基本理論1試驗設計的基本原則藥理研究的目的是通過動物試驗

1、基本理論（一）1實驗設計的基本原則藥理研究的目的是通過動物實驗來認識藥物作用的特點和規(guī)律，為開發(fā)新藥和評價藥物提供科學依據。由于生物個體之間存在著差異性，要取得精確可靠的實驗結論必須進行實驗設計。進行實驗設計必須遵循R.A.Fischer的三原則，即：隨機、對照、重復。1.1 隨機1.2 對照1.3 重復2常用的藥理學實驗分組設計2.1 單純隨機設計2.2 簡化分層隨機法2.3 配對隨機法3藥理學實驗研究中常用劑量換算法1.由藥物劑量mg/kg及藥液百分濃度換算成每kg體重注射藥液量ml,進而計算出每只動物應該注射多少ml。扁肝惴，娘學甫gkg肥布峭液容量ml/kgH妹®叼!版哪蟒物

2、濃度3.百分濃度與摩爾/升濃度之間的換算：初篩|基本理論（二）“一一新藥的發(fā)現、新藥及其腐活牲無活性1 .藥物的定義*2 .新藥內H褊分臨床前藥理制劑部分3 .新藥巾分類T一、丁甘政結'劑型、合量標準、3.1 q箭、然藥物注冊分類穩(wěn)定性、溶出度質沙雅菊必學一般藥理學毒理學菊動學田?3.2 化學藥品注冊分類外生物利用度3.3生物制品注冊分類、新藥研究的一般程序臨床試驗評價三、臨床前藥理學的研究內容1、與治療作用有關的主要藥效學研究2、一般藥理學研究3、藥代動力學研究4、毒理學研究(1)急性毒性試驗(2)長期毒性試驗(3)特殊毒性試驗四、臨床前藥理學研究對動物實驗的要求1 .選才¥

3、;2-3種動物，以排除種屬差異。2 .選擇多種公認可靠的動物模型。3 .以整體實驗為主，配合以體外離體實驗。4 .劑量3-5個，確定量效關系。5 .給藥途徑與臨床一致。6 .設對照組：陰性對照、陽性對照。五、臨床藥理學的研究內容1 I期臨床研究人體對新藥的耐受程度，了解新藥在人體的藥動學過程。2 II期臨床確定藥物的適應證及不良反應，對其安全有效性作初步評價。3 III期臨床在較大范圍內進行西藥療效和安全性評價。4 IV期臨床上市后監(jiān)察。錄像1動物捉拿與給藥方法實驗目的了解各種動物的捉拿與給藥方法。實驗內容一、大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、猴的捉拿和固定。二、大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、

4、猴的性別辨認。三、大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、貓、犬、猴的灌胃、腹腔注射、肌肉注射、皮下注射、靜脈注射方法。錄像2幾類藥物的藥理學研究方法實驗目的了解幾類藥物的藥理學實驗研究方法。實驗內容一、中樞神經系統藥物的實驗研究方法。二、抗帕金森藥物的實驗研究方法。三、糖皮質激素的實驗研究方法。實驗一筒箭毒堿ED50的測定實驗目的了解ED50的測定力法、原理、計算過程與意義實驗對象小鼠(昆明種)、雌雄各半儀器和藥品鐵絲網.鐵架臺、天平、注射器、筒箭毒堿(根據實際需求配制，一般為0.2m1/10g體重)實驗內容采用點斜法進行ED50的測定。1 .預實驗；目的是為了找出符合點斜法要求的Dmax和Dmin。陽性反

5、應判定標準：20min內小鼠落下鐵絲網3次(注意排除因互相擁擠而落下所造成的假陽性)。2 .確定組數(n)后，根據Dmax和Dmin,計算各組應給予的劑量，注意公比r應在1.1-1.6范圍內Dmax=rn-1Dminr工"/力咽舊-11-L6分別計算出各組應注射的劑量，3 .正式實驗：(1)稱重、標記；(2)篩選小鼠：將小鼠放在鐵絲網上，觀察10min,能堅持不掉落的即為合格，可以參與實驗。此步篩選的目的在于排除假陽性。(3)給藥觀察：腹腔注射筒箭毒堿。每組分別給予相應的劑量，(4)計算陽性率：陽性反應標準：給藥店20min如內自鐵絲網上掉落3次者為陽性。4.計算：(1) lgED5

6、0=Xm-i(EP-0.5)其中，Xm=1gDmax1 =1grEP：陽性率之和因此：ED50=1g-1Xm-i(EP0.5)(2) ED50的95%可信區(qū)間=1g-11gED50±1.96Sx50Sx50=iV(Z2PWP2)/(nT),n為各組動物數以陽性率為縱坐標，對數劑量為橫坐標，作圖。思考題1 .點斜法測定ED50時，實驗設計必須符合哪些條件？2 .測定ED50、LD50的意義是什么？3 .小鼠腹腔注射簡箭毒堿的ED50是多少？其95%可信區(qū)間是多少？實驗二磺胺藥的藥代動力學參數測定實驗目的了解磺胺類藥物在動物體內隨時間變化的代謝規(guī)律，掌握藥代動力學參數的計算方法。實驗對象

7、家免儀器和藥品分光光度計，75g/L(7.5%)三氯醋酸，5g/L(0.5%)亞硝酸鈉，5g/L(0.5%)麝香草酚，0.5g/L(0.05%)磺胺喀噬等實驗內容1 .家免稱重麻醉，分離頸總動脈。耳緣靜脈注射肝素抗凝后頸動脈插管，取動脈血備用。2 .取血：先取空白動脈血。然后給家免耳緣靜脈注射磺胺喀呢(0.3g/kg),分別于注射后0min、3min、5min、15min、30min、45min、60min、90min時取動脈血。3 .測定血藥濃度：嚴格按照下表中的順序加藥：根據標準管的藥物濃度及其光密度值，可計算出樣品管內的藥物濃度。公式如下：OD樣/OD標=C樣/C標將所測得的血藥濃度值與

8、時間通過計算機進行曲線擬臺，得到時量曲線，表達公式如下：Ct=Ae-h+Be-Bt在半對數坐標紙上以時間(t)為橫坐標，實測的光密度值換算而得的血藥濃度的對數為縱坐標，繪制時量曲線圖。思考題1 .二室模型的藥物的體內過程有哪些特點？2 .藥物消除動力學分為哪兩類、各自的特點是什么？3 .簡述藥物代謝動力學參數的測定方法。實驗三新斯的明對琥珀酰膽堿和筒箭毒堿肌松作用的影響肌松藥分為去極化型和非去極化型兩種。去極化型肌松藥的代表藥為琥珀酰膽堿，該藥與神經肌肉接頭處突觸后膜上的N2受體結合后，可使突觸后膜持久去極化，受體不能再對乙酰膽堿起反應，從而使骨骸肌松弛、抗膽堿酯酶藥新斯的明不能對抗其肌松作用

9、，反而使其肌松作用加重。非去極化型肌松藥的代表藥為筒箭毒堿，該藥與乙酰膽堿競爭神經肌肉接頭處突觸后膜的N2受體，其肌松作用能被新斯的明解救。實驗目的1 .觀察新斯的明對去極化(琥珀酰膽堿)和非去極化(筒箭毒堿)兩種肌松藥肌松作用的影響2 .學習大鼠排神經一腸的肌標個的制作方法及共在肌松藥研究中的應用。實驗動物大鼠(150200g)儀器和藥品PowerLab一套，0.05g/L(0.005%)氯化筒箭毒堿，0.3g/L(0.03%)氯化琥珀酰膽堿，0.1g/L(0.01%)澳化新斯的明，200g/L(20%)烏拉坦，20g/L(2%)鹽酸普魯卡因，生理鹽水，手術器械一套，棉線，橡皮泥，大頭釘，鐵

10、架臺等。實驗方法1 .安裝并設定Powerlab記錄肌張力的chart文件，調定刺激器有關參數(刺激強度2V左右，刺激間隔990ms,波寬4ms)2 .大鼠體重，麻醉，20%烏拉坦腹腔注射(0.2-1.5g/kg)。數分鐘后翻正反射消失，即可進行實驗。3 .分離坐骨神經4 .分離腓神經5 .分離脛前肌6 .連接儀器：將脛前肌與PowerLab的張力換能器相連接，腓神經處安放刺激電極。7 .給藥(1)：腹腔注射0.005%氯化筒箭毒堿(0.2mg/kg),待收縮振幅被抑制了20%時，立即由舌靜脈勻速注射0.01%演化新斯的明(0.1mg/kg)。8 .給藥(2):肌肉收縮恢復后，腹腔注射0.03

11、%氯化琥珀酰膽堿(1.2-2.4mg/kg),待收縮振幅被抑制了20%時，立即由舌靜脈勻速注射0.01%澳化新斯的明(0.1mg/kg)。9 .對所記錄的脛前肌收縮圖形進行分析，討論分析結果思考題根據作用機制，肌松藥分為哪兩類？它們的區(qū)別是什么？實驗四苯巴比妥鈉和放線菌素D對小鼠肝臟細胞色素P450含量的影響實驗目的學習肝勻漿中肝臟細胞色素P450含量的簡易測定方法，理解肝藥酶的誘導劑、抑制劑的作用。實驗對象小鼠（昆明種）儀器和藥品分光光度計，扭力大平，制冰機，生理鹽水，0.75%苯巴比妥鈉，0.002%放線菌素D（A.D.）,0.25mol/L蔗糖溶液,Tris-HCl緩沖液，玻璃勻漿器，漏

12、斗，試管，濾紙，移液管等。實驗方法1 .動物分為3組：生理鹽水組，苯巴比妥鈉組及放線菌素D組。2 .苯巴比妥鈉和放線菌素D腹腔注射3天以誘導或抑制肝藥酶。3 .斷頭放血：于第3天（實驗當日）將小鼠斷頭放血。4 .制備肝勻漿：將0.25mol/L的蔗糖溶液和0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液置于冰塊中預冷。剪下肝臟（肝組織不得少于400mg;勿破壞膽囊，因膽色素干擾實驗結果；以濾紙吸去血跡，因血紅蛋白干擾實驗結果）。扭力天平稱重（墊錫紙，每次加樣或加減法碼時必須關上天平）,將肝組織置于勻漿器中，加入預冷后的0.25mol/L蔗糖（0.5ml/100mg肝組織）冰浴下研磨，直至組織變?yōu)榈?/p>

13、色勻漿。用雙層紗布過濾勻漿液，取此勻漿液1ml,加入預冷后的0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液9ml,充分混勻。冰浴下充以CO,1-2氣泡/秒，通氣2min。5 .將通氣完畢的溶液傾入2個比色杯中，一個作為參照補，另一個作為樣品杯。向樣品杯中加入連二亞硫酸鈉5mg,充分混勻。參照杯調零后，在450nm和490nm處測定樣品杯的吸光度，按下式計算P450的含量：P450（nmol/g肝臟）=（A450A490）/E-L父50000A=ECLE:P450從490nm到450nm波長的示差光譜消光系數，本實驗中E=l04L/cm-mmolL:比色杯厚度（光路長度）=1cmC:溶液濃度A:吸光

14、度6.計算(1) P450升高百分率：(PhenoN.S.)/N.S.黑100%,其中Pheno代表苯巴比妥鈉。(2) P450降低百分率：(N.S.A.D.)/N.S.x100%。注意事項1 .操作要快(為了保證酶的活性)。2 .冰浴(為了保證酶的活性)。3 .血要放盡(P450為血紅素蛋白，血紅素影響P450)。4 .膽囊破裂后，膽紅素會影響P450的測定。5 .通CO的速度不能過快或過慢。6 .研磨，至肝組織由紅色變成淡粉色勻漿為止。7 .分光光度計上比色時，先測定A.D.,再測定N.S.,最后測定苯巴比妥鈉(P450由低濃度至高濃度)。思考題1 .肝藥酶的臨床意義。2,藥物的耐受與交叉

15、耐受，聯合用藥應注意的問題。3 .P450在藥物轉化中的作用。4 .不同實驗組P450含量不同的原因。5 .誘導劑增加P450含量和抑制劑減少P450含量的意義。實驗五傳出神經系統藥物對血壓和血流動力學的影響實驗目的觀察傳出神經系統藥物對血壓及血流動力學的影響和這些藥物之間的相互作用。掌握麻醉動物血壓的記錄方法及動物的心導管技術。實驗對象家免儀器和藥品多道生理記錄儀，壓力換能器，手術器械，氣管插管，動脈插管，動脈夾，靜脈插管，心導管，注射器，兔臺，絲線，紗布，3%戊巴比妥鈉，0.5%肝素，0.002%腎上腺素，0.003%去甲腎上腺素，0.001%異內腎上腺素，0.5%酚妥拉明，0.1%普奈洛

16、爾，生理鹽水等。實驗方法1 .家兔稱重，耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉（30mg/kg）麻醉（注射不宜過快，否則易致呼吸肌麻痹）。2 .將家兔背位固定于手術臺上，剪去兩側腹股溝處的毛。在股動脈搏動明顯處，沿股動靜脈走向縱行剪開皮膚約3-4cm,分離右側股動脈，穿線備用（觀測血壓用），并分離左側股靜脈.穿線備用（靜脈給藥用）。3 .剪去頸部的毛，正中切開頸部皮膚，分離右側頸總動脈，穿線備用（盡量分離出較長的一段，逆行插管后觀測左心室內壓用）。4 .打開多道生理記錄儀，壓力換能器內預充注肝素（注意排盡氣泡并熟悉三通管的方向）。5 .肝素化：股靜脈插管，0.5%肝素靜注抗凝（1ml/kg）06 .股動脈

17、插管，觀測并記錄血壓（BP）。7 .頸總動脈逆行插管，觀測并記錄左心室內壓（LVP）和左心室內壓變化速率（dLVP/dt）。當導管插入一定長度后（可在插管之前于體外估測導管大概的進入長度），小心操作。進入心室內時，有一種突破感和落空感，同時血壓波形變成室內壓波形（舒張壓更低，收縮壓更高，脈壓增高，波形幅值明顯高于動脈血壓波形的幅值）。注意：逆行插管插得過淺時易被血流沖出心臟，則波形又恢復為動脈血壓波形；插得過深時插管堵在心室壁上則記錄不到波形，甚至刺破心臟。因此在操作時應結合體外估測長度、手感以及血壓波形的變化進行判斷。8 .觀測并記錄一段正常圖形。9 .給藥并進行觀察、記錄：（1）腎上腺素t

18、去甲腎上腺素t異內腎上腺素t酚妥拉明，5min后T再次給予去甲腎上腺素T腎上腺素T異內腎上腺素。（2）腎上腺素T去甲腎上腺素T異內腎上腺素T普奈洛爾（0.5ml/kg）,5min后t異內腎上腺素t腎上腺素t去甲腎上腺素。說明；除普奈洛爾外，其他藥物注射劑量均為0.2ml/kg；每次給藥后可注生理鹽水，將死腔內的藥液注入靜脈；每次給藥后，待BP穩(wěn)定后再給另一種藥物。思考題1 .各藥對血壓、左心室內壓和左心室內壓變化速率的作用，酚妥拉明和普奈洛爾對其他藥物作用的影響。2 .影響心功能的因素有哪些？各種影響心功能的約物作用機制分別是什么？藥理學實驗課考試（操作部分）【題目】用扭體法觀察藥物的鎮(zhèn)痛作用?！灸康摹恐饕疾閷W生對小鼠標記、稱重、捉拿、腹腔注射給藥的操作技能?！驹怼炕瘜W物質刺激腹膜引起持久的痛反應，致使小鼠出現“扭體”反應（即腹部內凹，軀干與后肢伸張，臀部高起）。【動物】小白鼠，2022g,雌雄兼用?！舅?/p>