血紅蛋白的提取和分離學案

1、血紅蛋白的提取和分離學案張建尚 江蘇省贛榆高級中學【學習目標】1.嘗試對血液中血紅蛋白的提取和分離，體驗從復雜體系中提取生物大分子的基本過程和方法。2.了解色譜法、電泳法等分離生物大分子的基本原理?！局攸c和難點】重點: 凝膠色譜法的原理和方法。難點: 樣品的預處理；色譜柱填料的處理和色譜柱的裝填?！菊n前預習】1.不同的蛋白質(zhì)通過凝膠時，相對分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)容易進入凝膠內(nèi)部的通道，路程 ，移動速度 ，而相對分子質(zhì)量 的蛋白質(zhì)無法進入凝膠內(nèi)部的通道，只能在 移動，路程 ，移動速度 ，相對分子質(zhì)量不同的蛋白質(zhì)因此得以分離。1.較小較長較慢較大凝膠外部較短較快2.在一定范圍內(nèi)，緩沖溶液抵制外界的&#

2、160;      對溶液pH的影響，維持pH     。電泳是利用了待分離樣品中各種分子 以及分子本身的 、 的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的 ，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。2.酸或堿基本不變帶電性質(zhì)的差異大小形狀遷移速度3.采用        的方法分離紅細胞。紅細胞洗滌的目的是        ，以利于后續(xù)步驟的分離純化。在洗滌好的紅細胞中加入   

3、60;      ，充分攪拌后紅細胞破裂，釋放出血紅蛋白。血紅蛋白溶液經(jīng)離心后，明顯分為4層，從上到下的主要成分分別是                  。對血紅蛋白溶液進行透析的目的是去除        。3.低速短離心去除雜蛋白蒸餾水和甲苯甲苯、脂溶性物質(zhì)、血紅蛋白和沉淀物分子量較小的雜質(zhì)4.制作凝膠色譜柱的材料有 

4、0;               。 裝填凝膠色譜柱的材料是       ，裝填時要      緩慢倒人色譜柱內(nèi)，不能有    存在。裝填完后，用20mmol/L的 充分洗滌平衡凝膠12h。加樣時用吸管小心地將1mL透析后的樣品加到       的頂端，注意不要破壞&#

5、160;       。4.玻璃管、橡皮塞、移液管、尼龍紗、尼龍網(wǎng)凝膠一次性氣泡磷酸緩沖液凝膠色譜柱的頂端凝膠面【課堂探究】一、基礎(chǔ)知識1.下圖是凝膠色譜法分離蛋白質(zhì)的原理，據(jù)圖分析：凝膠顆粒蛋白質(zhì)a蛋白質(zhì)bA（1）（2）（3）（4）（5）B多孔板（1）圖A中蛋白質(zhì)a能進入凝膠顆粒內(nèi)部而蛋白質(zhì)b被排阻在凝膠顆粒外面的原因是 。所以蛋白質(zhì) 在圖B中的路程就短，移動速度 ，當它從凝膠柱中洗脫出來時，蛋白質(zhì) 還在行進中。（2）除了上述原理外，還可以利用哪些原理分離蛋白質(zhì)？ 。一、1.（1）蛋白質(zhì)a的相對分子質(zhì)量較小，蛋白質(zhì)b的相對分子質(zhì)量較

6、大b較快a（2）蛋白質(zhì)的形狀、所帶電荷的性質(zhì)和多少、溶解度、吸附性質(zhì)和對其他分子的親和力2.人體血漿中的H2CO3/NaHCO3、NaH2PO4/Na2HPO4等的作用是 ，體內(nèi)細胞或物質(zhì)在體外是否需要與體內(nèi)一樣的環(huán)境條件才能保持原有的生物活性？ 。怎樣使其保持與體內(nèi)一樣的酸堿度呢？ 。2.緩沖酸和堿對血漿pH的影響，維持血漿pH基本不變是利用配制的緩沖溶液模擬體內(nèi)的pH環(huán)境3.電泳時，帶正電和負電的蛋白質(zhì)在電場中的遷移方向是 ；若蛋白質(zhì)的帶電性質(zhì)和數(shù)量相同，但蛋白質(zhì)的分子大小不同，則蛋白質(zhì)在電場中的遷移情況是 。葉綠體色素分離使用的支持物是 ，電泳分離蛋白質(zhì)使用的支持物是 。SDS-聚丙烯酰

7、胺凝膠電泳的遷移率完全取決于 。3.帶正電的蛋白質(zhì)向陰極遷移，帶負電的蛋白質(zhì)向陽極遷移向同一極遷移，但分子大遷移慢，分子小的遷移快濾紙凝膠分子的大小二、實驗操作1.分析與樣品處理有關(guān)的問題：（1）分離紅細胞離心速度不能過高和時間過長的原因是 。洗滌紅細胞的目的是 。用生理鹽水洗滌紅細胞的原因是 。洗滌次數(shù)不能過少的原因是 。洗滌成功的標志是 。（2）在紅細胞液中加入蒸餾水的目的是 ，甲苯的作用是 ，充分攪拌的目的是 。透析袋AB（3）將血紅蛋白從混合液中分離出來所使用的方法是 。右圖是分離結(jié)果示意圖，圖中的物理性質(zhì)分別是 ，主要成分分別是 。將血紅蛋白從中分離出來要經(jīng)過 過濾和 分離兩步。（4

8、）右圖裝置用于 ，其目的是 。若B是血紅蛋白溶液，則A是 。1.（1）離心速度過高和時間過長會使白細胞等一同沉淀，達不到分離效果去除雜蛋白，以利于后續(xù)步驟的分離純化生理鹽水是等滲溶液，能夠維持紅細胞正常的形態(tài)洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白上清液中沒有黃色（2）讓紅細胞吸水脹破瓦解細胞膜加速紅細胞破裂（3）離心無色透明液體、白色薄層固體、紅色透明液體、暗紅色沉淀物甲苯、脂溶性物質(zhì)、血紅蛋白、紅細胞破碎物濾紙分液漏斗（4）血紅蛋白的粗分離除去樣品中分子量較小的雜質(zhì)20mol/L的磷酸緩沖液打孔安裝玻璃管挖出凹穴a b c d e f2.以下是凝膠色譜柱的制作過程圖解，正確的順序是 。2.aebdc

9、f3.右圖是裝填的凝膠色譜柱，據(jù)圖分析：aSephadexG-75（1）圖中“G”表示 ，75表示 。加入前需放在洗脫液中膨脹，為了加速膨脹，可用沸水浴加熱，這樣不但可以節(jié)約時間，而且可以 。（2）裝填凝膠時要先打開a ，然后一次性倒入并輕輕敲動色譜柱，目的是 。裝填過程中若發(fā)現(xiàn)有氣泡存在，必須重裝，因為氣泡會 ，降低分離效果。（3）裝填完后，為了使凝膠裝填緊密，還需使用 充分洗滌平衡凝膠12h。該過程中出現(xiàn)何種現(xiàn)象需要重新裝填凝膠色譜柱？ 。3.（1）凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍凝膠得水值除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣（2）螺旋夾使凝膠裝填均勻攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序

10、（3）20mmol/L的磷酸緩沖液洗脫液流干，露出凝膠顆粒 a b c d樣品樣品A B操作壓e4.下圖A是樣品的加入示意圖，圖B是洗脫示意圖。（1）加樣前需先讓凝膠面上的緩沖液下降至與凝膠面平齊，操作方法是 。加樣時正確的操作次序是 。（2）洗脫液e是 ，洗脫時要打開 ，待 接近色譜柱底端時，用試管收集流出液。（3）如何確定色譜柱的制作是成功的？ 。5.（1）打開色譜柱下端的流出口bcad（2）20mmol/L的磷酸緩沖液色譜柱下端的流出口紅色的蛋白質(zhì)（1）紅色區(qū)帶均勻一致地移動【課堂鞏固】1.下列有關(guān)血紅蛋白提取和分離實驗的敘述錯誤的是（ ）A.樣品的處理就是通過一系列操作收集到血紅蛋白溶

11、液B.通過透析可以去除樣品中分子質(zhì)量較大的雜質(zhì)，此為樣品的粗提取C.通過凝膠色譜法可除去雜質(zhì)蛋白，即樣品的純化D.可通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定血紅蛋白的純度1.B【解析】血紅蛋白提取和分離的程序可以分為四大步，即樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，此為樣品的處理，A項正確；再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，此為樣品的粗分離，B項錯誤；通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大于或小于血紅蛋白的雜質(zhì)蛋白除去，此為樣品的純化，C項正確；經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定，D項正確。acbd ····

12、83;··2.凝膠色譜法是一種快速而又簡單的分離技術(shù)，請據(jù)圖回答相關(guān)問題：（1）a、b均為蛋白質(zhì)分子，其中先從層析柱中洗脫出來的是 ，原因是 。（2）自己制作凝膠色譜柱時，在色譜柱底部d位置相當于多孔板的結(jié)構(gòu)可由 替代。（3）凝膠色譜柱的直徑大小會影響分離的效果嗎? 。圖中a和b的分離度與凝膠色譜柱的高度有關(guān)嗎? 。（4）在哪些情況下需要重裝凝膠色譜柱？ 。（5）洗脫用的液體應(yīng)盡量與浸泡凝膠所用的液體          (填“相同”或“不同”)，洗脫時，對洗脫液的流速要求是