液相色及其檢測技術(shù)

1、液相色譜及其檢測技術(shù)李俊玲2013年8月1日主要內(nèi)容n液相色譜基本知識n液相色譜常見故障及維護(hù)保養(yǎng)n液相色譜的應(yīng)用n檢測方法前處理技術(shù)n報告及數(shù)據(jù)分析n液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)n1 液相色譜基本知識1.1 液相色譜的發(fā)展 20世紀(jì)初，俄國植物學(xué)家茨維特（Tswett）提出經(jīng)典液相色譜法。n1938年有了薄層色譜。1944年有了紙色譜。n 20世紀(jì)50年代后，氣相色譜迅速發(fā)展，液相色譜發(fā)展緩慢。n 20世紀(jì)60年代末期，隨著微粒固定相的研制成功，及高壓輸液泵和高靈敏度檢測器的出現(xiàn)，高效液相色譜方法在經(jīng)典液相色譜法和氣相色譜法的基礎(chǔ)上建立起來。n 20世紀(jì)70年代，往復(fù)式雙柱塞恒流泵占主導(dǎo)地位，Kirklan

2、d制備出多孔球形硅膠，平均粒徑7m。n 20世紀(jì)80年代，研制出二極管陣列紫外吸收檢測器。n 20世紀(jì)90年代，HPLC高速發(fā)展，聯(lián)用技術(shù)，多維色譜成為活躍的新技術(shù)領(lǐng)域。n 2000年后，亞二微米填料（色譜柱50mm），高分離度快速（超高效）液相色譜提高了分析的速度。n早期的柱色譜玻璃柱填料：硅膠氧化鋁纖維素樣品溶劑重力洗脫1.2高效液相色譜的組成n什么是高效液相色譜(HPLC)n高效液相色譜的定義為：n高壓泵驅(qū)動液體(流動相) 通過裝填有涂層顆粒的柱管(色譜柱)將混合物分離為單一組分的色譜分離技術(shù)。nHPLC的主要組成部分n溶劑輸送系統(tǒng)(泵) 溶劑流動相n進(jìn)樣器(進(jìn)樣閥)n色譜柱固定相n檢測

3、器n數(shù)據(jù)系統(tǒng)nHPLC的特點n.高壓：系統(tǒng)壓力10-40MPa；(1 MPa = 10 bar =147psi)n.高速：分析時間短,僅幾分鐘到幾十分鐘；n.高效：柱效高為5000-30,000塔板數(shù)/mn.高選擇性：適于復(fù)雜、多組分樣品的分離n.高靈敏度：最低檢測線（LOD） UVD 10-9g; FLD 10-12g；RID 10-6g； 液相色譜儀各個模塊 液相色譜儀由輸液系統(tǒng)，進(jìn)樣系統(tǒng)，分離系統(tǒng)，檢測系統(tǒng)和記錄數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)五部分組成。.2.1 輸液系統(tǒng)) 流動相和儲液罐流動相有機溶劑，純水，緩沖鹽溶液等儲液罐玻璃，不銹鋼，塑料容器，0.5L -4L 連接管路塑料管，配有不銹鋼或玻璃過濾

4、器，孔徑為0.45m左右。圖片液相色譜儀各個模塊2） 輸液泵A.對泵的要求 a) 泵要耐腐蝕，一般采用不銹鋼材料制成，b) 在高壓下能連續(xù)工作，壓力一般為40-50MPa, 24h工作，c）輸出流量范圍寬，填充柱：0.1-10（mL/min） 微孔柱：0.01-10(mL/min） d) 流量穩(wěn)定，流量的控制精度應(yīng)小于。液相色譜儀各個模塊 B.常用泵 氣動放大泵、往復(fù)泵、螺旋注射泵、隔膜泵等幾種，由于氣動放大泵和螺旋注射泵存在流量調(diào)節(jié)不便、溶劑更換困難、不利于進(jìn)行梯度洗脫等缺點,應(yīng)用越來越少。往復(fù)式柱塞泵的應(yīng)用更為普遍 。a) 恒流泵 如往復(fù)泵（）注射型通過控制電機轉(zhuǎn)數(shù)來改變柱塞移動速度,操作

5、方便,缺點是液缸容積小,不利于連續(xù)工作。 (）往復(fù)型有并聯(lián)和串聯(lián)兩種,如安捷倫1100、1200的泵就是雙柱塞、往復(fù)式串聯(lián)泵。 b) 恒壓泵如氣動放大泵 是輸出壓力不變的泵，系統(tǒng)阻力不變時可保持恒定流量，否則流量改變。液相色譜儀各個模塊3）梯度洗脫裝置梯度洗脫是在洗脫過程中，連續(xù)或間斷的改變流動相中含有的兩種或兩種以上不同極性溶劑的比例，即調(diào)節(jié)流動相的極性，使樣品中的組分可在最短的時間內(nèi)達(dá)到滿意的分離。實現(xiàn)梯度洗脫，需要二元或多元泵，梯度控制裝置及軟件。na 低壓梯度（也叫外梯度）：在常壓下，預(yù)先按一定程序?qū)煞N或多種不同極性的溶劑混合后，再用一臺高壓泵輸入色譜柱。nb 高壓梯度 （或稱內(nèi)梯度

6、系統(tǒng) ）：利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按設(shè)定的比例送入梯度混合室，混合后，進(jìn)入色譜柱。n氣動放大泵（恒壓） 往復(fù)式柱塞泵（恒流）液相色譜儀各個模塊1.2.進(jìn)樣系統(tǒng)定量地將試樣注入色譜系統(tǒng)的裝置。1) 六通閥進(jìn)樣器耐高壓，死體積小，不銹鋼材料制成，定量管體積5-10L。 2) 自動進(jìn)樣器由計算機控制，按預(yù)先編制的進(jìn)樣程序進(jìn)行，進(jìn)樣量連續(xù)可調(diào)，重復(fù)性好。液相色譜儀各個模塊1.2.分離系統(tǒng)包括色譜柱和柱箱及控溫部分）色譜柱內(nèi)壁拋光的直型柱管，內(nèi)裝固定相，標(biāo)準(zhǔn)柱長一般為10-50cm，內(nèi)徑4.6mm，微孔柱內(nèi)徑0.5-1.0 mm。液相色譜儀各個模塊）柱箱及控溫部分要求控制柱溫的情況：a.

7、 標(biāo)準(zhǔn)分析中，要求保留時間再現(xiàn)；b. 通過改變柱溫提高分離效率；c. 分析高分子化合物或大黏度樣品：d. 有生物活性的樣品柱溫要低于室溫；e. 復(fù)雜樣品采用二維色譜技術(shù)，需在不同溫度下操作。柱箱控溫范圍：低于室溫10-80，對凝膠滲透色譜，柱溫從室溫到150。液相色譜儀各個模塊 1.2. 檢測系統(tǒng)檢測器是液相色譜三大關(guān)鍵部件之一，用于監(jiān)測色譜柱分離后組分濃度的變化，由記錄儀繪出色譜圖來進(jìn)行定性定量分析。 理想的檢測器應(yīng)具有以下特征：a. 靈敏度高，b.對所有溶質(zhì)都有快速響應(yīng)，c.線性范圍寬，d.適用范圍廣等。 常用的檢測器有: 紫外吸收檢測器,熒光檢測器,示差折光檢測器,電導(dǎo)檢測器等。液相色譜

8、儀各個模塊1)紫外吸收檢測器 A)固定波長 由光源(低壓汞燈),濾光片，流通池,光電池接收器等組成.波長為254nm, 280nm,流通池體積為5-10L,光路為 5-10mm。光電池接收信號經(jīng)放大輸出。 B) 可變波長 一般采用氘燈和鎢燈作光源，波長在190-700nm范 圍內(nèi),由光柵將光分為單色光，由光電二極管接收某一特定波長的信號。液相色譜儀各個模塊1)紫外吸收檢測器C）光二極管陣列檢測器是一種新型的紫外吸收檢測器，進(jìn)入流通池的不是單色光，獲得的信號是全部紫外光波長的色譜信號，因此不僅可以進(jìn)行定量檢測，還可以提供組分的光譜定性信息。采用鎢燈和氘燈做光源，光照射到流通池上，透過光經(jīng)光柵色散

9、后，投射到由1024個二極管組成的陣列上被檢測。全部檢測過程由計算機控制，不僅可以繪制隨時間的變化進(jìn)入檢測器的液流的光譜吸收曲線吸光度隨波長的變化曲線，可以畫出三維立體譜圖。液相色譜儀各個模塊）熒光檢測器 利用某溶質(zhì)在受紫外光激發(fā)后可發(fā)射熒光的性質(zhì)進(jìn)行檢測的是一種高靈敏度選擇性檢測器。 激發(fā)光源常用氙燈，可發(fā)出250-600nm連續(xù)波長的強光，經(jīng)透鏡單色器分出有一定波長的激發(fā)光，照射在流通池上，溶質(zhì)受激發(fā)后產(chǎn)生的熒光，經(jīng)聚光和單色器，選擇出需要檢測波長的光，聚焦在光電倍增管上，將光轉(zhuǎn)變成電信號，經(jīng)放大輸出到微處理機。液相色譜儀各個模塊）示差折光檢測器是通過連續(xù)監(jiān)測參比池和測量池中溶液的折光率之

10、差來測量試樣的濃度的，是一種通用型檢測器。由于它對流動相的任何變化都有響應(yīng)，因此不能用于梯度洗脫。另外受溫度影響波動大，靈敏度低，使用時有一定限制。液相色譜儀各個模塊）電導(dǎo)檢測器是一種選擇性檢測器，通過測量流動樣品的電導(dǎo)或電阻進(jìn)行檢測，主要用于檢測以水溶液為流動相的離子型溶質(zhì)，在離子色譜中應(yīng)用廣泛。有代表性的電導(dǎo)檢測器是雙電極微型檢測器和五電極電導(dǎo)檢測器。液相色譜儀各個模塊 1.2.5 色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 1) 記錄儀, 繪制色譜圖。 2) 微處理機，與色譜儀連接構(gòu)成一個比較完整的色譜分析系統(tǒng)。它包括一定容量的程序存儲器，方法存儲器，數(shù)據(jù)存儲和譜圖記錄和顯示器等，通過鍵功能給出操作參數(shù)指令。 3

11、) 色譜工作站，全部操作參數(shù)的控制，多臺儀器控制，網(wǎng)絡(luò)運行功能等。1.3 液相色譜的分離模式nHPLC的分離模式，主要有四種n反相色譜n正相和吸附色譜n離子交換色譜n尺寸排阻色譜n1.3.1 反相色譜柱填料是非極性的(如，C18, C8, C3, 苯基，等.) 流動相是水（緩沖液）+可與水混溶的有機溶劑(如，甲醇、乙腈）n反相色譜（反相色譜（ RPLC 或或RPC ）是最常用的模式）是最常用的模式 n90%以上的色譜工作者都用這種模式，或者說大多數(shù)液相色譜的檢測，以上的色譜工作者都用這種模式，或者說大多數(shù)液相色譜的檢測，都是這種模式。都是這種模式。n這種技術(shù)可用于分離非極性、極性、可離子化的這

12、種技術(shù)可用于分離非極性、極性、可離子化的n和離子型分子和離子型分子 n.RPC 的適用性非常廣泛的適用性非常廣泛n對于包含各種化合物的樣品來說，經(jīng)常要采用梯度洗脫n.開始時流動相以水為主，然后隨著時間延長逐漸加入有機溶劑。有機溶劑增加了溶劑強度，洗脫在RPC填料上保留很強的化合物。n1.3.2 正相色譜n在這一模式中，柱填料是極性的（如，硅膠、氰丙基n鍵合、氨基鍵合等），而流動相是非極性的（如己n烷、異辛烷、二氯甲烷、醋酸乙酯）n進(jìn)行正相分離的實驗不到10%n這項技術(shù)有以下應(yīng)用：n.水敏性化合物n.幾何異構(gòu)體n.順-反異構(gòu)體1.3.3 離子交換色譜n離子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)，離

13、子交換色譜中的固定相是一些帶電荷的基團(tuán)， 這些帶這些帶電基團(tuán)通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。電基團(tuán)通過靜電相互作用與帶相反電荷的離子結(jié)合。n如果流動相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質(zhì)量作用如果流動相中存在其他帶相反電荷的離子，按照質(zhì)量作用定律，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。定律，這些離子將與結(jié)合在固定相上的反離子進(jìn)行交換。n固定相基團(tuán)帶正電荷的時候，其可交換離子為陰離子，這固定相基團(tuán)帶正電荷的時候，其可交換離子為陰離子，這種離子交換劑為陰離子交換劑；種離子交換劑為陰離子交換劑；n固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電荷，可用來與流動相交換的離子固定相的帶電基團(tuán)帶負(fù)電荷，可用來與流動相交

14、換的離子就是陽離子，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。就是陽離子，這種離子交換劑叫做陽離子交換劑。n陰離子交換柱的功能團(tuán)主要是陰離子交換柱的功能團(tuán)主要是NH2，及，及NH3 ：n陽離子交換劑的功能團(tuán)主要是陽離子交換劑的功能團(tuán)主要是SO3H及及COOH。n其中其中-NH3 離子交換柱及離子交換柱及-SO3H離子交換劑屬于強離子交換劑，它們離子交換劑屬于強離子交換劑，它們在很廣泛的在很廣泛的pH范圍內(nèi)都有離子交換能力；范圍內(nèi)都有離子交換能力；n-NH2及及-COOH 離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的離子交換柱屬于弱離子交換劑，只有在一定的pH值值范圍內(nèi)，才能有離子交換能力。范圍內(nèi)，才能有離子

15、交換能力。n離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動分析離子交換色譜主要用于可電離化合物的分離，例如，氨基酸自動分析儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿儀中的色譜柱，多肽的分離、蛋白質(zhì)的分離，核苷酸、核苷和各種堿基的分離等?；姆蛛x等。 1.3.4 尺寸排阻色譜n空間排阻色譜法又名尺寸排阻色譜法空間排阻色譜法又名尺寸排阻色譜法(size exclusion chromatography，SEC)，是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。，是按分子大小順序進(jìn)行分離的一種色譜方法。n被廣泛應(yīng)用于大分子分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。被廣泛應(yīng)用于

16、大分子分級，即用來分析大分子物質(zhì)相對分子質(zhì)量的分布。n其固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)其固定相為化學(xué)惰性多孔物質(zhì)凝膠，凝膠，n凝膠具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較凝膠具有一定大小的孔穴，體積大的分子不能滲透到孔穴中去而被排阻，較早的淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗早的淋洗出來；中等體積的分子部分滲透；小分子可完全滲透入內(nèi)，最后洗出色譜柱。出色譜柱。n這樣，樣品分子基本按其分子大小先后排阻，從柱中流出。這樣，樣品分子基本按其分子大小先后排阻，從柱中流出。n2 液相色譜儀的日常維護(hù)與常見故障排除 2.1 液相色譜儀的日常維護(hù)2.1.1 儲液器

17、流動相使用HPLC級試劑/溶劑； 含緩沖鹽的流動相過0.45m膜除去微粒物質(zhì);更換流動相時,應(yīng)徹底清洗，防止交叉污染； 定期清潔儲液器及過濾白頭，防止滋生微生物。 2.1.2輸液泵 密封墊易損壞引起故障，每天實驗結(jié)束一定要認(rèn)真沖洗泵,注意防止堵塞,使用緩沖鹽流動相時,更要小心?？梢耘鋫浔玫脑诰€清洗裝置。 使用HPLC級試劑,注意泵壓力不要太高,要適當(dāng)調(diào)整壓力,一般壓力上限在10-20MPa，下限為0.5MPa，注意防止因泵堵塞造成壓力過高損壞柱塞桿或燒壞電機 。 2.1.3 進(jìn)樣器 停機前一定沖洗干凈進(jìn)樣器內(nèi)殘留的樣品或緩沖鹽，防止樣品和無機鹽沉積造成進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)子面磨損或堵塞。 注射器最好使用儀

18、器自配尖頭、平頭針，不要用其它儀器的。 2.1.4 色譜柱防止柱性能下降 1 溶劑的化學(xué)腐蝕性不能太強； 2 避免顆粒物在柱頭沉降； 3 柱壓不能太高，防止沖擊太大； 4 流動相pH值小于7時，最好用大粒度同種填料的予 柱； 5 柱頭加濾片（燒結(jié)不銹鋼), 需要時加保護(hù)柱； 6 經(jīng)常清洗柱； 7 長時間不用時要保存好,一定要洗去緩沖鹽,加入有機溶劑（如乙腈、甲醇均可），將柱兩端擰緊,保持柱填料濕潤。 2.1.5 檢測器 1.保持清潔，每天用后與色譜柱一起清洗； 2.使用脫過氣的流動相，防止氣泡滯留池內(nèi)； 3.檢測器燈有一定壽命，不用時不開燈。 2.1.6 記錄器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄儀: 熱敏式打印

19、頭要注意記錄紙的質(zhì)量,開機前注意檢查走紙部件,不要卡紙。色譜工作站: 防止網(wǎng)上病毒損壞軟件。不用移動硬盤或是U盤等拷貝工作站上的數(shù)據(jù)，如果必須拷貝，也只用儀器專用的。 2.2 常見故障的排除n2.2.1 儲液器n1）脫氣不充分(噪聲大，出毛刺) 用He脫氣 真空脫氣 超聲脫氣 加熱回餾脫氣(混合流動相不宜) n2）流動相供給不暢，泵壓力不穩(wěn) 流動相接近用完，可能吸入部分氣體； 過濾器（過濾白頭）堵塞（有顆粒，長霉）； 可能是流速過高,阻力大,造成走空現(xiàn)象。 解決辦法： 更換流動相，清洗過濾器，降低流速，加大管路內(nèi)徑;抬高儲液器。 n3）儲液器或流動相被污染 產(chǎn)生有規(guī)則的噪聲； 基線上升，梯度洗

20、脫出鬼峰； 原因: 溶劑質(zhì)量差（含雜質(zhì)多）； 配流動相的玻璃器皿不干凈,微生物影響； 配制流動相的操作不當(dāng)（過濾、脫氣、攪拌)2.2.2 輸液泵n1）單向閥a.球和閥座粘在一起，堵死，打不出溶劑，(緩沖鹽流動相) 用高質(zhì)量的溶劑沖洗，不同極性溶劑沖洗,如水、甲醇、異丙醇、二氯甲烷，更換新單向閥。b. 球和閥座密封不嚴(yán)，壓力不穩(wěn)，氣泡進(jìn)入閥中，緊貼在閥體內(nèi)，使球難以返回閥座，引起倒流，壓力和流速變化大，可能有小晶體顆粒。 清除氣泡的辦法：打開排液閥，大流量沖洗，用脫過氣的甲醇沖洗，一般可解決問題。 n2）泵墊圈磨損或破碎：高壓下壓力不穩(wěn)，從泵頭往外滲漏流動相，色譜峰的保留時間會改變。 解決辦法：

21、更換新墊圈。更換方法按維修說明書上的方法一步步操作?；蚴钦埞こ處熒祥T，尤其是頭一次維修。注意： 輸液泵的墊圈要和流動相匹配協(xié)調(diào)。多數(shù)墊圈和流動相是協(xié)調(diào)的,但有的墊圈適用于甲醇、水、乙腈，在四氫呋喃中溶解、變粘、變軟。 需換墊圈時,應(yīng)向廠商咨詢墊圈的規(guī)格型號。 色譜工作者一般應(yīng)學(xué)會換密封墊圈。 n3）柱塞桿故障 磨損、漏液 使用不當(dāng)被折斷 柱塞桿被卡住，不能運動。n更換新柱塞桿 請維修工程師幫助解決，或參照專門的操作手冊自己動手更換。2.2.3 進(jìn)樣系統(tǒng)n1） 滲漏 轉(zhuǎn)子密封墊圈松緊不合適； 墊圈不配套； 組裝不對。2） 堵塞, 樣品打不進(jìn)去。 樣品管堵塞：環(huán)管用反沖法或超 聲清洗排除（或換新管

22、). 手動進(jìn)樣系統(tǒng)器3） 注樣孔 a) 裝樣時針頭周圍滲漏：孔道堵塞，或者放空管和樣品管太細(xì)，阻力太大；針頭密封管規(guī)格不對，針頭太細(xì)。 b)樣品滯留n閥在進(jìn)樣位置停留時間不夠。n要求停留時間至少應(yīng)讓流動相流過的體積是環(huán)體積的10-20倍。 (一般是在下一針進(jìn)樣前才將閥扳到裝樣位置)2.2.3進(jìn)樣系統(tǒng)a. 樣品瓶不配套 瓶小針彎、折斷 瓶大樣品少，抽不上樣 瓶破碎 更換合適的樣品瓶。b. 注意樣品瓶隔墊，防止污染。c. 進(jìn)樣器針頭堵塞（樣品、緩沖鹽、隔墊碎片、針頭本身)， 可用溶劑清洗，金屬絲疏通，或換新針頭。 自動進(jìn)樣系統(tǒng)2.2.3進(jìn)樣系統(tǒng)d. 樣品滯留：空白溶劑出色譜峰. 加倍清洗，或調(diào)整樣

23、品瓶順序，（從低濃度開始，高濃度放后 面）或在樣品瓶前放清洗液瓶. 自動進(jìn)樣系統(tǒng)2.2.4 色譜柱n色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟n正確選擇色譜柱是液相成功分析的關(guān)鍵正確選擇色譜柱是液相成功分析的關(guān)鍵1)塔板數(shù)下降 a. 樣品處理不合適，選擇適當(dāng)?shù)臉悠穬艋椒?，選擇合適流動相。 b. 柱頭塌陷，填裝修補，最好專業(yè)人士來做。 2)峰形變壞 出現(xiàn)拖尾峰，分叉峰，非高斯峰。 與塔板數(shù)下降有關(guān)，峰形壞保留時間不變， 可能是柱堵塞(不銹鋼燒結(jié)片)，或柱頭有空穴。n不同分離模式的色譜柱n反相色譜柱：C18，C8，C3，苯基，氰基等n正相色譜柱：硅膠，氨基，氰基，二醇基等n離子交換柱：有強陰，

24、強陽，弱陰，弱陽之分n體積排阻柱：凝膠滲透色譜柱與凝膠過濾色譜柱n手性柱：用于手性化合物拆分n親和色譜柱：依據(jù)溶質(zhì)與填料上配基之間的分子識別特性n而實現(xiàn)分離2.2.4 色譜柱 3)柱壓突然增大 樣品沉積在柱內(nèi),用能溶解樣品的溶劑沖洗（斷開柱和檢測器）可正向沖，反向沖。 柱內(nèi)硬件有問題： 濾片堵塞，換新片; 塌陷：用相同填料填充、修補。2.2.4色譜柱 4)保留時間改變 不同柱保留時間的變化,主要是填料差異造成的,不同牌號柱出峰順序不變，保留時間有小的變化。 若峰順序變化，保留時間變化較大，應(yīng)考慮換柱或優(yōu)化分離條件。 對專門的分析最好用同一批號的柱子。由色譜柱引起的故障故故 障障現(xiàn)現(xiàn) 象象解決辦

25、法解決辦法過濾片堵塞過濾片堵塞 壓力增高、壓力增高、N下下 降、峰形差降、峰形差倒柱沖洗或換過濾倒柱沖洗或換過濾片片柱頭塌陷柱頭塌陷峰分叉、峰分叉、N下降下降修補柱頭修補柱頭健合相流失健合相流失保留值改變、峰形保留值改變、峰形差、差、N下降下降換柱換柱樣品堵塞樣品堵塞壓力高壓力高用能溶解樣品的溶用能溶解樣品的溶劑沖洗劑沖洗強吸收樣品強吸收樣品 N下降、保留值小下降、保留值小強溶劑反沖強溶劑反沖理論塔板數(shù)n理論塔板數(shù)（理論塔板數(shù)（theoretical plate number,N）用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱）用于定量表示色譜柱的分離效率（簡稱柱效）。效）。nN取決于固定相的種類、性質(zhì)

26、（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種取決于固定相的種類、性質(zhì)（粒度、粒徑分布等）、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對稱并符合正態(tài)分布，類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。如果峰形對稱并符合正態(tài)分布，N可近似表示可近似表示為：為：N=（tR/）2=16(tR)2/W =5.54(tR/W1/2)2W：峰寬：峰寬 ； ：曲線拐點處峰寬的一半，即峰高：曲線拐點處峰寬的一半，即峰高0.607處峰寬的一半。處峰寬的一半。N為常量時，為常量時，W隨隨tR成正比例變化。成正比例變化。n在一張多組分色譜圖上，如果各組份含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，在

27、一張多組分色譜圖上，如果各組份含量相當(dāng)，則后洗脫的峰比前面的峰要逐漸加寬，峰高則逐漸降低。峰高則逐漸降低。n用半峰寬計算理論塔板數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更容易準(zhǔn)確測定，用半峰寬計算理論塔板數(shù)比用峰寬計算更為方便和常用，因為半峰寬更容易準(zhǔn)確測定，尤其是對稍有拖尾的峰。尤其是對稍有拖尾的峰。nN與柱長成正比，柱越長，與柱長成正比，柱越長，N越大。用越大。用N表示柱效時應(yīng)注明柱長，如果未注明，則表表示柱效時應(yīng)注明柱長，如果未注明，則表示柱長為示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。（一般米時的理論塔板數(shù)。（一般HPLC柱的柱的N在在1000以上。）以上。）2.2.5 檢測器 1）紫外）紫外可見光

28、檢測器可見光檢測器 a.燈故障:基線噪聲大,靈敏度低, 氘燈壽命:1000-3000h 鎢燈壽命:2000h 一般至少使用6個月以上，可能接近壽命期限。 b. 流通池 基線有波動，或是基線變高、噪音明顯n 流通池內(nèi)有氣泡：用脫氣甲醇，不同流量沖洗。n 池堵塞（入口、出口、池內(nèi)）： 用可溶堵塞物的溶劑沖洗 （緩沖鹽用 水沖洗）n 池污染：異丙醇、二氯甲烷、 6mol/L HNO3沖洗. 2.2.5檢測器C 非線性響應(yīng) 超出線性范圍:樣品量太大; 檢測器的衰減超出了其線性動力學(xué)范圍; 流動相的紫外吸收比較強. 2.2.5檢測器2)溫度影響 環(huán)境溫度變化引起基線漂移。 流動相溫度變化引起折射率改變，

29、紫外光傳導(dǎo)變化。 柱溫變化引起基線漂移。 2.2.5檢測器n3)信號線故障n記錄儀和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)信號線插接不緊,接觸不良，信號很弱，出現(xiàn)不需要的噪音,此時按說明書檢查線路連接。n地線對儀器很重要, 儀器外殼和信號線的接地很嚴(yán)格，接地不良會出現(xiàn)較大的基線噪聲，接錯線會造成短路，燒毀儀器。2.2.5檢測器n4)波長問題n正確選擇波長:既照顧到靈敏度,又考慮到穩(wěn)定性。n HPLC中，波長選擇是依據(jù)待測物質(zhì)最大吸收波長來決定中，波長選擇是依據(jù)待測物質(zhì)最大吸收波長來決定的。的。n通常，高效液相色譜檢測器為紫外檢測器，所以通常，高效液相色譜檢測器為紫外檢測器，所以HPLC中波中波長的選擇和紫外波長選擇一致

30、，均為選擇最大吸收波長，這長的選擇和紫外波長選擇一致，均為選擇最大吸收波長，這樣能保證檢測的靈敏度和響應(yīng)值最高。樣能保證檢測的靈敏度和響應(yīng)值最高。 3 與液相色譜儀配套使用的設(shè)備3.1 設(shè)備所在儀器室的輔助設(shè)施設(shè)備所在儀器室的輔助設(shè)施3.2 與液相色譜配套的前處理設(shè)備與液相色譜配套的前處理設(shè)備 3.1 設(shè)備所在儀器室的輔助設(shè)施n空調(diào)：控制溫度n排氣罩：排除有機溶液n溫濕度計：適時記錄溫度、濕度n避光的窗簾：避光n雙層窗戶：防塵n大功率的電源線：10A、16A、20A。臺面的承重、距離墻面有50-70cm的距離、儀器臺面的寬度：邊臺一般80cm、中央臺150cm3.2 與液相色譜配套的前處理設(shè)備

31、 （提取 ）（凈化） 濃縮n水浴鍋n分液漏斗振蕩器n恒溫水浴振蕩器n振蕩器n超聲波振蕩器n渦旋混合器n固相萃取儀n真空泵（無油隔膜泵）n溶劑過濾裝置n旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀n氮吹儀n平行蒸發(fā)儀n離心機（配置不同的轉(zhuǎn)子或適配器）n各種規(guī)格的移液器n瓶口分配器n冷卻循環(huán)水裝置3.3 應(yīng)急設(shè)施n延時電源：應(yīng)對突發(fā)事件，如突然停電nEPS應(yīng)急電源:提供一種符合用戶要求的具有獨立回路的應(yīng)急供電系統(tǒng)，該系統(tǒng)能夠在應(yīng)急狀態(tài)下提供緊急供電，用來解決只有一路市電、缺少第二路電源，或代替發(fā)電機組構(gòu)成第二電源。n規(guī)格范圍： 3KW800KWn安裝形式：落地式（標(biāo)準(zhǔn)配電柜）n靜態(tài)、無噪音、無排煙、無公害、無火災(zāi)隱患；自動切換?？?/p>

32、實現(xiàn)無人值守；節(jié)能，非應(yīng)急供電時，基本不耗電；性能穩(wěn)定，安全可靠，使用壽命長；與發(fā)電機組相比縮合造價低，性能價格比好。 3.4 液相色譜實驗室的管理n日常管理：包括衛(wèi)生、開關(guān)門窗、水、電、氣、空調(diào)、溫濕度記錄等等。n設(shè)備的使用記錄：使用前后儀器的狀態(tài)是否正常、檢測樣品名稱或編號、檢測參數(shù)、檢測人、溫濕度等；維護(hù)保養(yǎng)也要記錄、維修也要記錄。nH:檢驗室管理檢查表.doc儀器室管理內(nèi)容n1、管理人員上午上班查看整理內(nèi)容、管理人員上午上班查看整理內(nèi)容n地面：整潔；物品按規(guī)定區(qū)域存放；地面：整潔；物品按規(guī)定區(qū)域存放；n操作臺面：臺面干凈、物品擺放整齊；操作臺面：臺面干凈、物品擺放整齊；n試劑架：干凈、

33、試劑擺放整齊；試劑架：干凈、試劑擺放整齊；n櫥子內(nèi)外：物品整齊、內(nèi)外干凈；櫥子內(nèi)外：物品整齊、內(nèi)外干凈；n抽屜內(nèi)外：抽屜內(nèi)物品整齊，抽屜邊框干凈；抽屜內(nèi)外：抽屜內(nèi)物品整齊，抽屜邊框干凈；n通風(fēng)櫥：邊框玻璃干凈，臺面整潔，物品擺通風(fēng)櫥：邊框玻璃干凈，臺面整潔，物品擺放整齊；放整齊；n空調(diào)：干凈整潔；空調(diào)：干凈整潔；n試劑：過期試劑及時清理，試劑瓶干凈，標(biāo)試劑：過期試劑及時清理，試劑瓶干凈，標(biāo)簽粘貼一致規(guī)范；簽粘貼一致規(guī)范；n窗臺窗框：擦拭干凈；窗臺窗框：擦拭干凈；n門：門里、門外、門框清潔干凈；門：門里、門外、門框清潔干凈；n儀器：表面整潔、按區(qū)域存放；儀器：表面整潔、按區(qū)域存放；n儀器使用記錄

34、：固定區(qū)域存放，檢查有無漏儀器使用記錄：固定區(qū)域存放，檢查有無漏簽，干凈整齊；簽，干凈整齊；n溫度濕度：早溫度濕度：早8：309：00記錄室內(nèi)溫度和記錄室內(nèi)溫度和濕度，及時補充溫濕度計所需的水；濕度，及時補充溫濕度計所需的水；n其他：滅火器、線路等保持清潔、順暢。其他：滅火器、線路等保持清潔、順暢。n2、管理人員在下午下班時逐項檢查并、管理人員在下午下班時逐項檢查并記錄的項目：記錄的項目：n水：檢查回流水、水管是否關(guān)閉、滴漏；水：檢查回流水、水管是否關(guān)閉、滴漏；n電：檢查照明、儀器等的電源是否關(guān)閉，如電：檢查照明、儀器等的電源是否關(guān)閉，如有儀器正在使用要注明；有儀器正在使用要注明；n氣：檢查鋼

35、瓶、氣路是否關(guān)閉，如有儀器正氣：檢查鋼瓶、氣路是否關(guān)閉，如有儀器正在使用要注明；在使用要注明；n窗：應(yīng)關(guān)閉，如有必要開窗，注明原因；窗：應(yīng)關(guān)閉，如有必要開窗，注明原因；n門：關(guān)閉。門：關(guān)閉。n3、填表方式：、填表方式：n符合要求的打符合要求的打“”；n不符合要求的打不符合要求的打“”；n“水、電、氣、窗水、電、氣、窗”等正在使用或需要打開等正在使用或需要打開的注明原因，或填上在用設(shè)備編號。的注明原因，或填上在用設(shè)備編號。 n溫度濕度：早溫度濕度：早8：309：00記錄室內(nèi)溫度和記錄室內(nèi)溫度和濕度，及時補充溫濕度計所需的水；濕度，及時補充溫濕度計所需的水；nH:檢驗室管理檢查表.doc3.5 液

36、相色譜儀的管理n專人管理、有限人員的使用n定期檢定n定期維護(hù)n定期核查n新上崗人員一定培訓(xùn)后經(jīng)考核合格才能上崗n對新上崗人員做好監(jiān)督3.5 液相色譜儀的管理n起草操作規(guī)程：開機前準(zhǔn)備工作，如何開機，各個模塊如起草操作規(guī)程：開機前準(zhǔn)備工作，如何開機，各個模塊如何操作，如何編輯檢測方法、如何檢測樣品、圖譜如何讓何操作，如何編輯檢測方法、如何檢測樣品、圖譜如何讓處理、如何讓關(guān)機、關(guān)機后的清理工作等等。處理、如何讓關(guān)機、關(guān)機后的清理工作等等。n起草維護(hù)保養(yǎng)規(guī)程：多長時間、對什么部件、如何保養(yǎng)。起草維護(hù)保養(yǎng)規(guī)程：多長時間、對什么部件、如何保養(yǎng)。n核查規(guī)程：核查方法？核查結(jié)果分析判定。核查規(guī)程：核查方法？

37、核查結(jié)果分析判定。n4 液相色譜在檢測工作中的應(yīng)用液相色譜在檢測工作中的應(yīng)用食品分析主要內(nèi)容n食品添加劑食品添加劑n殘留殘留n天然化合物天然化合物n酸類化合物酸類化合物n抗生素抗生素n氨基酸氨基酸n抗氧化劑抗氧化劑n霉菌毒素霉菌毒素n糖糖n防腐劑防腐劑n農(nóng)藥農(nóng)藥n酯類酯類n人工甜味劑人工甜味劑n環(huán)境污染物環(huán)境污染物n維生素維生素n著色劑著色劑n無機離子無機離子n香料化合物香料化合物舉例1-農(nóng)獸藥殘留檢測n雞肉中雞肉中十種十種磺胺類藥物殘留的高效液相色譜紫外檢測（磺胺類藥物殘留的高效液相色譜紫外檢測（HPLC-UV）分析方法。分析方法。n采用采用C18柱，甲醇柱，甲醇水水/甲醇甲醇甲酸為流動相梯

38、度洗脫，雞肉樣品經(jīng)過甲酸為流動相梯度洗脫，雞肉樣品經(jīng)過甲醇提取，正己烷脫脂，甲醇提取，正己烷脫脂，SLW固相萃取柱凈化，用固相萃取柱凈化，用HPLC法測定雞肉法測定雞肉中十種磺胺類藥物的含量。中十種磺胺類藥物的含量。n結(jié)果表明，當(dāng)雞肉樣品添加十種磺胺類藥物為結(jié)果表明，當(dāng)雞肉樣品添加十種磺胺類藥物為0.050.2 mg/kg時，時，方法回收率為方法回收率為67.4%95.6%，變異系數(shù)為，變異系數(shù)為4.8%11.5%，n十種磺胺類藥物最低檢出濃度為十種磺胺類藥物最低檢出濃度為0.01 mg/g。食品添加劑檢測 n采用采用ODSC18柱，甲醇柱，甲醇乙酸銨作為流動相，針對不同類型樣品，采乙酸銨作為

39、流動相，針對不同類型樣品，采用不同前處理方法，樣品處理液最后于液相色譜儀進(jìn)行分析定量。用不同前處理方法，樣品處理液最后于液相色譜儀進(jìn)行分析定量。n結(jié)果結(jié)果:乙?；前匪徕洝⒈郊姿?、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、阿斯巴乙?；前匪徕?、苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、脫氫乙酸、阿斯巴甜甜在在00.32 mg/ml濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，RSD為為0.67%6.8%；n乙酰磺胺酸鉀加標(biāo)回收率為乙?；前匪徕浖訕?biāo)回收率為93.1%99.6%、苯甲酸為、苯甲酸為90.5%98.7%、山梨酸為、山梨酸為91.5%102.5%、糖精鈉為、糖精鈉為91.8%100.9%、脫、脫氫乙酸

40、為氫乙酸為92.3%99.8%、阿斯巴甜為、阿斯巴甜為90.3%103.5%。霉菌毒素檢測n采用高效液相色譜法，使用采用高效液相色譜法，使用Agilent1100色譜柱；在柱溫色譜柱；在柱溫30；乙；乙腈腈甲醇甲醇水（水（1 1 2）為流動相；流速為）為流動相；流速為1.0ml/min；熒光檢測；熒光檢測器；測出器；測出黃曲霉素黃曲霉素在在花生花生中的含量，方法重復(fù)性的中的含量，方法重復(fù)性的RSD為為0.38%，平，平均回收率為均回收率為78.4%。n采用甲醇水溶液提取采用甲醇水溶液提取糧食糧食中的黃曲霉毒素，提取液經(jīng)過過濾、稀釋后，中的黃曲霉毒素，提取液經(jīng)過過濾、稀釋后，用免疫親和柱凈化，以

41、甲醇為流動相洗脫，用高效液相色譜法直接測用免疫親和柱凈化，以甲醇為流動相洗脫，用高效液相色譜法直接測定。方法重復(fù)性的定。方法重復(fù)性的RSD為為1.5%，平均回收率為，平均回收率為90%105%。n食品安全分析應(yīng)用的特點n.樣品種類繁多、基質(zhì)復(fù)雜n.極性高或熱不穩(wěn)定的品種越來越多n.法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)、待測物種類與數(shù)量數(shù)量迅速增加n.檢測標(biāo)準(zhǔn)日益提高nLC及LC/MS已經(jīng)成為安全食品領(lǐng)n域極其重要而有效的分析技術(shù)！5 檢測方法前處理技術(shù)檢測方法前處理技術(shù)樣品前處理的重要性樣品前處理的重要性l最低檢測限量的限制l儀器(LC /LC-MS等)的對樣品潔凈度的高要求l樣品基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)（如脂肪、蛋白、色素、

42、鹽份等等）對目標(biāo)物的分離與檢測的干擾l樣品的增多，要求前處理方法簡單快速5.1 溶劑萃取 n溶劑萃取方法主要有液溶劑萃取方法主要有液-液萃取、液液萃取、液-固萃取和液固萃取和液-氣萃取，它們都是屬于兩相間的傳質(zhì)過程，即物質(zhì)氣萃取，它們都是屬于兩相間的傳質(zhì)過程，即物質(zhì)從一相轉(zhuǎn)入另一相的過程。從一相轉(zhuǎn)入另一相的過程。 n溶劑萃取技術(shù)在我們液相色譜分析的樣品制備過溶劑萃取技術(shù)在我們液相色譜分析的樣品制備過程中，是用到最為廣泛的一種技術(shù)。程中，是用到最為廣泛的一種技術(shù)。n在液在液-液萃取中非常重要的操作是急速的振動樣品，液萃取中非常重要的操作是急速的振動樣品，這樣可以確保兩的完全接觸，有助于質(zhì)量傳遞。

43、這樣可以確保兩的完全接觸，有助于質(zhì)量傳遞。由于物質(zhì)劇烈的振動，使得乳化現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，由于物質(zhì)劇烈的振動，使得乳化現(xiàn)象經(jīng)常發(fā)生，特別是那些含有表面活性劑和脂肪的樣品。特別是那些含有表面活性劑和脂肪的樣品。n為了防止乳化形成，常采用加熱或加鹽的方法破為了防止乳化形成，常采用加熱或加鹽的方法破乳。乳。n常用于破乳的技術(shù)有：n （1） 加鹽； n （2） 使用加熱-冷卻萃取容器；n （3） 通過離心作； n （4）加少量的不同的有機溶劑。 5.2 固相萃取 （phase extraction SPE） n固相萃取（固相萃?。⊿PE）是利用固體吸附劑將液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣）是利用固體吸附劑將

44、液體樣品中的目標(biāo)化合物吸附，與樣品的基體和干擾化合物分離。品的基體和干擾化合物分離。n然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。然后再用洗脫液洗脫或加熱解吸附，達(dá)到分離和富集目標(biāo)化合物的目的。n與液液萃取相比固相萃取有很多優(yōu)點：與液液萃取相比固相萃取有很多優(yōu)點：固相萃取不需要大量互不相深的溶劑，固相萃取不需要大量互不相深的溶劑，處理過程中不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，處理過程中不會產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，它采用高效、高選擇性的吸附劑（固定相），能顯著減少溶劑的用量，簡化樣品它采用高效、高選擇性的吸附劑（固定相），能顯著減少溶劑的用量，簡化樣品的預(yù)處理過程，同時所需費用也有所減少。的預(yù)處理過程，

45、同時所需費用也有所減少。n一般來說固相萃取費用為液液萃取的五分之一，但其缺點是目標(biāo)化合物的回一般來說固相萃取費用為液液萃取的五分之一，但其缺點是目標(biāo)化合物的回收率和精密度要略低于液液萃取。收率和精密度要略低于液液萃取。n固相萃取實質(zhì)是上一種液相色譜分離，其主要分離模式也與液相色譜固相萃取實質(zhì)是上一種液相色譜分離，其主要分離模式也與液相色譜相同，相同，n可分為正相（吸附劑極性大于洗脫液極性），反相（吸附劑極性小于可分為正相（吸附劑極性大于洗脫液極性），反相（吸附劑極性小于洗脫液極性），離子交換和吸附。洗脫液極性），離子交換和吸附。n固相萃取所用的吸附劑與液相色譜常用的固定相相同，只是在粒度上固相

46、萃取所用的吸附劑與液相色譜常用的固定相相同，只是在粒度上有所區(qū)別。有所區(qū)別。n最簡單的固相萃裝置就是一根直徑為數(shù)毫米的小柱，小柱可以是聚丙最簡單的固相萃裝置就是一根直徑為數(shù)毫米的小柱，小柱可以是聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯等塑料，還可是不銹鋼的?，F(xiàn)在很多廠家開烯、聚乙烯、聚四氟乙烯等塑料，還可是不銹鋼的。現(xiàn)在很多廠家開發(fā)了固相萃取的專用裝置，固相萃取儀。發(fā)了固相萃取的專用裝置，固相萃取儀。n SPE柱構(gòu)造柱構(gòu)造固固相萃取小柱構(gòu)造相萃取小柱構(gòu)造n固相萃取的一般操作程序分為以下幾步聚： （1）活化吸附劑； （2）樣品過柱 （3）淋洗 （4）分析物洗脫 n不同的模式固相萃取小柱活化所用的溶劑不同；n洗

47、脫所用溶劑也不同。n 5.3 凝膠滲透色譜（GPC）n GPC是被用來去除脂肪和其它分子量相對較高的化合物，是被用來去除脂肪和其它分子量相對較高的化合物，n適用的樣品范圍極廣，回收的農(nóng)藥品種多，回收率也高，適用的樣品范圍極廣，回收的農(nóng)藥品種多，回收率也高，n不僅對油脂凈化效果好，而且分析的重現(xiàn)性好，柱子可以重復(fù)作用，不僅對油脂凈化效果好，而且分析的重現(xiàn)性好，柱子可以重復(fù)作用，已成為藥物殘留分析中的通用凈化方法。已成為藥物殘留分析中的通用凈化方法。n其作用類似一組分子篩，將樣品溶液加到柱子上后，用溶劑淋洗，分其作用類似一組分子篩，將樣品溶液加到柱子上后，用溶劑淋洗，分子量大于農(nóng)藥的類脂肪，色素，

48、蠟質(zhì)等先被淋洗出來，然后農(nóng)藥按分子量大于農(nóng)藥的類脂肪，色素，蠟質(zhì)等先被淋洗出來，然后農(nóng)藥按分子量大小相繼被淋洗出來。常用的淋洗劑有環(huán)已烷，二氯甲烷，甲苯，子量大小相繼被淋洗出來。常用的淋洗劑有環(huán)已烷，二氯甲烷，甲苯，乙酸乙酯等，這種技術(shù)在歐美國家應(yīng)用非常普遍。乙酸乙酯等，這種技術(shù)在歐美國家應(yīng)用非常普遍。n 5.4固相微萃取（固相微萃?。╯olid phase micro-extraction SPME）n固相微萃?。ü滔辔⑤腿。⊿PME）是在固相萃取上發(fā)展起來的一種新型、高效的）是在固相萃取上發(fā)展起來的一種新型、高效的樣品預(yù)處理技術(shù)樣品預(yù)處理技術(shù)n它集采集、濃縮于一體，簡單、方便、無溶劑，不會

49、造成二次污染，它集采集、濃縮于一體，簡單、方便、無溶劑，不會造成二次污染，是一種有利于環(huán)保的很有應(yīng)用前景的預(yù)處理方法。是一種有利于環(huán)保的很有應(yīng)用前景的預(yù)處理方法。n與液液萃取和固相萃取相比，具有操作時間短，樣品量小，無需萃取與液液萃取和固相萃取相比，具有操作時間短，樣品量小，無需萃取溶劑，適用于分析揮發(fā)性與非揮發(fā)性物質(zhì)，重現(xiàn)性好等優(yōu)點。溶劑，適用于分析揮發(fā)性與非揮發(fā)性物質(zhì)，重現(xiàn)性好等優(yōu)點。 n固相萃取過程是一個平衡過程，萃取的平衡時間與攪拌速度、固定相固相萃取過程是一個平衡過程，萃取的平衡時間與攪拌速度、固定相的膜厚以及被分析樣品的分配常數(shù)，擴散系數(shù)，萃取溫度有關(guān)。大分的膜厚以及被分析樣品的分

50、配常數(shù)，擴散系數(shù)，萃取溫度有關(guān)。大分子質(zhì)量的物質(zhì)比小分子質(zhì)量的物質(zhì)需更長的分析時間。攪拌有利于減子質(zhì)量的物質(zhì)比小分子質(zhì)量的物質(zhì)需更長的分析時間。攪拌有利于減少達(dá)到平衡所需時間，當(dāng)達(dá)到平衡時，固相微萃取方法的靈敏度最高。少達(dá)到平衡所需時間，當(dāng)達(dá)到平衡時，固相微萃取方法的靈敏度最高。n固相微萃取固相微萃取(SPME)非常小巧非常小巧,狀似一只色譜注射器，由手狀似一只色譜注射器，由手柄柄(Holder)和萃取頭或纖維頭和萃取頭或纖維頭(Fiber)兩部分構(gòu)成。萃取頭兩部分構(gòu)成。萃取頭是一根外套不銹鋼細(xì)管的是一根外套不銹鋼細(xì)管的1cm長、涂有不同色譜固定相或長、涂有不同色譜固定相或吸附劑的熔融石英纖維

51、頭，纖維頭在不銹鋼管內(nèi)可自由伸吸附劑的熔融石英纖維頭，纖維頭在不銹鋼管內(nèi)可自由伸縮，用于萃取、吸附樣品縮，用于萃取、吸附樣品;手柄用于安裝或固定萃取頭，手柄用于安裝或固定萃取頭，可永久使用。可永久使用。 5.5 微波萃取技術(shù)微波萃取技術(shù)（micro amplitude extraction MAE）n 微波萃取就是利用極性分子可迅速吸收微波能量來加熱一些具有極微波萃取就是利用極性分子可迅速吸收微波能量來加熱一些具有極性的溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮和水等。性的溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮和水等。n因非極性溶劑不能吸收微波能量，所以在微波萃取中不能使用因非極性溶劑不能吸收微波能量，所以在微波萃取中不能使

52、用100的非極性溶劑作為萃取溶劑。的非極性溶劑作為萃取溶劑。 n一般可在非溶劑中加入一定比例的極性溶劑來使用。一般可在非溶劑中加入一定比例的極性溶劑來使用。 nMAE就是將樣品放在聚四氟乙烯材料樣品杯中，加入萃取溶劑后將就是將樣品放在聚四氟乙烯材料樣品杯中，加入萃取溶劑后將樣品杯放入密封性好、耐高壓又不吸收微波能量的萃取罐中。樣品杯放入密封性好、耐高壓又不吸收微波能量的萃取罐中。n由于萃取罐是密封的，當(dāng)萃取溶劑加熱時，由于萃取溶劑的揮發(fā)使罐由于萃取罐是密封的，當(dāng)萃取溶劑加熱時，由于萃取溶劑的揮發(fā)使罐內(nèi)壓力增加。內(nèi)壓力增加。n壓力的增加使用萃取溶劑的沸點也大大增加，這樣就提高了萃取溫度。壓力的增

53、加使用萃取溶劑的沸點也大大增加，這樣就提高了萃取溫度。同時由于密封，萃取溶劑也不會損失，也就減少了萃取溶劑的用量。同時由于密封，萃取溶劑也不會損失，也就減少了萃取溶劑的用量。5.6 加速溶劑萃?。?ASE ）n加速溶劑萃取是在提高的溫度加速溶劑萃取是在提高的溫度（50200）和壓力）和壓力（10003000psi或或10.320.6MPa）下用溶劑萃?。┫掠萌軇┹腿」腆w或半固體樣品的新穎樣品固體或半固體樣品的新穎樣品前處理方法。前處理方法。將樣品裝入萃取池 Time(min溶劑充滿萃取池 萃取池加熱加壓 樣品保持一定的壓力 和溫度 (靜態(tài)萃?。┫蜉腿〕刂凶⑷肭鍧嵢軇?0.5用N2 吹掃萃取池萃

54、取液準(zhǔn)備分析. Total ASE提取過程提取過程三、提取技術(shù)三、提取技術(shù)ASE提取的特點n有機溶劑用量少、快速、回收率高n克服了超臨界萃取選擇性差、回收率低的問題n被美國EPA（環(huán)保局）的標(biāo)準(zhǔn)方法所采用n國際上在食品安全檢測中開始采用這一技術(shù)，n設(shè)備價格昂貴5.7 分散固相萃取分散固相萃取MASnMAS的含義是：的含義是：Multi-function Impurity Adsorption SPE，即，即“多重機制雜質(zhì)吸附萃取多重機制雜質(zhì)吸附萃取凈化法凈化法”。 n主要通過多官能化的復(fù)合吸附材料，將生物樣品主要通過多官能化的復(fù)合吸附材料，將生物樣品中的主要干擾基質(zhì)吸附，而將強水溶性的被測物中

55、的主要干擾基質(zhì)吸附，而將強水溶性的被測物質(zhì)留在樣品溶液中而達(dá)到凈化和富集的目的。質(zhì)留在樣品溶液中而達(dá)到凈化和富集的目的。n填充料一般為填充料一般為C18或或C8 ,樣品和填充料的比樣品和填充料的比例通常為例通常為1 :4。MAS流程示意圖流程示意圖n將樣品及提取溶劑同時將樣品及提取溶劑同時放入離心管中，震蕩或放入離心管中，震蕩或超聲提取；超聲提??；n加入加入SPE填料吸附凈化填料吸附凈化樣品基質(zhì)干擾，離心后樣品基質(zhì)干擾，離心后檢測目標(biāo)物被留在了溶檢測目標(biāo)物被留在了溶液里。液里。n取上清液進(jìn)行后處理或取上清液進(jìn)行后處理或直接檢測。直接檢測。 快速，簡單，提取和凈化一步完成快速，簡單，提取和凈化一

56、步完成 避免了樣品乳化、濃縮造成的待測組分的損失避免了樣品乳化、濃縮造成的待測組分的損失 經(jīng)濟(jì)，成本低經(jīng)濟(jì)，成本低Mas 優(yōu)點優(yōu)點MAS方法特點n常規(guī)SPE是吸附再洗脫得到目標(biāo)化合物，而MAS是只吸附雜質(zhì)nMAS與一般吸附雜質(zhì)的樣品凈化法的主要區(qū)別在于使用多官能團(tuán)吸附試劑，同時除去多種雜質(zhì)n該方法的核心之一是對于蛋白質(zhì)、多肽、氨基酸、磷脂等生物干擾基質(zhì)具有較好選擇性吸附的分離材料。n通過選擇合適的條件（溶劑組合、pH）可以將樣品中大部分的生物干擾基質(zhì)去除，而保證強水溶性被測物質(zhì)具有70%以上的回收率。n6、樣品處理的基本方法及經(jīng)驗n6.1 概述概述n目的：分離-檢測n基本內(nèi)容：提取、凈化、濃縮

57、、衍生化n6.2 樣品預(yù)處理樣品預(yù)處理n采集n制備n貯存n6.3 提取方法提取方法n1） 樣品種類n飲料、果汁、奶、蛋、動物組織（肉、肝、腎等）n2）提取溶劑n-相似相溶原則n-一般采用乙腈、甲醇和丙酮等水溶性溶劑n-混合溶劑，增加選擇性3）提取方法）提取方法n-組織搗碎法（homogenization)n-振蕩法(shaking)n-索氏提取法(Soxhlet extraction)n-超聲波輔助提?。⊿AE）n-強化溶劑萃取（ASE）n-微波輔助萃?。∕AE）n-消解法：酸消解、堿消解、酶消解n-其他n6.4 凈化方法凈化方法n1）液液萃取LLEn2）固相萃取固相萃取SPEn3）固相微萃取

58、（SPME）n4）制備色譜法（HPLC、TLC）n5）凝膠滲透色譜法（GPC）n6）基質(zhì)固相分散技術(shù)（MSPD）：獸藥殘留n7）免疫親和柱（IAC） ：毒素n8）分子印跡技術(shù)（MIPs)：痕量成分n9) 其他技術(shù)n6.5 濃縮與富集濃縮與富集n-旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮n-氮吹儀n-濃縮器濃縮、平行蒸發(fā)儀n-真空離心濃縮n濃縮過程組分最容易損失n6.6 衍生化衍生化n-反應(yīng)速度快n-容易重復(fù)n-定量完全、轉(zhuǎn)化率穩(wěn)定n-產(chǎn)物易純化n-產(chǎn)物易于分離和檢測n-HPLC衍生化方法：多用熒光檢測器n-衍生化方式：柱前、柱后技術(shù)內(nèi)容說明提取用物理、化學(xué)或生物的手段破壞待測組分與樣品基質(zhì)組分之間的結(jié)合力，將待測組分從樣

59、品中游離出來并進(jìn)行有選擇的提取。這種結(jié)合力是分子間力或化學(xué)鍵。去除基質(zhì)，減少由基質(zhì)對待測組分的帶來的影響，如吸附、共沉淀等。純化將待測物和提取過程共萃取物（雜質(zhì)）有選擇地進(jìn)行分離，同時滿足在分析實驗室可操作的條件下，能達(dá)到分析方法在質(zhì)量控制指標(biāo)上的要求。雜質(zhì)的存在會影響定性、定量的結(jié)果。對設(shè)備也會產(chǎn)生影響。濃縮指減少樣品溶液中溶劑含量，使組分濃度提高。進(jìn)行基質(zhì)溶劑更換。濃度在檢測器的響應(yīng)范圍。分析設(shè)備要求。衍生由分析物的結(jié)構(gòu)特點，特征選擇性的衍生化。衍生改變分析物的結(jié)構(gòu)特點。滿足定性要求；或接顯色基團(tuán)。滿足分離要求。分析應(yīng)用對前處理技術(shù)的要求分析應(yīng)用對前處理技術(shù)的要求提高檢測靈敏度，可靠性（假

60、陰性，假陽提高檢測靈敏度，可靠性（假陰性，假陽性）性）提高分析檢測的整體速度提高分析檢測的整體速度樣品前處理方法比較樣品前處理方法比較LLE-化合物在化合物在不互溶的兩相不互溶的兩相中的溶解度的不同達(dá)到分離中的溶解度的不同達(dá)到分離PPT (蛋白沉淀法蛋白沉淀法)血樣中去除蛋白血樣中去除蛋白SPE保留目標(biāo)物保留目標(biāo)物分析物干擾物柱預(yù)處理樣品添加柱洗滌分析物洗脫GPC-根據(jù)分子量大小的差異到達(dá)分離，去除油脂、根據(jù)分子量大小的差異到達(dá)分離，去除油脂、 色素等大分子量的雜質(zhì)色素等大分子量的雜質(zhì)SPE(固相萃取固相萃取)機理機理Source: / 免疫親和柱的凈化過程