EColi感受態(tài)細(xì)胞的制備質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化提取與酶切鑒定

1、一一. 實驗?zāi)康暮鸵髮嶒災(zāi)康暮鸵?1、通過本實驗了解和掌握氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞和質(zhì)粒DNADNA轉(zhuǎn)化受體菌細(xì)胞的原理與技術(shù)；2 2、了解質(zhì)粒DNA的特性，掌握堿裂解法從大腸桿菌細(xì)胞中分離、提取質(zhì)粒DNA的方法；3、掌握限制性內(nèi)切酶的特性、酶解和瓊脂糖凝膠電泳的操作方法； 通過本實驗了解大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備、DNA轉(zhuǎn)化、限制性內(nèi)切酶在分子生物學(xué)研究中的意義與作用。二二.實驗原理實驗原理 1 1、感受態(tài)細(xì)胞制備: :所謂感受態(tài)是指受體細(xì)胞處于容易吸收外源DNADNA的一種生理狀態(tài)，可以通過物理與化學(xué)方法誘導(dǎo)形成，也可以自然形成，在基因工程技術(shù)中通常采用誘導(dǎo)的方法。用于轉(zhuǎn)化的受體菌細(xì)

2、胞一般是限制- -修飾系統(tǒng)（Restriction-ModificationRestriction-Modification）缺陷的變異株，以防止對導(dǎo)入的外源DNADNA的切割，用符號R R- -M M- -表示。其基本原理是：細(xì)菌處于00的CaClCaCl2 2低滲溶液中，會膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNADNA形成抗DNaseDNase的羥基- -鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng) 過過42短時間的熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收短時間的熱激處理，促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)復(fù)合物，在豐富的培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞合物，在豐富的培養(yǎng)基上生長數(shù)小時后，球狀細(xì)胞復(fù)原并分裂增殖，在選

3、擇培養(yǎng)基上可獲得所需的復(fù)原并分裂增殖，在選擇培養(yǎng)基上可獲得所需的轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)化子化子。 2、堿裂解法小量制備質(zhì)粒、堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA：堿裂解法是：堿裂解法是基于線性大分子染色體基于線性大分子染色體DNA與小分子環(huán)形質(zhì)粒與小分子環(huán)形質(zhì)粒D N A 的 變 性 復(fù) 性 的 差 異 達(dá) 到 分 離 目 的 的 ， 在的 變 性 復(fù) 性 的 差 異 達(dá) 到 分 離 目 的 的 ， 在pH12.012.6的堿性環(huán)境中，線型染色體的堿性環(huán)境中，線型染色體DNA和和環(huán)型質(zhì)粒環(huán)型質(zhì)粒DNA氫鍵會發(fā)生斷裂，雙鏈解開而變性，氫鍵會發(fā)生斷裂，雙鏈解開而變性，但質(zhì)粒但質(zhì)粒DNA由于其閉合環(huán)型結(jié)構(gòu)，氫鍵僅發(fā)生部分由于其

4、閉合環(huán)型結(jié)構(gòu)，氫鍵僅發(fā)生部分?jǐn)嗔?，而且其互補(bǔ)鏈不完全分離；當(dāng)將斷裂，而且其互補(bǔ)鏈不完全分離；當(dāng)將pH值調(diào)節(jié)到值調(diào)節(jié)到中性并在高鹽濃度下，已分開的染色體中性并在高鹽濃度下，已分開的染色體DNA互補(bǔ)鏈互補(bǔ)鏈不能復(fù)性而交聯(lián)形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，不能復(fù)性而交聯(lián)形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過離心，大部分染色體大部分染色體DNA、不穩(wěn)定的大分子、不穩(wěn)定的大分子 RNA和蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起沉淀下來而被除復(fù)合物等一起沉淀下來而被除去，而部分變性的閉合環(huán)狀的質(zhì)粒去，而部分變性的閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA在中性條件在中性條件下很快復(fù)性，恢復(fù)到原來的構(gòu)型，呈可溶性狀態(tài)保存下很快復(fù)性，恢復(fù)到原來的構(gòu)型，呈

5、可溶性狀態(tài)保存與溶液中，離心后上清中便含有所需要的質(zhì)粒與溶液中，離心后上清中便含有所需要的質(zhì)粒DNA。 3、限制性內(nèi)切酶：、限制性內(nèi)切酶：又稱為內(nèi)切酶或限制酶，又稱為內(nèi)切酶或限制酶，是一類能識別雙鏈?zhǔn)且活惸茏R別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的分子特異性核酸序列的DNA水解酶，是體外剪切基因片段的重要工具，主要存在水解酶，是體外剪切基因片段的重要工具，主要存在于原核生物中。于原核生物中。根據(jù)限制酶的識別切割特性，根據(jù)限制酶的識別切割特性， 催化催化條件及是否具有修飾酶活性可分為條件及是否具有修飾酶活性可分為、III型三大型三大類，類，類和類和III類限制性內(nèi)切酶，在同一蛋白分子中兼類限制性內(nèi)切酶，

6、在同一蛋白分子中兼有有甲基化作用甲基化作用及依賴及依賴ATP的限制性內(nèi)切酶活性的限制性內(nèi)切酶活性。類類限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識別位點，但卻隨機(jī)地切割限制性內(nèi)切酶結(jié)合于特定識別位點，但卻隨機(jī)地切割回轉(zhuǎn)到被結(jié)合回轉(zhuǎn)到被結(jié)合 處的處的DNA。類限制性內(nèi)切酶在識別位點上切割，類限制性內(nèi)切酶在識別位點上切割，然后從底物上解離下來。故然后從底物上解離下來。故類和類和限制酶在基因工限制酶在基因工程中基本不用，程中基本不用，II類酶在分子克隆中使用廣泛，其基類酶在分子克隆中使用廣泛，其基本特點如下：本特點如下： (1)、專一性地識別并切割特定的核苷酸序列，、專一性地識別并切割特定的核苷酸序列，如如EcoR I

7、識別與切割序列為識別與切割序列為5GAATTC3 3CTTAAG5 (2) 、識別的核苷酸數(shù)目大多數(shù)為、識別的核苷酸數(shù)目大多數(shù)為46個，少個，少數(shù)識別數(shù)識別813個；個； (3)、識別序列大多數(shù)為、識別序列大多數(shù)為二重對稱（回文序列）二重對稱（回文序列），大多數(shù)酶產(chǎn)生的是具有凸出的大多數(shù)酶產(chǎn)生的是具有凸出的粘性末端粘性末端： (4) (4)、有不同來源的限制性內(nèi)切酶可以識別相同的序列，甚至切割的位點也相同，稱為同裂酶或異源同工酶，如Hpa IIHpa II與Msp IMsp I；有的識別位點不同，但對DNADNA切割后可產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶，如BamHBamH I I與BglBgl

8、IIII。 影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素影響核酸限制性內(nèi)切酶活性的因素： DNADNA的純度；的純度； DNADNA的甲基化程度；的甲基化程度； 酶切消化反應(yīng)的溫度；酶切消化反應(yīng)的溫度； DNADNA的分子結(jié)構(gòu)；溶液中離子濃度及種類；的分子結(jié)構(gòu)；溶液中離子濃度及種類； 緩沖液的緩沖液的 pHpH值。值。 4、瓊脂糖凝膠電泳、瓊脂糖凝膠電泳: 瓊脂糖溶化再凝固后能瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶具有一定形狀、大小與孔隙度的固體基質(zhì)形成帶具有一定形狀、大小與孔隙度的固體基質(zhì) (密度與瓊脂糖濃度相關(guān)密度與瓊脂糖濃度相關(guān))；而生理條件下，核酸分；而生理條件下，核酸分子的糖子的糖-磷酸骨架中磷酸基團(tuán)呈磷酸骨

9、架中磷酸基團(tuán)呈離子化離子化狀態(tài)，因此將狀態(tài)，因此將核酸分子置于電場中時，它們會向正極遷移，由于核酸分子置于電場中時，它們會向正極遷移，由于糖糖-磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性，相同數(shù)量的雙鏈磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以同樣的幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以同樣的速度向正極方向遷移。在一定的電場強(qiáng)度下，速度向正極方向遷移。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)象。分子的遷移率取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)象。分子量較小的分子量較小的DNA分子，比分子量較大的分子，比分子量較大的DNA分分子，具有較緊密的構(gòu)型，所以子，具有較

10、緊密的構(gòu)型，所以其電泳遷移速率也就其電泳遷移速率也就比同等分子量的松散型的開環(huán)比同等分子量的松散型的開環(huán)DNA分子或線性分子或線性DNA分子要快分子要快。直接用低濃度的。直接用低濃度的EB進(jìn)行染進(jìn)行染色，可確定DNA在膠中的位置。 影響瓊脂糖凝膠電泳影響瓊脂糖凝膠電泳DNADNA遷移率的因素：遷移率的因素： DNADNA的分子大小； 瓊脂糖濃度； DNADNA構(gòu)象； 電場強(qiáng)度； 堿基組成與溫度；嵌入染料的存在；電泳緩沖液的組成。 三實驗材料與設(shè)備：三實驗材料與設(shè)備：1 1、用品與與儀器：、用品與與儀器： 超凈工作臺、電熱恒溫水浴、分光光度計、恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、移液器、微型離心管等、臺式冷

11、凍高速離心機(jī)、旋渦震蕩器、電泳儀、電泳槽、紫外透射儀，凝膠成像儀、冰箱、制冰機(jī)等； 1.5mL 1.5mL 與0.5mL Eppendorf 0.5mL Eppendorf 管、tiptip頭 、燒杯、量筒 鑷子、試管三角瓶、玻璃涂棒、酒精燈、無菌牙簽、鑷子、試管三角瓶、玻璃涂棒、酒精燈、無菌牙簽、 吸水紙，一次性塑料手套等；吸水紙，一次性塑料手套等； E.coli DH5受體菌受體菌(R-M-)， pGEX-PDIP-r質(zhì)粒質(zhì)粒(AmpR)2、試劑： LBLB培養(yǎng)基培養(yǎng)基: :蛋白胨蛋白胨 10g/L10g/L，酵母提取物，酵母提取物 5g/L5g/L， NaCl 10g/LNaCl 10g

12、/L，瓊脂粉，瓊脂粉 15g/L15g/L（固體培養(yǎng)基），用（固體培養(yǎng)基），用10 10 mol/Lmol/L的的NaOHNaOH調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)pHpH為為7.07.0，高壓滅菌；，高壓滅菌； 氨芐青霉素貯存液：濃度氨芐青霉素貯存液：濃度50-100mg50-100mgmLmL； 含有抗菌素的含有抗菌素的LBLB平板培養(yǎng)基：將配置好的平板培養(yǎng)基：將配置好的LBLB固固體培養(yǎng)基高壓滅菌后，冷卻到體培養(yǎng)基高壓滅菌后，冷卻到6060度左右，加入氨芐青度左右，加入氨芐青霉素（終濃度為霉素（終濃度為50g50gmLmL濃度濃度50-100g50-100gmLmL）；）； 0.1mol/LCaCl0.1mol/

13、LCaCl2 2：稱?。悍Q取1.1g1.1g進(jìn)口無水進(jìn)口無水CaClCaCl2 2，溶，溶于于70mL70mL雙蒸水中，定容到雙蒸水中，定容到100mL100mL，過濾后滅菌；，過濾后滅菌； 0.1mol/LCaCl0.1mol/LCaCl2 2 1515甘油：甘油：100ml 0.1mol/L 100ml 0.1mol/L CaClCaCl2 2 溶液內(nèi)含有溶液內(nèi)含有15ml15ml甘油，高壓滅菌；甘油，高壓滅菌； 溶液溶液I: 50mmol/LI: 50mmol/L葡萄糖，葡萄糖，10mmol/L EDTA 10mmol/L EDTA (pH8.0)(pH8.0)， 25mmol/L Tr

14、is-HCl (pH8.0)25mmol/L Tris-HCl (pH8.0)； 溶液溶液II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS II: 0.2mol/L NaOH, 1%SDS ( (現(xiàn)配現(xiàn)現(xiàn)配現(xiàn)用用) )； 溶液溶液III: III: 乙酸鉀溶液乙酸鉀溶液(3M, pH=4.8)( 60mL(3M, pH=4.8)( 60mL的的5mol/L KAc, 11.5ml 5mol/L KAc, 11.5ml 冰醋酸，冰醋酸，28.5mL H2O)28.5mL H2O)； RNase ARNase A： 10mg/ml10mg/ml； TETE緩沖液緩沖液: 10mmol/L: 10m

15、mol/L，Tris-HCl, Tris-HCl, 1mmol/L1mmol/L，EDTAEDTA，pH8.0pH8.0； 5TBE緩沖液：緩沖液：0.45mol/L Tris硼酸，硼酸，0.01 mol/L EDTA, pH 8.0； 10Loading buffer：1% SDS, 0.05%溴溴酚蘭，酚蘭，50的甘油；的甘油； 無水乙醇；無水乙醇； 7070乙醇；乙醇； 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段；標(biāo)準(zhǔn)分子量片段； 核酸內(nèi)切酶核酸內(nèi)切酶 EcoR I (TaKaRa)； EcoR I酶解緩沖液酶解緩沖液(10 buffer H)； 瓊脂糖；瓊脂糖； 溴化乙啶（溴化乙啶（EB）染色液）染色液(10mg

16、/ml)。四操作步驟四操作步驟: ( (一一) ) 感受態(tài)細(xì)胞的制備：感受態(tài)細(xì)胞的制備： 1 1、從新活化的E.coliE.coli DH5 DH5平板上挑取一單菌落，接種于3 35ml LB5ml LB液體培養(yǎng)中，3737振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期( (12h左右) )； 2 2、將該菌懸液以1:1001:1001:501:50轉(zhuǎn)接于100ml LB100ml LB液體培養(yǎng)基中，3737振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔202030min30min測一次ODOD600600，至ODOD600600為0.30.30.50.5時停止培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)裝到1.5 mL1.5 mL離心管中； 3 3、培養(yǎng)

17、物于冰上放置20min20min； 4 4、 0 044，4000g4000g離心10min10min，棄去上清液，加入1 mL1 mL冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液，小心懸浮細(xì)胞, , 冰浴2020分鐘；CaClCaCl2 2純度至關(guān)重要，不同廠家，純度至關(guān)重要，不同廠家，甚至同一廠家不同批號的產(chǎn)品均影響感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率甚至同一廠家不同批號的產(chǎn)品均影響感受態(tài)的轉(zhuǎn)化效率 5、04， 4000g離心10min，倒凈上清培養(yǎng)液，再用1.0 mL1.0 mL冰冷的0.1mo10.1mo1L L CaClCaCl2 2溶液輕輕懸浮細(xì)胞，冰浴20min20min； 6

18、6、 04， 4000g離心10min，棄去上清液，加入100 L100 L冰冷的0.1mo10.1mo1L L CaClCaCl2 2溶液，小心懸浮細(xì)胞，冰上放置片刻后，即制成了感受態(tài)細(xì)胞懸液； 8 8、制備好的感受態(tài)細(xì)胞懸液可直接用于轉(zhuǎn)化實驗，如果在4 4放置1224h，其轉(zhuǎn)化效率可以增高46倍；也可加入占總體積1515左右高壓滅菌過的甘油，混勻后分裝于1.5ml1.5ml離心管中，置于-70-70條件下，可保存半年至一年。（二）質(zhì)粒（二）質(zhì)粒DNADNA的轉(zhuǎn)化：的轉(zhuǎn)化： 1 1、每100L100L感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入1L1L質(zhì)粒DNA,DNA,輕輕搖勻，同時設(shè)置三組對照：( (1)1)不

19、加質(zhì)粒，(2)不加受體菌， (3)加已知具有轉(zhuǎn)化活性的質(zhì)粒DNA，具體操作按下表進(jìn)行：*陽性對照，用已知具有轉(zhuǎn)化活性的pGEX-PDIP-r質(zhì)粒DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化 2、冰上放置、冰上放置2030min，然后，然后42水浴水浴熱激熱激90120 Sec，迅速冰上冷卻迅速冰上冷卻2min； 3、 立即向上述立即向上述Ep管中加入管中加入0.8mL LB液體液體培養(yǎng)基，搖勻后于培養(yǎng)基，搖勻后于37振蕩培養(yǎng)約振蕩培養(yǎng)約1530min ，使，使受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)及表達(dá)抗性基因；受體菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)及表達(dá)抗性基因； 4、取培養(yǎng)液、取培養(yǎng)液50L接種于含抗菌素的接種于含抗菌素的LB平板平板培養(yǎng)基上，用玻璃

20、涂棒涂勻；培養(yǎng)基上，用玻璃涂棒涂勻； 5、將培養(yǎng)皿放在、將培養(yǎng)皿放在37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)30 min,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后，倒置培養(yǎng)皿，于37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜(14-16h) ；（三）堿裂解法小量制備質(zhì)粒（三）堿裂解法小量制備質(zhì)粒DNA:DNA: 1 1、挑取轉(zhuǎn)化篩選的帶有目的質(zhì)粒的大腸桿菌、挑取轉(zhuǎn)化篩選的帶有目的質(zhì)粒的大腸桿菌接種到液體培養(yǎng)基中，接種到液體培養(yǎng)基中，3737震蕩培養(yǎng)震蕩培養(yǎng)12121616小時；小時； 2 2、將、將1.5mL1.5mL菌液加入菌液加入EpEp離心管中，離心管中，12000 g12

21、000 g離心離心30 Sec30 Sec，棄上清液，在吸水紙上扣干；，棄上清液，在吸水紙上扣干； 離心時間不能太長，以免影響下一步的菌體懸浮離心時間不能太長，以免影響下一步的菌體懸浮 3 3、加入、加入100100 L L預(yù)冷的溶液預(yù)冷的溶液I I ，于渦旋振蕩器，于渦旋振蕩器上振蕩懸浮細(xì)菌細(xì)胞，盡量使細(xì)胞分散；上振蕩懸浮細(xì)菌細(xì)胞，盡量使細(xì)胞分散； 溶液溶液I I中的葡萄糖的作用是增大讓一讓的粘度，減少中的葡萄糖的作用是增大讓一讓的粘度，減少提取提取 過程中的機(jī)械剪切力，防止染色體過程中的機(jī)械剪切力，防止染色體DNA DNA 的斷裂；的斷裂；EDTAEDTA的作用是與二價離子（的作用是與二價

22、離子（CaCa2 2）結(jié)合，降低）結(jié)合，降低DNaseDNase對對DNADNA的的降解。降解。 4 4、加入、加入200200 L L新配制的溶液新配制的溶液II, II, 蓋緊管口蓋緊管口, ,快速顛倒離心管快速顛倒離心管, ,以混勻內(nèi)容物以混勻內(nèi)容物, ,冰上放置冰上放置3 35min;5min; 溶液溶液II II中的中的NaOHNaOH與與SDSSDS可裂解細(xì)胞，使可裂解細(xì)胞，使DNADNA變變 性以及性以及SDSSDS使蛋白變性并形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使蛋白變性并形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 5 5、加入、加入150150 l l溶液溶液III, III, 加蓋后顛倒加蓋后顛倒6-76-7次混勻

23、，次混勻，冰上放置冰上放置2 23min3min； 溶液溶液III III為低為低pHpH的醋酸鉀緩沖液，中和的醋酸鉀緩沖液，中和NaOHNaOH，以便使部，以便使部 分變性的閉環(huán)質(zhì)粒復(fù)性，而細(xì)菌染色體分變性的閉環(huán)質(zhì)粒復(fù)性，而細(xì)菌染色體DNADNA不能正確復(fù)性不能正確復(fù)性 6、12000 g12000 g離心離心6 min6 min，將上清移入另一干凈，將上清移入另一干凈的的Ep管中；管中； 7 7、加、加2 2倍上清體積倍上清體積( (約約1mL)1mL)的無水乙醇的無水乙醇, , 振蕩振蕩混勻，室溫放置混勻，室溫放置2min.2min. 8、 12000g離心離心10min，棄上清液，再用

24、，棄上清液，再用70的乙醇洗滌一次，的乙醇洗滌一次， 12000g離心離心1min，離心管，離心管倒置于吸水紙上扣干，然后在中空濃縮系統(tǒng)上干燥質(zhì)倒置于吸水紙上扣干，然后在中空濃縮系統(tǒng)上干燥質(zhì)粒；粒； 9、加入、加入40 L含含20 g/mL RNase A的滅菌的滅菌蒸餾水或蒸餾水或TE 緩沖液溶解提取物，室溫放置直到質(zhì)粒緩沖液溶解提取物，室溫放置直到質(zhì)粒完全溶解完全溶解(約約8min)，存于，存于20或直接用于酶切或直接用于酶切。質(zhì)粒圖譜質(zhì)粒圖譜: : ( (四四) )提取質(zhì)粒的酶切鑒定與瓊脂糖凝膠電泳：提取質(zhì)粒的酶切鑒定與瓊脂糖凝膠電泳： 1、在、在0.5mL Ep管中依次加入下列溶液于管

25、中依次加入下列溶液于0.5ml離心管中離心管中 提取質(zhì)粒提取質(zhì)粒DNA 3.0 L 10 buffer H 1.0 l EcoR I 2.0 U dd H2O 5.8 L 10 L 1U: 11U: 1單位酶通常定義為，在建議緩沖液及溫度下，單位酶通常定義為，在建議緩沖液及溫度下， 在在20 20 L L 反應(yīng)液中反應(yīng)反應(yīng)液中反應(yīng)1h1h，使，使1 1 g DNAg DNA完全消化所需的酶量完全消化所需的酶量. . 2、 輕輕混勻輕輕混勻, 4000g離心離心10秒秒 ，置于，置于37水浴中酶解水浴中酶解1.5h。 3、酶解完成后，加入、酶解完成后，加入1.2 l 10上樣緩沖上樣緩沖液液(或

26、或2 l 6上樣緩沖液上樣緩沖液), 混勻混勻. 4、稱取、稱取1g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100mL 0.5TBE或或1TAE緩沖液，瓶口倒扣一緩沖液，瓶口倒扣一個小燒杯，將該三角瓶置于微波爐加熱直至瓊脂糖個小燒杯，將該三角瓶置于微波爐加熱直至瓊脂糖溶解。溶解。 5、將梳子放置在制膠槽上，在冷卻至、將梳子放置在制膠槽上，在冷卻至60左右的瓊脂糖凝膠液加入一小滴左右的瓊脂糖凝膠液加入一小滴EB，小心混勻小心混勻，倒，倒到制膠槽上，直到在整個有機(jī)玻璃板表面形成均勻到制膠槽上，直到在整個有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層，的膠層，不要產(chǎn)生氣泡（厚度約為不要產(chǎn)生氣泡（厚度約為3

27、4mm）； 6、 室溫下靜置室溫下靜置30min左右，待凝固完全后，左右，待凝固完全后，輕輕拔出梳子輕輕拔出梳子。 7、制好膠后將凝膠連同內(nèi)槽放在含有、制好膠后將凝膠連同內(nèi)槽放在含有0.5TBE或或1TAE緩沖液的電泳槽中使用緩沖液的電泳槽中使用(注意注意: :電泳槽中的緩沖液應(yīng)與配膠用的緩沖液成分、濃度電泳槽中的緩沖液應(yīng)與配膠用的緩沖液成分、濃度一致一致)。 8、用微量加樣器將樣品分別加入膠板的樣品、用微量加樣器將樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)行電泳（孔內(nèi)加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)行電泳（80100V的電壓下電泳，一般情況下，的電壓下電泳，一般情況下，電壓電壓/ /電極

28、間距電極間距離應(yīng)小于離應(yīng)小于5V/cm5V/cm），當(dāng)溴酚蘭移動到距離膠板下沿），當(dāng)溴酚蘭移動到距離膠板下沿約約1cm處停止電泳。處停止電泳。 9、在紫外燈、在紫外燈(310nm波長波長)下觀察染色后的凝膠。下觀察染色后的凝膠。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶存在處顯示出紅色的熒光條帶(在紫外燈下觀察時，應(yīng)在紫外燈下觀察時，應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃防護(hù)面罩，避免眼睛遭受強(qiáng)紫外光戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃防護(hù)面罩，避免眼睛遭受強(qiáng)紫外光損傷損傷，拍照電泳圖譜時，可采用凝膠成象系統(tǒng)，拍照電泳圖譜時，可采用凝膠成象系統(tǒng))。五五. 實驗結(jié)果報告：實驗結(jié)果報告： 1、轉(zhuǎn)化效率的計算 ： 轉(zhuǎn)化子總數(shù)菌落數(shù)（轉(zhuǎn)化

29、反應(yīng)原液總體積/涂板菌液體積） 轉(zhuǎn)化效率（每微克質(zhì)粒每微克質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化子數(shù)的轉(zhuǎn)化子數(shù)） 轉(zhuǎn)化子總數(shù)（個轉(zhuǎn)化子）/加入質(zhì)粒DNA的量（g） 2、質(zhì)粒提取與酶切鑒定結(jié)果，貼上打印實驗照片并標(biāo)明照片上各DNA條帶的含義。六、思考題：六、思考題： 1 1、何謂感受態(tài)細(xì)胞？制備感受態(tài)細(xì)胞的理論、何謂感受態(tài)細(xì)胞？制備感受態(tài)細(xì)胞的理論依據(jù)是什么？依據(jù)是什么？ 2 2、為什么通常使用、為什么通常使用R R- -M M- -菌作為基因工程受體菌？菌作為基因工程受體菌？ 3 3、簡述、簡述CaClCaCl2 2制備細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞及其轉(zhuǎn)化的制備細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞及其轉(zhuǎn)化的基本原理。基本原理。 4 4、根據(jù)、根據(jù)DN

30、ADNA限制酶的識別切割特性，限制酶的識別切割特性， 催化條催化條件及是否具有修飾酶活性可分為幾種類型？其中件及是否具有修飾酶活性可分為幾種類型？其中IIII類類限制性內(nèi)切酶有何特性？限制性內(nèi)切酶有何特性？ 5 5、在用堿裂解法小量制備質(zhì)粒過程中、在用堿裂解法小量制備質(zhì)粒過程中I I液、液、IIII液與液與IIIIII液的作用機(jī)理是什么？液的作用機(jī)理是什么？ 6 6、簡述堿裂解法小量制備質(zhì)粒的原理。、簡述堿裂解法小量制備質(zhì)粒的原理。二二.實驗原理實驗原理 1 1、感受態(tài)細(xì)胞制備: :所謂感受態(tài)是指受體細(xì)胞處于容易吸收外源DNADNA的一種生理狀態(tài)，可以通過物理與化學(xué)方法誘導(dǎo)形成，也可以自然形成

31、，在基因工程技術(shù)中通常采用誘導(dǎo)的方法。用于轉(zhuǎn)化的受體菌細(xì)胞一般是限制- -修飾系統(tǒng)（Restriction-ModificationRestriction-Modification）缺陷的變異株，以防止對導(dǎo)入的外源DNADNA的切割，用符號R R- -M M- -表示。其基本原理是：細(xì)菌處于00的CaClCaCl2 2低滲溶液中，會膨脹成球形，細(xì)胞膜的通透性發(fā)生變化，轉(zhuǎn)化混合物中的質(zhì)粒DNADNA形成抗DNaseDNase的羥基- -鈣磷酸復(fù)合物黏附于細(xì)胞表面，經(jīng) (4) (4)、有不同來源的限制性內(nèi)切酶可以識別相同的序列，甚至切割的位點也相同，稱為同裂酶或異源同工酶，如Hpa IIHpa I

32、I與Msp IMsp I；有的識別位點不同，但對DNADNA切割后可產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶，如BamHBamH I I與BglBgl IIII。四操作步驟四操作步驟: ( (一一) ) 感受態(tài)細(xì)胞的制備：感受態(tài)細(xì)胞的制備： 1 1、從新活化的E.coliE.coli DH5 DH5平板上挑取一單菌落，接種于3 35ml LB5ml LB液體培養(yǎng)中，3737振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期( (12h左右) )； 2 2、將該菌懸液以1:1001:1001:501:50轉(zhuǎn)接于100ml LB100ml LB液體培養(yǎng)基中，3737振蕩擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)液開始出現(xiàn)混濁后，每隔202030min30min測

33、一次ODOD600600，至ODOD600600為0.30.30.50.5時停止培養(yǎng)，并轉(zhuǎn)裝到1.5 mL1.5 mL離心管中； 3 3、培養(yǎng)物于冰上放置20min20min； 4 4、 0 044，4000g4000g離心10min10min，棄去上清液，加入1 mL1 mL冰冷的0.1mo10.1mo1L CaClL CaCl2 2溶液，小心懸浮細(xì)胞, , 冰浴2020分鐘；（二）質(zhì)粒（二）質(zhì)粒DNADNA的轉(zhuǎn)化：的轉(zhuǎn)化： 1 1、每100L100L感受態(tài)細(xì)胞懸液中加入1L1L質(zhì)粒DNA,DNA,輕輕搖勻，同時設(shè)置三組對照：( (1)1)不加質(zhì)粒，(2)不加受體菌， (3)加已知具有轉(zhuǎn)化活性的質(zhì)粒DNA，具體操作按下表進(jìn)行：*陽性對照，用已知具有轉(zhuǎn)化活性的pGEX-PDIP-