微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)

1、課題微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)備課時(shí)間上課時(shí)間總課時(shí)數(shù)課程目標(biāo)知識(shí)與技能了解有關(guān)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識(shí)；掌握培養(yǎng)基的制備、高壓蒸汽滅菌和平板劃線法等基本操作技術(shù)過(guò)程與方法分析實(shí)驗(yàn)思路的確定和形成的原因，分析實(shí)驗(yàn)流程，對(duì)比前面的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，歸納共性，分析差異，增加印象情感態(tài)度與價(jià)值觀形成勇于實(shí)踐、嚴(yán)謹(jǐn)求實(shí)的科學(xué)態(tài)度和科學(xué)精神教學(xué)重點(diǎn)無(wú)菌技術(shù)的操作教學(xué)難點(diǎn)無(wú)菌技術(shù)的操作教學(xué)過(guò)程二次備課一、情境導(dǎo)入在傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)的應(yīng)用中，都利用了微生物的發(fā)酵作用，其中的微生物來(lái)自于制作過(guò)程中的自然感染。而在工業(yè)化生產(chǎn)中，為了提高發(fā)酵的質(zhì)量，需要獲得優(yōu)良菌種，并保持發(fā)酵菌種的純度。這就要涉及到微生物的培養(yǎng)、分離、鑒別等基本技術(shù)。現(xiàn)在

2、我們開(kāi)始學(xué)習(xí)微生物的培養(yǎng)和應(yīng)用專題。二、授新課1基礎(chǔ)知識(shí)11 培養(yǎng)基的種類包括 固體 培養(yǎng)基和 液體 培養(yǎng)基等。思考1瓊脂是從紅藻中提取的 多糖 ，在配制培養(yǎng)基中用作為 凝固劑 ?！狙a(bǔ)充】培養(yǎng)基的類型及其應(yīng)用：標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基類型配制特點(diǎn)主要應(yīng)用物理性質(zhì)固體培養(yǎng)基加入瓊脂較多菌種分離,鑒定,計(jì)數(shù)半固體培養(yǎng)基加入瓊脂較少菌種保存液體培養(yǎng)基不加入瓊脂工業(yè)生產(chǎn)，連續(xù)培養(yǎng)化學(xué)組成合成培養(yǎng)基由已知成分配制而成，培養(yǎng)基成分明確菌種分類、鑒定天然培養(yǎng)基由天然成分配制而成，培養(yǎng)基成分不明確工業(yè)生，產(chǎn)降低成本目的用途鑒別培養(yǎng)基添加某種指示劑或化學(xué)藥劑菌種的鑒別選擇培養(yǎng)基添加（或缺少）某種化學(xué)成分菌種的分離12 培養(yǎng)基

3、的化學(xué)成分包括 水 、 無(wú)機(jī)鹽 、 碳源 、 氮源 四類營(yíng)養(yǎng)成分。思考2從細(xì)胞的化學(xué)元素組成來(lái)看，培養(yǎng)基中為什么都含有這些營(yíng)養(yǎng)成分？C、H、O、N、P、S是構(gòu)成細(xì)胞原生質(zhì)的基本元素，約占原生質(zhì)總量的97以上?！狙a(bǔ)充】碳源：如CO2、糖類、脂肪酸等有機(jī)物，構(gòu)成微生物的結(jié)構(gòu)物質(zhì)和分泌物，并提供能量。氮源：如N2、氨鹽、硝酸鹽、牛肉膏、蛋白胨等，主要用來(lái)合成蛋白質(zhì)、核酸及含氮代謝物等。含有C、H、O、N的化合物既可以作為碳源，又可以作為氮源，如氨基酸等。13 培養(yǎng)基除滿足微生物生長(zhǎng)的 pH 、 特殊營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 和 氧氣 等要求?！狙a(bǔ)充】生長(zhǎng)因子：某些微生物正常生長(zhǎng)代謝過(guò)程中必須從培養(yǎng)基中吸收的微量有機(jī)

4、小分子，如某些氨基酸、堿基、維生素等。思考3牛肉膏和蛋白胨主要為微生物提供 糖 、 維生素 和 有機(jī)氮 等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。思考4培養(yǎng)乳酸桿菌時(shí)需要添加 維生素 ，培養(yǎng)霉菌時(shí)需要將培養(yǎng)基pH調(diào)節(jié)為 酸性 ，培養(yǎng)細(xì)菌時(shí)需要將pH調(diào)節(jié)為 中性或微堿性 。活動(dòng)2：閱讀“無(wú)菌技術(shù)”，討論回答下列問(wèn)題：14 獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是 防止外來(lái)雜菌的入侵 。15 無(wú)菌技術(shù)包括：（1）對(duì)實(shí)驗(yàn)操作空間、操作者的衣著和手進(jìn)行 清潔和消毒 ；（2）將培養(yǎng)器皿、接種用具和培養(yǎng)基等器具進(jìn)行 滅菌 ；（3）為避免周?chē)⑸镂廴荆瑢?shí)驗(yàn)操作應(yīng)在 酒精燈火焰附近 旁進(jìn)行；（4）避免已滅菌處理的材料用具與 周?chē)锲?相接觸。比較項(xiàng)理化因

5、素的作用強(qiáng)度消滅微生物的數(shù)量芽孢和孢子能否被消滅消毒較為溫和部分生活狀態(tài)的微生物不能滅菌強(qiáng)烈全部微生物能16 比較消毒和滅菌（填表）思考5無(wú)菌技術(shù)除了防止培養(yǎng)物被污染外，還具有的目的是 防止感染實(shí)驗(yàn)操作者 。17 消毒方法：（1）日常生活經(jīng)常用到的是 煮沸 消毒法；（2）對(duì)一些不耐高溫的液體，則使用 巴氏 消毒法（作簡(jiǎn)要介紹）；（3）對(duì)接種室、接種箱或超凈工作臺(tái)首先噴灑 石炭酸或煤酚皂 等溶液以增強(qiáng)消毒效果，然后使用 紫外線 進(jìn)行物理消毒。（4）實(shí)驗(yàn)操作者的雙手使用 酒精 進(jìn)行消毒；（5）飲水水源用 氯氣 進(jìn)行消毒。18滅菌方法：（1）接種環(huán)、接種針、試管口等使用 灼燒 滅菌法；（2）玻璃器皿

6、、金屬用具等使用 干熱 滅菌法，所用器械是 干熱滅菌箱 ；（3）培養(yǎng)基、無(wú)菌水等使用 高壓蒸汽 滅菌法，所用器械是 高壓蒸汽滅菌鍋 。（4）表面滅菌和空氣滅菌等使用 紫外線 滅菌法，所用器械是 紫外燈 。思考6對(duì)接種環(huán)滅菌時(shí)要用酒精燈的 充分燃燒 層火焰灼燒可能伸入試管或培養(yǎng)皿的部位。思考7利用干熱滅菌箱對(duì)玻璃器皿滅菌時(shí)物品不能擺得太擠，目的是避免妨礙熱空氣流通。思考8物品裝入高壓蒸汽滅菌鍋滅菌后，要首先打開(kāi)排氣閥，煮沸并排除鍋內(nèi)冷空氣，其目的是 有利于鍋內(nèi)溫度升高 ；隨后關(guān)閉排氣閥繼續(xù)加熱，氣壓升至 100k Pa，溫度為 121 ，并維持 1530 min；最后切斷熱源，使溫度自然降溫，氣

7、壓務(wù)必降至 零 時(shí)打開(kāi)鍋蓋，其目的是防止 容器中的液體暴沸 ?！狙a(bǔ)充】培養(yǎng)基的配制原則：目的要明確：根據(jù)培養(yǎng)的微生物種類、培養(yǎng)的目的等確定培養(yǎng)基的類型和配制量。營(yíng)養(yǎng)要協(xié)調(diào)：培養(yǎng)基中各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例要適宜。例如：碳氮比41時(shí)，谷氨酸棒狀桿菌大量繁殖而產(chǎn)生谷氨酸少；碳氮比為31時(shí)，菌體繁殖受抑制而谷氨酸合成量大增。pH要適宜：細(xì)菌培養(yǎng)基pH中性或偏堿性，霉菌培養(yǎng)基呈酸性。2實(shí)驗(yàn)操作21 計(jì)算：根據(jù)配方比例，計(jì)算100mL培養(yǎng)基各成分用量。22 稱量：準(zhǔn)確稱取各成分。稱取牛肉膏和蛋白胨時(shí)動(dòng)作要迅速，目的是防止牛肉膏吸收空氣中水分。23 溶化：加水加熱熔化牛肉膏；加入蛋白胨和氯化鈉繼續(xù)加熱；加

8、入瓊脂；用蒸餾水定容到100mL。整個(gè)過(guò)程不斷用玻棒攪拌，目的是防止瓊脂糊底而導(dǎo)致燒杯破裂。24 調(diào)pH：用1mol/LNaOH溶液調(diào)節(jié)pH至偏堿性。25 滅菌：將配制好的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中，加塞包扎后用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌；所用培養(yǎng)皿用報(bào)紙包扎后用干熱滅菌箱滅菌。26 倒平板：待培養(yǎng)基冷卻至50左右時(shí)在酒精燈火焰附近操作進(jìn)行。其過(guò)程是：在火焰旁右手拿錐形瓶，左手拔出棉塞；右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過(guò)火焰；左手將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，立刻蓋上皿蓋。待平板冷卻凝固后，將平板倒過(guò)來(lái)放置。思考1錐形瓶的瓶口通過(guò)火焰的目的是消滅瓶口的雜菌，防止雜菌感染培養(yǎng)基。思考2倒平板

9、的目的是防止培養(yǎng)基冷卻過(guò)程中形成的水滴落到培養(yǎng)基表面。思考3若皿蓋和皿底之間粘有培養(yǎng)基，則該平板能否培養(yǎng)微生物？為什么？不能。空氣中雜菌會(huì)在這些粘附培養(yǎng)基上繁殖，并污染皿內(nèi)培養(yǎng)基。思考4配制斜面培養(yǎng)基中，試管要加塞棉塞的目的是保持通氣并防止雜菌感染。思考5試管培養(yǎng)基形成斜面的作用是增大接種面積。27 接種271微生物接種的最常用方法是平板劃線法和稀釋涂布法，另外還有穿刺接種和斜面接種等。272平板劃線法：通過(guò)接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養(yǎng)基表面。其操作步驟是：將接種環(huán)在酒精燈火焰上灼燒直至燒紅。在酒精燈火焰旁冷卻接種環(huán)，并打開(kāi)大腸桿菌的菌種試管的棉塞。

10、將菌種試管口通過(guò)火焰達(dá)到消滅試管口雜菌的目的。將冷卻的接種環(huán)伸入到菌液中取出一環(huán)菌種。將菌種試管口再次通過(guò)火焰后塞上棉塞。將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，把接種環(huán)伸入平板內(nèi)劃35條平行線，蓋上皿蓋，不要?jiǎng)澠婆囵B(yǎng)基。灼燒接種環(huán)，冷卻后從第一區(qū)劃線末端開(kāi)始向第二區(qū)域內(nèi)劃線。重復(fù)上述過(guò)程，完成三、四、五區(qū)域內(nèi)劃線。注意不要將第五區(qū)的劃線與第一區(qū)劃線相連。將平板倒置放在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。思考6取菌種前灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上的微生物；除第一次劃線外，其余劃線前都要灼燒接種環(huán)的目的是消滅接種環(huán)上殘留菌種；取菌種和劃線前都要求接種環(huán)冷卻后進(jìn)行，其目的是防止高溫殺死菌種；最后灼燒接種環(huán)的目的是防止細(xì)菌污染環(huán)境和操作者

11、。思考7在第1次劃線后都從上次劃線末端開(kāi)始的目的是獲得由單個(gè)細(xì)菌形成的標(biāo)準(zhǔn)菌落。273稀釋涂布平板法：將菌液進(jìn)行一系列梯度稀釋，并將不同稀釋度菌液分別涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)稀釋倍數(shù)足夠高時(shí)，即可獲得單個(gè)細(xì)菌形成的標(biāo)準(zhǔn)菌落。274系列稀釋操作：取盛有9mL水的無(wú)菌試管6支，編號(hào)101、102、103、104、105、106。用灼燒冷卻的移液管吸取1mL菌液注入編號(hào)為101試管中，并吹打3次，使之混勻。從101倍液中吸取1mL菌液注入到編號(hào)為102試管內(nèi)吹打均勻，獲得102倍液。依此類推。思考8操作中試管口和移液管應(yīng)在離火焰12cm處。整個(gè)操作過(guò)程中使用了1支移液管。3結(jié)果分析與評(píng)價(jià)3

12、1培養(yǎng)未接種培養(yǎng)基的作用是對(duì)照，若有菌落形成，說(shuō)明培養(yǎng)基滅菌不徹底。32在肉湯培養(yǎng)基上，大腸桿菌菌落呈白色，為圓形，光滑有光澤，邊緣整齊。33培養(yǎng)12h和24h后的菌落大小不同（相同、不同）；菌落分布位置相同（相同、不同）。原因是時(shí)間越長(zhǎng)，菌落中細(xì)菌繁殖越多，菌落體積越大；菌落的位置不動(dòng)，但菌落數(shù)增多。思考9在某培養(yǎng)基上出現(xiàn)了3種特征不同的菌落，原因有培養(yǎng)基滅菌不徹底或雜菌感染等。思考10頻繁使用的菌種利用臨時(shí)保藏法保存，長(zhǎng)期保存菌種的方法是甘油管藏法。前者利用固體斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后，保存在4冰箱中，每36個(gè)月轉(zhuǎn)種培養(yǎng)一次，缺點(diǎn)是保存時(shí)間較短，容易發(fā)生污染和變異；后者將菌種與無(wú)菌體積等量混合后保

13、存在20冷凍箱中。三、當(dāng)堂反饋例1關(guān)微生物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的敘述中，正確的是A.是碳源的物質(zhì)不可能同時(shí)是氮源 B.凡碳源都提供能量C.除水以外的無(wú)機(jī)物只提供無(wú)機(jī)鹽 D.無(wú)機(jī)氮源也能提供能量解析：不同的微生物，所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有較大差別，要針對(duì)微生物的具體情況分析。對(duì)于A、B選項(xiàng)，它的表達(dá)是不完整的。有的碳源只能是碳源，如二氧化碳；有的碳源可同時(shí)是氮源，如NH4HCO3；有的碳源同時(shí)是能源，如葡萄糖；有的碳源同時(shí)是氮源，也是能源，如蛋白胨。對(duì)于C選項(xiàng)，除水以外的無(wú)機(jī)物種類繁多，功能也多樣。如二氧化碳，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源；NaHC O3，可作為自養(yǎng)型微生物的碳源和無(wú)機(jī)鹽；而NaCl則只能提供無(wú)機(jī)鹽。對(duì)于

14、D選項(xiàng)，無(wú)機(jī)氮源提供能量的情況還是存在的，如NH3可為硝化細(xì)菌提供能量和氮源。答案：D例2下面對(duì)發(fā)酵工程中滅菌的理解不正確的是A.防止雜菌污染 B.消滅雜菌C.培養(yǎng)基和發(fā)酵設(shè)備都必須滅菌 D.滅菌必須在接種前解析：滅菌是微生物發(fā)酵過(guò)程的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。A說(shuō)的是滅菌的目的，因?yàn)榘l(fā)酵所用的菌種大多是單一的純種，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程不能混入其他微生物（雜菌），所以是正確的；B是錯(cuò)誤的，因?yàn)闇缇哪康氖欠乐闺s菌污染，但實(shí)際操作中不可能只消滅雜菌，而是消滅全部微生物。C是正確的，因?yàn)榕c發(fā)酵有關(guān)的所有設(shè)備和物質(zhì)都要滅菌；發(fā)酵所用的微生物是滅菌后專門(mén)接種的，滅菌必須在接種前，如果接種后再滅菌就會(huì)把所接菌種也殺死。答案：B四、課堂小結(jié)微生物的實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)培