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文檔簡介
1、ISSR分子標(biāo)記及其在果樹遺傳學(xué)的應(yīng)用果樹學(xué) 劉志發(fā)主要內(nèi)容 ISSR分子標(biāo)記 ISSR分子標(biāo)記的基本原理和特點 ISSR分子標(biāo)記實驗操作 ISSR分子標(biāo)記在果樹遺傳學(xué)的應(yīng)用 問題與展望ISSR分子標(biāo)記 ISSR分子標(biāo)記是在SSR分子標(biāo)記基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種DNA多態(tài)性檢測技術(shù)。即錨定簡單重復(fù)序列(anchored simple sequence repeat,ASSR),也稱作簡單重復(fù)間序列(inter-simple sequence repeat,ISSR)標(biāo)記技術(shù)或以微衛(wèi)星為引物的PCR(microsatellite primed PCR,MP-PCR) 。 它是由加拿大蒙特里爾大學(xué)的Z
2、ietkiewicz等1994年提出的 。ISSR分子標(biāo)記的基本原理和特點 基本原理 特點在真核生物基因組中均存在著由14個核苷酸組成的簡單重復(fù)序,如(A)n、(AG)n、(AGC)n、(AATT)n等。植物基因組中最多的SSR 是(AT)n、(TA)n、( GA)n、(CT)n等二核苷酸重復(fù)序列。ISSR技術(shù)的基本原理就是在用錨定的微衛(wèi)星DNA為引物,即在SSR序列的3端或5端加上24個隨機(jī)核苷酸,在PCR反應(yīng)中,錨定引物可以引起特定位點退火,導(dǎo)致與錨定引物互補的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。錨定錨定ISSR-PCR示意圖示意圖5錨定引物錨定引物NNNN(CA)n3錨定引物
3、錨定引物NN(CA)nCACACACACACACACAGTGTGT GTGTGT GTGTGTGT GTGTGTGTGTGTGT GTGTGTGTGTCACACACACACACACACACACACACACA5錨定引物錨定引物NNNN(CA)n3錨定引物錨定引物NN(CA)n3錨定引物的錨定引物的PCR產(chǎn)物產(chǎn)物5錨定引物的錨定引物的PCR產(chǎn)物產(chǎn)物用重復(fù)序列用重復(fù)序列(CA)n作單引物,在引物的作單引物,在引物的5端或端或3錨定錨定1至數(shù)個堿基。至數(shù)個堿基。實驗操作簡單、快速、高效,實驗操作簡單、快速、高效,DNADNA用量少用量少, ,引引物設(shè)計容易物設(shè)計容易, ,實驗成本低廉。實驗成本低廉。I
4、SSRISSR遺傳多態(tài)性高,重復(fù)性好。遺傳多態(tài)性高,重復(fù)性好。符合孟德爾遺傳規(guī)律。符合孟德爾遺傳規(guī)律。無需知道任何靶標(biāo)序列的無需知道任何靶標(biāo)序列的SSRSSR背景信息。背景信息。 優(yōu)點:優(yōu)點:PCRPCR擴(kuò)增反應(yīng)的最適條件需要一定時間摸擴(kuò)增反應(yīng)的最適條件需要一定時間摸索。索。ISSRISSR標(biāo)記大多是顯性標(biāo)記,不能區(qū)分顯標(biāo)記大多是顯性標(biāo)記,不能區(qū)分顯性純合基因型和雜合基因型。性純合基因型和雜合基因型。 缺點缺點ISSR分子標(biāo)記實驗操作 DNA樣品的提取 引物設(shè)計 PCR擴(kuò)增反應(yīng) PCR產(chǎn)物的電泳及數(shù)據(jù)分析DNA樣品的提取 提取植物DNA的方法有很多,用于ISSR分子標(biāo)記的DNA樣品的提取方法有
5、: SDS法 CTAB法引物設(shè)計 引物設(shè)計是ISSR技術(shù)中最關(guān)鍵、最重要的一步。用于ISSR的引物常為5端或3端加錨的二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸重復(fù)序列,重復(fù)次數(shù)一般為48次,使引物的總長度達(dá)到20bp左右。5端或3端用于錨定的堿基數(shù)目一般為14個,錨定的目的是引起特定位點退火,使引物與相匹配SSR的一端結(jié)合,而不是中間,從而對基因組中特定片段進(jìn)行擴(kuò)增、檢測。PCR擴(kuò)增反應(yīng)反應(yīng)體系 模板DNA dNTP 引物 Taq DNA聚合酶 PCR反應(yīng)緩沖液 擴(kuò)增步驟 變性(denaturation) 退火(anealing) 延伸(extension)PCR產(chǎn)物的電泳與數(shù)據(jù)分析 PCR產(chǎn)物需經(jīng)電泳分
6、離、染色顯示后才能進(jìn)行條帶觀察、統(tǒng)計。 目前可用于ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物分離的電泳有:濃度為1.5%2.0%瓊脂糖凝膠電泳或濃度為6%聚丙烯酰胺凝膠電泳,后者的分離效果通常更好。用溴化乙錠(EB)或硝酸銀染色后,在紫外光或可見光下進(jìn)行觀察,統(tǒng)計帶紋的有(計為1)或無(計為O)及相對位置,然后即可根據(jù)研究目的,應(yīng)用UPGMA、SPSS等聚類分析軟件進(jìn)行分析。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在果樹遺傳學(xué)的應(yīng)用 遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu)遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu) 種質(zhì)資源鑒定與親緣關(guān)系種質(zhì)資源鑒定與親緣關(guān)系 遺傳指紋圖譜的構(gòu)建遺傳指紋圖譜的構(gòu)建 遺傳多樣性 彭瑜等利用ISSR分子標(biāo)記方法對20個柚類品種進(jìn)行遺傳多樣性研
7、究,揭示了柚類品種間豐富的遺傳多樣性。 鄒游等利用ISSR技術(shù)對采自四川省獼猴桃科研基地的14個獼猴桃品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析。ISSR標(biāo)記說明獼猴桃品種間遺傳距離與地理分布有一定關(guān)系, 地理位置較近的品種能聚在一起。 徐志祥等ISSR分子標(biāo)記對南豐柑桔品種的遺傳多樣性進(jìn)行研究。從100個ISSR引物中篩選出17個多態(tài)引物,對14份柑桔樣品進(jìn)行ISSR-PCR分析。UPGMA聚類分析結(jié)果表明,以遺傳相似系數(shù)為0.67為分界線,可以將14份供試柑桔樣品分成三類:第一類包含以ss-28為代表的7個柑桔品種;第二類包含以楊小2,6 為代表的3個柑桔品種;第三類包括以早系97-1 為代表的4個柑桔品種
8、。基于ISSR分析的14份南豐蜜桔UPGMA聚類圖種質(zhì)資源鑒定與親緣關(guān)系 果樹生命周期長,并長期通過無性方式繁殖,加上不同地域間的相互引種,使同名異物和同物異名現(xiàn)象十分普遍,如何準(zhǔn)確地對現(xiàn)有果樹品種鑒定和親緣關(guān)系分析,是進(jìn)一步科學(xué)、有效地利用果樹資源的基礎(chǔ)。借助ISSR分子標(biāo)記技術(shù),可以在大范圍內(nèi)對果樹的遺傳物質(zhì)進(jìn)行較全面的比較,從而對果樹種質(zhì)資源鑒定和親緣關(guān)系分析。 吳興恩等對富民枳、枳、枳橙和甜橙等22份柑桔資源進(jìn)行了ISSR分析,并對所得結(jié)果進(jìn)行了討論,發(fā)現(xiàn)采用ISSR技術(shù)可作為品種鑒別、親緣關(guān)系和分類的手段之一。 遺傳指紋圖譜的構(gòu)建 果樹遺傳指紋圖譜研究技術(shù)是在現(xiàn)代儀器分析技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)
9、展起來的, 進(jìn)而對果樹進(jìn)行鑒定和質(zhì)量控制。研究方法也有多種, 分別從不同的角度反映了果樹的遺傳信息。ISSR標(biāo)記容易發(fā)現(xiàn)多態(tài)性,敏感性高,通過ISSR分析可以找出與靶基因連鎖的ISSR標(biāo)記。ISSR標(biāo)記在雜交群體中呈孟德爾式分離,ISSR遍布基因組,多態(tài)性高,因此可用于遺傳作圖。 Sankar等對用ISSR在柑橘作圖中效果評價,認(rèn)為ISSR 標(biāo)記符合孟德爾式分離,標(biāo)記是顯性標(biāo)記,少部分標(biāo)記呈共顯性分離, 可以同RFLP、RAPD、同工酶的遺傳圖譜相互補充,構(gòu)建新的遺傳圖譜,因此ISSR適合柑橘的遺傳圖譜構(gòu)建。 雷天剛等利用SSR標(biāo)記和ISSR 標(biāo)記對102個柑橘栽培品種進(jìn)行DNA指紋分析,篩選適合的特征引物,構(gòu)建柑橘栽培品種的指紋圖譜數(shù)據(jù)庫。問題與展望 ISSR標(biāo)記因其引物容易設(shè)計,實驗重復(fù)性強,操作過程簡單,不須使用同位素,可以揭示更高程度的DNA多態(tài)性,從而在果樹遺傳研究中具有廣闊的應(yīng)用前景,但任何一種分子標(biāo)記都不能解決所有問題,在今后的研究
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