被阻，在需要過濾滅菌的 液體量大時(shí)，常使用抽濾裝置；液量小時(shí)，可用注射器。使用前對(duì)其高壓滅菌，將濾膜裝在注射器的靠針管處，

27、將待過濾的液體裝入注射器， 推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。紫外線和熏蒸滅菌 （空間）（1）紫外線滅菌 在接種室、超凈臺(tái)上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細(xì)菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā) 生結(jié)構(gòu)變化，引起細(xì)菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長(zhǎng)為200300nm,其中以260nm的殺菌能力最強(qiáng)，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌，而且要求距照射物以不超過1.2m為宜。（2）熏蒸滅菌 用加熱焚燒、氧化等方法，使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡(jiǎn)便，只 需要把消毒的空間關(guān)閉緊

28、密即可。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時(shí)，房間關(guān)閉緊密，按 5 8ml/m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加 5g/m3高鎰酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí)，房 間可預(yù)先噴濕以加強(qiáng)效果。冰醋酸也可進(jìn)行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。化學(xué)消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競(jìng)爭(zhēng)其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細(xì)胞漿膜的通透性，使細(xì)胞 破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時(shí)間越長(zhǎng)，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)， 如升汞與高鎰酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強(qiáng)，但石炭酸和酒精例外。噴霧滅菌（物體表面）物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙

29、手、植物材料表面等，可用70%的酒精反復(fù)涂擦滅菌，l%-2%的來蘇兒（甲酚）溶液以及0.25% 1%的新潔爾滅（苯扎溟鏤）也可以。植物材料表面用消毒劑滅菌從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶人培養(yǎng)基，便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必 須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。第一步，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細(xì)洗干凈，如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當(dāng)大小，即滅菌容器 能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí)，沖洗時(shí)間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細(xì)小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水 沖洗在污染

30、嚴(yán)重時(shí)特別有用。洗時(shí)可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的 直接接觸。當(dāng)然，最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)一吐溫。第二步是對(duì)材料的表面浸潤(rùn)滅菌。要在超凈臺(tái)或接種箱內(nèi)完成，準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸1030s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70%酒精穿透力強(qiáng)，也很易殺傷植物細(xì)胞，所以浸潤(rùn)時(shí)間不能過長(zhǎng)。有一些特殊的材料，如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用70%酒精處理稍長(zhǎng)的時(shí)間。處理完的材料在無菌條件下

31、，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料。上述滅菌劑應(yīng)在使用前臨時(shí)配制，氯化汞可短期內(nèi)貯用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時(shí)用廣瓶加蓋較好；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，這種藥 劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗34次即可；難以對(duì)升汞殘毒較難去除，用無菌水涮洗810次，每次不少于3min。滅菌時(shí)，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時(shí)間，倒人消毒溶液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶 液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時(shí)間之前1 2min,開始把消毒液傾人一備好的大燒杯內(nèi)，傾凈后立即倒入無菌水，輕攪涮洗。滅菌時(shí)間是從倒人消毒液開始，至

32、倒入無菌水時(shí)為止。滅菌液要充分浸沒材料，寧可多用些滅菌液，切勿勉強(qiáng)在一個(gè)體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。在滅菌溶液中加吐溫 一80或Tnton X-100效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸人到滅菌的材料表面。但 吐溫加人后對(duì)材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，一般加入滅菌液的O.5%,即在100ml加入15滴。最后一步 是用無菌水涮洗，涮洗要每次 3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗 3-l0次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物 細(xì)胞的副作用。2.4.2 接種接種時(shí)由于有一個(gè)敞口的過程，所以是極易引起污染的時(shí)期，這一時(shí)期主要由空氣中的細(xì)菌和工作人

33、員本身引起，接種室要嚴(yán)格進(jìn)行空 間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1%3%的高鎰酸鉀溶液對(duì)設(shè)備、墻壁、地板等進(jìn)行擦洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70%的酒精或3%的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進(jìn)行：（1）在接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進(jìn)行滅菌； （2）在接木前20min,打開超凈工作臺(tái)的風(fēng)機(jī)以及臺(tái)上的紫外燈；（3）接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實(shí)驗(yàn)服，并換穿拖鞋等； （4）上工作臺(tái)后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺(tái)面； （5） 先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鐐子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復(fù)過火尖端處，對(duì)培養(yǎng)皿

34、要過火烤干；（6）接種時(shí)接種員雙手不能離開工作臺(tái)，不能說話、走動(dòng)和咳嗽等；（7）接種完畢后要清理干凈工作臺(tái)，可用紫外燈滅菌30min。若連續(xù)接種，每5天要大強(qiáng)度滅菌一次。2.4.3 外植體接種步驟（1）將初步洗滌及切割的材料放人燒杯，置超凈臺(tái)上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的紗布上或?yàn)V 紙上。（2）材料吸干后，一手拿鐐子，一手拿剪子或解剖刀，對(duì)材料進(jìn)行適當(dāng)?shù)那懈睢Ｈ缛~片切成0.5cm見方的小塊；莖切成含有一個(gè)節(jié)的小段。微莖尖要?jiǎng)兂芍缓?l2片幼葉的莖尖大小等。接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。（3）用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上

35、。2.5 培養(yǎng)和馴化 指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室(有光照、溫度條件)里，使之生長(zhǎng)，分裂和分化形成愈傷組織或進(jìn)一步分化成再生植株的過程。2.5.1 培養(yǎng)方法(1)固體培養(yǎng)法 (2)液體培養(yǎng)法2.5.2 培養(yǎng)步驟(1)初代培養(yǎng)(2)繼代培養(yǎng)(3)生根培養(yǎng)(4)試管苗移栽馴化根據(jù)初代培養(yǎng)時(shí)發(fā)育的方向可分為：1頂芽和腋芽的發(fā)育2不定芽的發(fā)育3體細(xì)胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育誘導(dǎo)生根方法：將新梢基部浸入 50或100X 10-6舊a溶液中處理48h;在含有生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中培養(yǎng) 4-6d;直接移入含有生長(zhǎng)素的生根培養(yǎng)基中。上述三種方法均能誘導(dǎo)新梢生根，但前二種方法對(duì)新生根的生長(zhǎng)發(fā)育則更為有利。而第三種對(duì)幼根的生長(zhǎng)有抑

36、制作用。其原 因是當(dāng)根原始體形成后較高濃度生長(zhǎng)素的繼續(xù)存在，則不利于幼根的生長(zhǎng)發(fā)育。不過這種方法比較可行。另外也可采用下列方法就可生根：延長(zhǎng)在增殖培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時(shí)間；有意降低一些增殖倍率，減少細(xì)胞分裂素的用量(即將增殖與生根合并為一步)；切割粗壯的嫩枝在營(yíng)養(yǎng)缽中直接生根，此方法則沒有生根階段?？梢允∪ヒ淮闻囵B(yǎng)基制作，切割下的插穗可用生長(zhǎng)素 溶液浸蘸處理，但這種方法只適于一些容易生根的作物。另外少數(shù)植物生根比較困難時(shí)，則需要在培養(yǎng)基中放置濾紙橋，使其略高于液面，靠濾紙的吸水性供應(yīng)水和營(yíng)養(yǎng)，從而誘發(fā)生根。經(jīng)胚狀體途徑發(fā)育的苗數(shù)特別多，并且個(gè)體較小，所以也常需要一個(gè)低濃度或沒有植物激素的培養(yǎng)基培養(yǎng)的

37、階段，以便壯苗生根。(4)試管苗移栽馴化試管苗移栽是組織培養(yǎng)過程的重要環(huán)節(jié)，這個(gè)工作環(huán)節(jié)做不好，就會(huì)造成前功盡棄。為了做好試管苗的移栽，應(yīng)選擇合適的基質(zhì)，并配 合以相應(yīng)的管理措施，才能確保整個(gè)組織培養(yǎng)工作的順利完成。試管苗由于是在無菌、有營(yíng)養(yǎng)供給、適宜光照和溫度近100%的相對(duì)濕度環(huán)境條件下生長(zhǎng)的，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自然條件生長(zhǎng)的正常小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地適應(yīng)外界環(huán)境，從而使 生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適合于自然環(huán)境，只有這樣才能保證試管苗順利移栽成功。從葉片上看，試管苗的角質(zhì)層不發(fā)達(dá)，葉片通常沒有表皮毛

38、，或僅有較少表皮毛，甚至葉片上出現(xiàn)了大量的水孔，而且，氣孔的數(shù)量、 大小也往往超過普通苗。由此可知，試管苗更適合于高濕的環(huán)境生長(zhǎng)，當(dāng)將它們移栽到試管外環(huán)境時(shí)，試管苗失水率會(huì)很高，非常容易死亡。因此，為了改善試管苗的上述不良生理、形態(tài)特點(diǎn)，則必須經(jīng)過與外界相適應(yīng)的馴化處理另外，對(duì)栽培馴化基質(zhì)要進(jìn)行滅菌，因?yàn)樵嚬苊缭?無菌的環(huán)境中生長(zhǎng)，對(duì)外界細(xì)菌、真菌的抵御能力極差。為了提高其成活率，在培養(yǎng)基質(zhì)中可摻入75%的百菌清可濕性粉劑 200-500倍液，以進(jìn)行滅菌處理。，通常采取的措施有：對(duì)外界要增加濕度、減弱光照；對(duì)試管內(nèi)要通透氣體、增施二氧化碳肥料、逐步降低空氣濕度等。移栽用基質(zhì)適合于栽種試管苗的基

39、質(zhì)要具備透氣性、保濕性和一定的肥力，容易滅菌處理，并不利于雜菌滋生的特點(diǎn)，一般可選用珍珠巖、蛭石、 砂子等。為了增加粘著力和一定的肥力可配合草炭土或腐殖土。配時(shí)需按比例搭配，一般用珍珠巖，蛭石，草炭土或腐殖土比例為1:1:0.5。也可用砂子：草炭土或腐殖土為1:1。這些介質(zhì)在使用前應(yīng)高壓滅菌?；蛴弥辽?h烘烤來消滅其中的微生物。要根據(jù)不同植物的栽培習(xí)性來進(jìn)行配制，這樣才能獲得滿意的栽培效果。以下介紹幾種常見的試管苗栽培基質(zhì)。(1)河砂:河砂分為粗砂、細(xì)砂兩種類型。粗砂即平常所說的河砂，其顆粒直徑為 1 2mm。細(xì)砂即通常所說的面砂，其顆粒直徑為 0.1 0.2mm。河砂的特點(diǎn)是排水性強(qiáng)，但保水

40、蓄肥能力較差，一般不單獨(dú)用來直接栽種試管苗。(2)草炭土 ：草炭土是由沉積在沼澤中的植物殘骸經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的腐爛所形成，其保水性好，蓄肥能力強(qiáng)，呈中性或微酸性反應(yīng)，但通常不 能單獨(dú)用來栽種試管苗，宜與河砂等種類相互混合配成盆土而加以使用。(3)腐殖土 ：腐殖土是由植物落葉經(jīng)腐爛所形成。一種是自然形成，一種是人為造成，人工制造時(shí)可將秋季的落葉收集起來，然后埋人坑 中，灌水壓實(shí)令其腐爛。第二年春季將其取出置于空氣中，在經(jīng)常噴水保濕的條件下使其風(fēng)化，然后過篩即可獲得。腐葉上含有大量的礦質(zhì) 營(yíng)養(yǎng)、有機(jī)物質(zhì)，它通常不能單獨(dú)使用。摻有腐殖土的栽培基質(zhì)有助于植株發(fā)根。移栽前的練苗試管內(nèi)生根壯苗的階段，通常不同植

41、物的適宜馴化溫度不同。如菊花，以1820c為宜。實(shí)踐證明植物生長(zhǎng)的溫度過高不但會(huì)牽涉到蒸騰加強(qiáng)。而且還牽涉到菌類易滋生的問題。溫度過低使幼苗生長(zhǎng)遲緩，或不易成活。春季低溫時(shí)苗床可加設(shè)電熱線，使基 質(zhì)溫度略高于氣溫23C ,這不但有利于生根和促進(jìn)根系發(fā)達(dá)，而且還有利于提前成活。移植到試管外的植物苗光強(qiáng)度應(yīng)比移植前培養(yǎng)有所提高，并可適應(yīng)強(qiáng)度較高的漫射光，(約4000h左右)，以維持光合作用所需光照強(qiáng)度。但光線過強(qiáng)刺激蒸騰加強(qiáng)，會(huì)使水分平衡的矛盾更尖銳。移栽前可將培養(yǎng)物不開口移到自然光照下鍛煉2 3d,讓試管苗接受強(qiáng)光的照射，使其長(zhǎng)得壯實(shí)起來，然后再開口練苗12d,經(jīng)受較低濕度的處理，以適應(yīng)將來自然

42、濕度的條件。移栽和幼苗的管理從試管中取出發(fā)根的小苗，用自來水洗掉根部粘著的培養(yǎng)基，要全部除去，以防殘留培養(yǎng)基滋生雜菌。但要輕輕除去，應(yīng)避免造成傷根。 栽植時(shí)用一個(gè)筷子粗的竹簽在基質(zhì)中插一小孔，然后將小苗插入，注意幼苗較嫩，防止弄傷，栽后把苗周圍基質(zhì)壓實(shí)，栽前基質(zhì)要澆透 水。栽后輕澆薄水。再將苗移入高濕度的環(huán)境中。保證空氣濕度達(dá)90%以上。(1)保持小苗的水分供需平衡在移栽后5-7d內(nèi)，應(yīng)給予較高的空氣濕度條件，使葉面的水分蒸發(fā)減少，盡量接近培養(yǎng)瓶的條件，讓小苗始終保持挺拔的狀態(tài)。 保持小苗水分供需平衡首先營(yíng)養(yǎng)缽的培養(yǎng)基質(zhì)要澆透水，所放置的床面也要澆濕，然后搭設(shè)小拱棚，以減少水分的蒸發(fā)，并且初期

43、要常噴霧 處理，保持拱棚薄膜上有水珠出現(xiàn)。當(dāng)57d后，發(fā)現(xiàn)小苗有長(zhǎng)趨勢(shì)，可逐漸降低濕度，減少噴水次數(shù)，將拱棚兩端打開通風(fēng)，使小苗適應(yīng)濕度較小的條件。約15d以后揭去拱棚的薄膜，并給予水分控制，逐漸減少澆水，促進(jìn)小苗長(zhǎng)得粗壯。(2)防止菌類滋生由于試管苗原來的環(huán)境是無菌的，移出來以后難以保持完全無菌，因此，應(yīng)盡量不使菌類大量滋生，以利成活。所以應(yīng)對(duì)基質(zhì)進(jìn) 行高壓滅菌或烘烤滅菌?？梢赃m當(dāng)使用一定濃度的殺菌劑以便有效地保護(hù)幼苗，如多菌靈、托布津，濃度800 1000倍，噴藥宜7l0d 次。在移苗時(shí)盡量少傷苗，傷口過多，根損傷過多，都是造成死苗的原因。噴水時(shí)可加入0.1%的尿素，或用1/2MS大量元素

44、的水溶液作追肥，可加快苗的生長(zhǎng)與成活。(3) 一定的溫、光條件試管苗移栽以后要保持一定的溫光條件，適宜的生根溫度是18 200C,冬春季地溫較低時(shí)，可用電熱線來加溫。溫度過低會(huì)使幼苗生長(zhǎng)遲緩，或不易成活。溫度過高會(huì)使水分蒸發(fā)，從而使水分平衡受到破壞，并會(huì)促使菌類滋生。另外在光照管理的初期可用較弱的光照，如在小拱棚上加蓋遮陽網(wǎng)或報(bào)紙等，以防陽光灼傷小苗和增加水分的蒸發(fā)。當(dāng)小植株有了新的 生長(zhǎng)時(shí)，逐漸加強(qiáng)光照，后期可直接利用自然光照。促進(jìn)光合產(chǎn)物的積累，增強(qiáng)抗性，促其成活。(4)保持基質(zhì)適當(dāng)?shù)耐庑?。要選擇適當(dāng)?shù)念w粒狀基質(zhì)，保證良好的通氣作用。在管理過程中不要澆水過多，過多的水應(yīng)迅速瀝除，以利 根

45、系呼吸。綜上所述，試管苗在移栽的過程中，只要把水分平衡、適宜的介質(zhì)、控制雜菌和適宜的光、溫條件控制好，試管苗是很容易移栽的?？焖俜敝撑c脫毒培養(yǎng)快速繁殖：就是得用組織培養(yǎng)的方法，使植物的部分器官、組織在人工控制的適宜條件下，迅速擴(kuò)大培養(yǎng)，并移植到溫室或農(nóng)田繁殖出 大量幼苗的繁殖方法?？旆碧攸c(diǎn)：繁殖速度快；使用材料少，生產(chǎn)效率高，省時(shí)省工；節(jié)約空間有利于植物的工廠化生產(chǎn)；在無菌條件下進(jìn)行，不受病蟲害侵 害。快速繁殖的優(yōu)越性：(1)其主要特點(diǎn)是速度 快”。(2)是無性繁殖從田間移入室內(nèi)，易于育苗工廠化?？旆敝饕m用范圍：(1)加速某些難繁或繁殖速度低的植物，特別是一些珍稀名貴的花卉，需要發(fā)展的瀕危植

46、物的繁殖。如百合(2)用有性繁殖的方法難以保持品種特性的異花授粉植物，如油棕、狒猴桃、非洲菊等。(3)需要去除病毒的植物。如馬鈴薯、甘薯、大蒜等。(4)原種很少，生產(chǎn)上又急需推廣的植物。如百合，名貴花卉。(5)珍稀植物資源和育種原始材料。如：野生抗性資源、自然突變資源、雄性不育資源、罕見植物等。快速繁殖過程一般包括四個(gè)階段：階段一：無菌培養(yǎng)物的建立1 .外植體的選擇選擇適當(dāng)?shù)耐庵搀w對(duì)于快速繁殖能否成功是極其重要的，而選擇什么樣的外植體首先決定于第二階段芽的增殖所采用的途徑。通過腋芽的形成來增加芽的數(shù)量時(shí)，應(yīng)從帶有營(yíng)養(yǎng)芽的部分得到外植體，并注意以下4個(gè)問題。(1)外植體大小，如為一般繁殖而非脫毒

47、繁殖，可使用普通莖尖、芽或帶芽的莖切段作為外植體。(2)取材植株的生理狀態(tài)對(duì)培養(yǎng)成敗是極重要的，一般在植物開始生長(zhǎng)，芽已膨大但芽鱗片還未張開時(shí)最為合適，此時(shí)芽生長(zhǎng)旺盛， 并有芽鱗片的保護(hù)，不易污染。為了避免季節(jié)的影響，在有條件時(shí)也可以將植物放在光、溫條件穩(wěn)定的人工氣候箱或溫室中，使植物保持營(yíng) 養(yǎng)生長(zhǎng)狀態(tài)，對(duì)某些需低溫或高溫或特殊光周期處理才能打破休眠的塊莖、鱗莖、球莖等，常要處理后才可剝?nèi)∏o尖進(jìn)行培養(yǎng)。(3)芽在植物株上的部位也是需要注意的，在一些草本植物(如菊花等)中，使用頂芽或上部的芽作為分生組織或莖尖培養(yǎng)時(shí)的成功率常比側(cè)芽或基部的芽要高，這可能和它們生長(zhǎng)較旺盛有關(guān)。(4)多年生的木本植物

48、隨著年齡的增加，分生組織、莖尖和芽的培養(yǎng)越困難，特別是成年樹較幼態(tài)樹的培養(yǎng)要困難得多，此時(shí)，常使 用部分返幼階段或年齡較低的根篥苗或不定芽做材料，或采取某些措施如將芽接在實(shí)生苗上，修剪、保持高水平的水肥進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)繁殖，或用 細(xì)胞分裂素噴灑植株的方法等。在通過不定芽途徑使芽增殖時(shí)，可以根據(jù)不同的植物采用不同的外植體，如根、莖、葉或花器官的各部分，在自然界中能夠產(chǎn)生不定芽 的器官應(yīng)當(dāng)首先被采用，如非洲紫羅蘭、秋海棠、大巖桐、落地生根等可用葉片，某些蘭花等可以用莖尖；很多種植物，特別是單子葉植物， 可以作用花器官，如黃花菜、鶯尾等。在使用體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑時(shí)，常使用胚分生組織或生殖器官作為外植體。2

49、.外植體的消毒階段二：芽的誘導(dǎo)及擴(kuò)大化繁殖(增殖)這是快繁技術(shù)中最重要性一環(huán)，在這一階段潛在的植物體幼體(芽或胚狀體)通過腋芽的形成和生長(zhǎng)、外植體或愈傷組織上不定芽的形 成和胚狀體發(fā)生三條件途徑在數(shù)量上得迅速增殖，由于外植體種類的不同，在增殖時(shí)可能采用的途徑不同。1 .促進(jìn)腋芽的形成和生 2.誘導(dǎo)不定芽的形成3.誘導(dǎo)胚狀體的形成階段三：根的誘導(dǎo)這一階段的目的是使第二階段通過腋芽生長(zhǎng)和不定芽形成途徑得到的嫩枝生根產(chǎn)生小植株，以便移栽。很多草本植物的不定根的形成是很容易的，但木本植物一般要困難些，其中從成年樹得到的材料就更困難。由于生長(zhǎng)的嫩枝本身能全盛豐富的生長(zhǎng)素，所以一部分植物可在 無激素的培養(yǎng)

50、基上生根。階段四：移栽移栽步驟及要求2 煉苗3-10d3 凈苗除去培養(yǎng)基、過多過長(zhǎng)根系4 栽培基質(zhì)無菌：高壓滅菌or化學(xué)消毒；保濕； 透氣5 環(huán)境光：弱中；適濕：不萎焉6 .2植物無病毒苗的培育7 .2.3 脫毒的方法(一) 熱處理脫毒熱處理法的發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用熱處理又稱溫治療法(theomtherapy),原理是當(dāng)植物組織處于高于正常溫度的環(huán)境中時(shí)，組織內(nèi)部的病自行消滅，從而達(dá)到脫毒的目的。（1）溫湯浸漬處理（2）熱空氣處理熱處理方法主要缺陷是并非能脫除所有病毒，因此熱處理需與其他方法配合應(yīng)用，才可獲得良好的效果。（二）莖尖培養(yǎng)脫毒1.莖尖培養(yǎng)脫毒原理感染病毒植株的體內(nèi)病毒的分布并不均勻，病毒的數(shù)

51、量隨植株部位及年齡而異，越靠近莖頂端區(qū)域的病毒的感染深度越低，生長(zhǎng)點(diǎn)（約0.11.0mm區(qū)域）則幾乎不含或含病毒很少、這是因?yàn)榉稚鷧^(qū)域內(nèi)無維管束，病毒只能通過胞間連絲傳遞，趕不上細(xì)胞不斷分裂和活躍的生長(zhǎng)速度。在切取莖尖時(shí)越小越好，但太小則不易成活，過大又不能保證完全除去病毒。莖尖培養(yǎng)脫毒，由于其脫毒效果好，后代穩(wěn)定，所以是目前培育無病毒苗最廣泛和最重要的一個(gè)途徑。（三）其他途徑脫毒1.愈傷組織培養(yǎng)脫毒2.莖尖微體嫁接3.化學(xué)去毒3.2.4 去病毒植物的鑒定（一）指示植物法（二）抗血清鑒定法（三）電子顯微鏡檢查法（四）酶聯(lián)免疫鑒定法（五） 核酸鑒定一、無病毒苗的保存繁殖無病毒植株并不是有額外的抗

52、病性，它們有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到無病毒苗，就應(yīng)很好地隔離與保存。二、無病毒苗的利用無病毒苗在生產(chǎn)中的利用也要防止病毒的再感染。生產(chǎn)場(chǎng)所應(yīng)隔離病毒感染途徑，做好土壤消毒或防甥等工作。在此種植區(qū)及種植規(guī)模小的地方，要較長(zhǎng)時(shí)間才會(huì)感染。而在種植時(shí)間長(zhǎng)、輪作及種植規(guī)模大的產(chǎn)地則在短期內(nèi)就可以感染。一旦 感染，便會(huì)影響產(chǎn)量和質(zhì)量的保證。因此，應(yīng)重新采用無病毒苗，以保證生產(chǎn)的質(zhì)量。三、無病毒苗的效果無病毒苗可以表現(xiàn)出明顯的優(yōu)良效果。如草莓可增產(chǎn)20% 50%,植株結(jié)果多，單果重增加，上等果比例提高。菊花切花品種的脫毒株，表現(xiàn)出株高增加，切花數(shù)增多，花朵大，切花較重等特點(diǎn)。第四章、原生質(zhì)體

53、培養(yǎng)與體細(xì)胞雜交原生質(zhì)體：原生質(zhì)體指采用機(jī)械或酶解法去掉了細(xì)胞壁的裸露的且具有活力的細(xì)胞。是通過質(zhì)壁分離與細(xì)胞壁分開的部分，是能存活的植物細(xì)胞的最小單位。1880, Hanstein最早用來指細(xì)胞壁包圍的活物質(zhì)。原生質(zhì)體培養(yǎng)的應(yīng)用及意義：1、種質(zhì)資源保存原生質(zhì)超低溫保存，始于 20c 70s；具有單細(xì)胞保存的所有優(yōu)點(diǎn)：量大，質(zhì)均；利于研究低溫傷害和細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰2、原生質(zhì)體融合遠(yuǎn)緣親合雄配子胞質(zhì)遺傳3、篩選突變體：量大，質(zhì)均，無胞壁障礙4、遺傳轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)：大量一致單細(xì)胞；易獲得轉(zhuǎn)化植株;容易攝取外緣遺傳物質(zhì)；固體包埋培養(yǎng)，可以避免轉(zhuǎn)化嵌合體的產(chǎn)生5、易于遺傳理論、生理生

54、化的基礎(chǔ)研究研究：膜結(jié)構(gòu)；壁再生；跨膜交換4.1.3 原生質(zhì)體的分離與制備要分離植物原生質(zhì)體，必須去掉由果膠質(zhì)、纖維素和半纖維素及木質(zhì)素等構(gòu)成的細(xì)胞壁。分離機(jī)械法，即將葉肉細(xì)胞，愈傷組織和液體懸浮培養(yǎng)細(xì)胞置于高滲的糖溶液中，使之質(zhì)壁分離，原生質(zhì)體收縮成球形。然后用剪刀剪 碎組織，就可切開細(xì)胞壁獲得少量完整的原生質(zhì)體。不過這種方法分離的原生質(zhì)體太少，而且只能適于部分組織。酶解法，所以目前普遍采用酶分離法來獲得原生質(zhì)體。一、植物材料一般來說，植物各個(gè)器官，如：根、莖、葉、花、果實(shí)、種子及愈傷細(xì)胞和懸浮細(xì)胞等都可作為分離原生質(zhì)體的材料。但是，要獲得高 質(zhì)量的原生質(zhì)體，則須選用生長(zhǎng)旺盛、生命力強(qiáng)的組織

55、作材料。材料的生理狀況是原生質(zhì)體質(zhì)量的決定性因素之一。（1） 細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物選出增殖較快而且呈顆粒狀的愈傷組織 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的大小變得較為一致，且細(xì)胞質(zhì)變得較濃時(shí)，可用作分離原生質(zhì)體。（2） 葉肉細(xì)胞葉肉細(xì)胞是分離原生質(zhì)體的最好的細(xì)胞材料，取生理狀態(tài)適宜的葉片，有利于原生質(zhì)體的細(xì)胞再生和細(xì)胞分裂。要獲得良好的培養(yǎng)材料，下列外界因素是考慮的重要因子：（1）光強(qiáng)為3000-6000LX。（2）溫度為2025c培養(yǎng)。（3）相對(duì)濕度在60%80%左右。植物的其他器官也適合用于分離原生質(zhì)體，如用花粉四分體等。（3） 植物材料的預(yù)處理對(duì)原生質(zhì)體材料進(jìn)行預(yù)處理能提高原生質(zhì)體的分裂頻率；也可以逐步提高植物材料

56、的滲透壓，以適應(yīng)培養(yǎng)基中的高滲環(huán)境。這些 處理包括：暗處理、預(yù)培養(yǎng)、低溫處理等。二酶（一） 酶的種類構(gòu)成植物細(xì)胞壁的三個(gè)主要成分是：纖維素半纖維素果膠質(zhì)纖維素酶是從綠色木霉中提取的一種復(fù)合酶制劑，總體作用是降解纖維素，得到裸露的原生質(zhì)體。果膠酶是從根霉中提取的，使細(xì)胞間的果膠質(zhì)降解，把細(xì)胞從組織內(nèi)分離出來。半纖維素酶制劑可以降解半纖維素為單糖或單糖衍生物。止匕外，還有蝸牛酶，主要用于花粉母細(xì)胞和四分體細(xì)胞。（二）滲透穩(wěn)定劑在酶液、洗液和培養(yǎng)液中滲透壓應(yīng)大致和原生質(zhì)體內(nèi)的相同，或者比細(xì)胞內(nèi)滲透壓略大些。滲透壓大些有利于原生質(zhì)體的穩(wěn)定，但 也有可能阻礙原生質(zhì)體的分裂。過低，易造成細(xì)胞膜破裂。滲透穩(wěn)定劑常用的兩種系統(tǒng)為：糖溶液系統(tǒng)鹽溶液系統(tǒng)另外，添加牛血清蛋白可減少或防止降解壁過程中對(duì)細(xì)胞器的破壞。近年來多采用在鹽溶液內(nèi)進(jìn)行原生質(zhì)體分離，然后再用糖溶液 作滲透穩(wěn)定劑的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。止匕外，酶溶液里還可加入適量的葡聚糖硫酸鉀，它可提高原生質(zhì)體的穩(wěn)定性。這種物質(zhì)可使RNA酶不活化，并使離子穩(wěn)定。（三）酶溶液的 pH值酶溶?的pH值對(duì)原生質(zhì)體的產(chǎn)量和生活力影響很大。三、原生質(zhì)體的分離分離原生質(zhì)體時(shí)，首先要讓酶制劑大量地吸附到細(xì)胞壁的纖維素上去，因此，一般先將材料分離成單細(xì)胞，然后分解細(xì)胞壁。采用將酶液減 壓滲入組織，或?qū)⒔M織切成薄片等方法，都可增加酶液與纖維素分子接觸的機(jī)會(huì)。