生物化學(xué)-酵母提取

1、綜合實(shí)驗(yàn) 酵母RNA的提純及其定性鑒定與定量測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1、學(xué)習(xí)RNA提取的幾種常用方法并掌握濃鹽法提取RNA的原理和方法。 3、掌握幾種定性鑒定所得RNA的原理與方法。 4、掌握兩種定量測(cè)定所得RNA的原理和方法。 5、學(xué)習(xí)電泳技術(shù)的基本原理及其分類以及相關(guān)的應(yīng)用。 提純部分n 濃鹽法提取酵母RNAn 定性鑒定部分一、RNA基團(tuán)鑒定二、電泳分離鑒定三、光譜鑒定四、純度鑒定 定量測(cè)定部分n 一、地衣酚法定量測(cè)定n 二、紫外吸收法定量測(cè)定生物大分子物質(zhì)提取的基本原理與步驟一、材料選擇與處理二、細(xì)胞破碎三、細(xì)胞器分離四、提取五、純化六、濃縮、干燥七、樣品保存八、定性鑒定九、定量測(cè)定10、物質(zhì)

2、的利用核酸的分布n DNA：細(xì)胞核（95%） 細(xì)胞器（5%） RNA：細(xì)胞質(zhì)（75%) 細(xì)胞核(10%) 細(xì)胞器(15%) n RNA以rRNA的數(shù)量最多（80-85%)核酸提取的主要步驟n 破碎細(xì)胞n 去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子n 去除其它不需要的核酸分子n 沉淀核酸，去除鹽類，有機(jī)溶劑等雜質(zhì)核酸分離純化原則n 保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性n 排除其它分子的污染 n 簡(jiǎn)化操作，縮短時(shí)間，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞 n 減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解(pH4-10)n 減少物理因素對(duì)核酸的降解(機(jī)械剪切力 、 高溫) n 防止核酸的生物降解(DNA酶 、 RNA酶)實(shí)驗(yàn)原理 n

3、 由于RNA的來源和種類很多，因而提取制備方法也各異，一般有苯酚法、去污劑法和鹽酸胍法。其中苯酚法又是實(shí)驗(yàn)室最常用的。組織勻漿用苯酚處理并離心后，RNA即溶于上層被苯酚飽和的水相中，DNA和蛋白質(zhì)則留在苯酚層中，向水層加入乙醇后，RNA即以白色絮狀沉淀析出。此法能較好地除去DNA和蛋白質(zhì)，提取的RNA具有生物活性。n 酵母細(xì)胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體的2.67%-10.0%，而DNA含量較少，僅為0.03%-0.516%。為此提取RNA多以酵母為原料。工業(yè)上制備RNA多選用低成本、適于大規(guī)模操作的稀堿法或濃鹽法。這兩種方法所提取的核酸均為變性的RNA，主要用作制備單核苷酸的原

4、料，其工藝比較簡(jiǎn)單。 n 稀堿法是用氫氧化鈉使酵母細(xì)胞壁變性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA或調(diào)pH2.5利用等電點(diǎn)沉淀。提取的RNA有不同程度的降解。n 濃鹽法是用高濃度鹽溶液處理，同時(shí)加熱，以改變細(xì)胞壁的通透性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。RNA提取方法方法與分類n 稀堿法( 0.2% NaOH )n 濃鹽法( 10% NaCl )n 苯酚法n 氯仿-異戊醇法n 去污劑法n 鹽酸胍法三、試劑和器材1、試劑（1）干酵母粉（2） RNA標(biāo)準(zhǔn)溶液（100微克/毫升）（8） 5%硝酸銀溶液（9）鉬酸銨試劑2克鉬酸銨溶解在100毫升10% 硫酸中。（10）地衣酚試劑：10

5、0毫升濃鹽酸加入100毫克三氯化鐵，搖勻，貯存?zhèn)溆?，使用前加?00毫克地衣酚。n （11） NaCln （12） 95%乙醇n （13） 6 mol/l HCln （14）高氯酸n （15）氯化鋰n （16）硼酸緩沖液（pH-3.5）n （17）磷酸緩沖液（pH-7.5）2、器材（1）電子天平 （2）電熱套 （3）三角燒瓶 （4）燒杯 （5）高速冷凍離心機(jī) （6）滴管（7）抽濾瓶 （8）離心管 （9）恒溫水浴箱（10）吸量管 （11）紫外分光光度計(jì) （12）表面皿 （13）量筒 (14）容量瓶 （15）擦鏡紙 （16）比色皿 （17）玻棒 （18）定量濾紙 （19）試管 （20）布氏漏斗 （

6、21）真空泵 （22）電泳儀n （23）紫外檢測(cè)儀（24）可見光分光光度計(jì) n （25）托盤天平 （26）電泳槽精密pH試紙四、實(shí)驗(yàn)方法RNA的提取的操作3、 RNA提取方法(濃鹽法) 取 13g活性干酵母,置250 ml燒杯中，加入120 ml蒸 餾水，混勻；倒入8 g NaCl，電熱套加熱45分鐘(玻棒要不斷觸底攪拌) ；稍微冷，3500 rpm離心8 min，將上清倒入50 ml燒杯 中。 將燒杯冰浴10 min 用HCl小心調(diào)節(jié)pH，至2.02.5；將燒杯冰浴10 min；將燒杯中物質(zhì)（含沉淀）移入10 ml離心管中， 3500 rpm離心8 min，棄上清，將沉淀轉(zhuǎn)移到1.5ml小離

7、心管中，95%乙醇1.5 ml洗滌,5000 rpm離心4 min,倒棄清液。保存好粗RNA產(chǎn)品。思考題RNA含量測(cè)定之一：地衣酚法RNA的地衣酚法定量測(cè)定原理 RNA含量測(cè)定之一：地衣酚法測(cè)定。 反應(yīng)原理：當(dāng)RNA與濃鹽酸共熱時(shí)，即發(fā)生降解，形成的核糖繼而轉(zhuǎn)變成糠醛，后者與3，5-二羥基甲苯（地衣酚 orcinol）反應(yīng)，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鮮綠色復(fù)合物。反應(yīng)產(chǎn)物在670 nm處有最大吸收。RNA濃度在20-250g/ml范圍內(nèi)，光密度與RNA濃度成正比。n （1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取6支試管，7按下表編號(hào)及加入試劑，加畢混勻，置沸水浴中加熱45 min，取出冷卻，于670nm波長(zhǎng)處

8、測(cè)定光密度值。（3）RNA含量的計(jì)算n 根據(jù)測(cè)得的O.D值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相對(duì)應(yīng)的RNA含量，按下式計(jì)算出制品中RNA的百分含量：n RNA%=RNA鑒定之一：組成基團(tuán)的鑒定n 實(shí)驗(yàn)步驟:n 取適量0.05 g提取的RNA，加10%硫酸液3 ml，放在沸水浴中加熱5分鐘，制成RNA水解，做以下鑒定n （1）嘌呤堿基的檢查取水解液0.5ml，加氨水0.5ml及5%硝酸銀溶液0.3ml，觀察是否產(chǎn)生絮狀嘌呤銀化合物（有時(shí)絮狀物出現(xiàn)較慢，可放置十幾分鐘）。（2）磷酸的檢查取水解液0.5 ml，加2滴濃硝酸酸化，再加入0.5 ml鉬酸銨試劑，放在沸水浴中加熱10分鐘，冷卻靜置后觀察是否有黃色磷鉬酸銨

9、沉淀產(chǎn)生。（3）核糖的檢查取水解液0.5 ml，加地衣酚試劑0.5 ml，放在沸水浴中加熱5分鐘，觀察溶液顏色變化。操作方法 用分析天平準(zhǔn)確稱取待測(cè)的樣品RNA0.150g，加入少量的蒸餾水調(diào)成糊狀，再加入少量的水稀釋。用5%-6%的氨水調(diào)至pH值為7.0，定容到10 ml(RNA的鑒定三和四皆用該溶液,不過要稀釋200 倍)。取兩支離心管，向第一支管中加入2 ml樣品溶液和2 ml蒸餾水。第二支管中加入2 ml樣品溶液和2 ml沉淀劑?；靹?。 在冰浴中放置30分鐘，然后離心10分鐘，3000轉(zhuǎn)/分鐘。 從各管中取出0.25 ml上清液，用蒸餾水定容到25 ml。 于260nm處測(cè)定其光吸收值

10、（OD1、OD2） 將樣品放于紫外分光光度計(jì)上測(cè)定260nm, 計(jì)算核酸濃度。 OD1OD2 RNA% = 0.022 ×100 樣品濃度 式中：OD260為260nm波長(zhǎng)處光密度讀數(shù)；L 為比色杯的厚度；0.022為每毫升溶液內(nèi)含1微克RNA的光密度。RNA的鑒定三：提取的RNA吸收光譜測(cè)定 核酸在240290nm的紫外波段有一強(qiáng)烈的吸收峰，最大吸收值在260 nm附近。不同的核酸有不同的吸收特征。所以可以用紫外分光光度計(jì)加以定性和定量。 操作: 取RNA的定量分析之二所配溶液0.5 ml,稀釋200倍,取3 ml測(cè)定不同波長(zhǎng)(230、240、250 260、270、280、290

11、、300、310 nm)下的OD值,以不同波長(zhǎng)為橫坐標(biāo), OD值為縱坐標(biāo)繪制RNA吸收光譜曲線。RNA的鑒定四：提取的RNA純度的判斷 純DNA的 OD260/OD280 應(yīng)大于1.8，而純 RNA的 OD260/OD280應(yīng)達(dá)到2.0。如果樣品中含又雜蛋白、苯酚，則OD260/OD280的比值會(huì)明顯降低。所以我們通過測(cè)定OD260/OD280的比值來檢測(cè)RNA的純度。 操作: 取RNA的定量分析之二所配溶液0.5 ml,稀釋200倍,取3 ml于比色皿中分別在260nm、280nm處測(cè)定其光吸收值（OD1、OD2） 根據(jù)測(cè)得的OD值判斷提取的RNA的純度。 RNA的鑒定之二：醋酸纖維素薄膜電

12、泳分離鑒定 1、RNA的堿水解： 稱取0.15克RNA，溶于4 mL 0.3 mol/L氫氧化鉀溶液中，使RNA的濃度達(dá)到20-30 mg/ml。沸水浴30 min 或者在37水解18個(gè)小時(shí)。將水解液轉(zhuǎn)移到椎形瓶中。冰浴中用高氯酸溶液將水解液滴定到pH3.5。2000r/min 離心10 min，上清液即是樣品液。、準(zhǔn)備與點(diǎn)樣(1)將薄膜切成2.0 cm×8 cm的小片。在薄膜無光澤面(正面)的一端約3.0 cm處用硬鉛筆劃一點(diǎn)樣線。(2)將薄膜無光澤面向下，置pH 3.5, 0.02 mol/L的檸檬酸緩沖液中浸濕。3電泳 將點(diǎn)樣后的膜條置于電泳槽架上，放置時(shí)，無光澤面(即點(diǎn)樣面)向下，點(diǎn)樣端置于負(fù)極，槽架上以雙層濾紙作橋墊，濾紙的一端與支架的前沿對(duì)齊，另一端浸入電極槽的緩沖液中。用緩沖液將濾紙全部浸潤(rùn)并驅(qū)除氣泡。膜條與濾紙需貼緊，待平衡5 min后通電，電壓為160500V，電流為0.4 mA/cm，通電25-35 分鐘左右關(guān)閉電源。4記錄結(jié)果 通電完畢后用鑷子將薄膜取出，于紫外燈下觀察，用鉛筆將吸收紫外光的暗斑圈