氨基酸工藝學(xué)谷氨酸發(fā)酵機(jī)制

1、1會(huì)計(jì)學(xué)氨基酸工藝學(xué)谷氨酸發(fā)酵機(jī)制氨基酸工藝學(xué)谷氨酸發(fā)酵機(jī)制一、谷氨酸生物合成途徑一、谷氨酸生物合成途徑 生物體內(nèi)合成谷氨酸的前體物質(zhì)是生物體內(nèi)合成谷氨酸的前體物質(zhì)是a-酮戊二酸酮戊二酸，是三羧酸循環(huán)是三羧酸循環(huán)(TCA循環(huán)循環(huán))的中間產(chǎn)物，由糖質(zhì)原料的中間產(chǎn)物，由糖質(zhì)原料生物合成谷氨酸的途徑包括生物合成谷氨酸的途徑包括糖酵解途徑糖酵解途徑(EMP途徑途徑)、三羧酸循環(huán)三羧酸循環(huán)、乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán)、CO2的固定反應(yīng)的固定反應(yīng)(伍德伍德一沃克曼反應(yīng)一沃克曼反應(yīng))等。等。（一）、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循環(huán)（一）、葡萄糖的糖酵解、三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán) 1.糖酵解途徑（糖酵解途徑（E

2、MP途徑）途徑）將將一分子葡萄糖一分子葡萄糖分解成分解成兩分子丙酮酸兩分子丙酮酸,并且發(fā)生并且發(fā)生氧化氧化(脫氫脫氫)和生成少量和生成少量ATP。 葡萄糖葡萄糖6-磷酸葡萄糖磷酸葡萄糖3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛丙酮酸丙酮酸6-磷酸葡萄糖酸磷酸葡萄糖酸5-磷酸核酮糖磷酸核酮糖HMP途徑EMP途徑2.戊糖磷酸途徑（戊糖磷酸途徑（HMP途徑）途徑）可以生成酵解途徑的中間產(chǎn)物可以生成酵解途徑的中間產(chǎn)物6-磷酸果糖磷酸果糖和和3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛。肌肉中的葡萄糖代謝情況肌肉中的葡萄糖代謝情況3.三羧酸循環(huán)（三羧酸循環(huán)（TCA循環(huán)）循環(huán)）谷氨酸谷氨酸（胞內(nèi)）（胞內(nèi)）轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到胞外胞外草酰乙酸草酰乙酸檸

3、檬酸檸檬酸順烏頭酸順烏頭酸異檸檬酸異檸檬酸- -酮戊二酸酮戊二酸琥珀酸琥珀酸延胡索酸延胡索酸蘋(píng)果酸蘋(píng)果酸丙酮酸丙酮酸乙酰乙酰CoA乙醛酸乙醛酸+CO2乙醛酸循環(huán)中的兩個(gè)乙醛酸循環(huán)中的兩個(gè)關(guān)鍵關(guān)鍵酶酶異檸檬酸裂解酶異檸檬酸裂解酶和和蘋(píng)果酸合成酶。蘋(píng)果酸合成酶。 異檸檬酸脫氫酶 NH4-酮戊二酸脫氫酶酮戊二酸脫氫酶 （二）谷氨酸合成的理想途徑（二）谷氨酸合成的理想途徑在發(fā)酵在發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)酸期，期，EMP所占比例更大，約為所占比例更大，約為74。 生物素充足菌生物素充足菌EMP所占比例約為所占比例約為62； （三）由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑（三）由葡萄糖生物合成谷氨酸的代謝途徑 3.在谷氨酸發(fā)酵

4、的在谷氨酸發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)期菌體生長(zhǎng)期，由于三羧酸循環(huán)中，由于三羧酸循環(huán)中的的缺陷缺陷(喪失喪失a-酮戊二酸脫氫酶氧化能力或氧化能力酮戊二酸脫氫酶氧化能力或氧化能力微弱微弱)，谷氨酸產(chǎn)生菌采用，谷氨酸產(chǎn)生菌采用乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán)途徑進(jìn)行代謝途徑進(jìn)行代謝，提供四碳二羧酸及菌體合成所需的中間產(chǎn)物等。，提供四碳二羧酸及菌體合成所需的中間產(chǎn)物等。2.此代謝途徑至少有此代謝途徑至少有16步酶步酶促反應(yīng)。促反應(yīng)。1.谷氨酸生產(chǎn)菌株為谷氨酸生產(chǎn)菌株為缺陷型缺陷型，生產(chǎn)過(guò)程分為，生產(chǎn)過(guò)程分為菌體生菌體生長(zhǎng)期長(zhǎng)期和和谷氨酸積累期谷氨酸積累期。 4. 在菌體生長(zhǎng)期之后，進(jìn)入在菌體生長(zhǎng)期之后，進(jìn)入谷氨酸生成期谷氨酸

5、生成期，封閉封閉乙醛酸循環(huán)，乙醛酸循環(huán)，積累積累- -酮戊二酸酮戊二酸，就能夠大量生就能夠大量生成、成、積累谷氨酸積累谷氨酸。 因此在谷氨酸發(fā)酵中，菌體生長(zhǎng)期的最適條因此在谷氨酸發(fā)酵中，菌體生長(zhǎng)期的最適條件和谷氨酸生成積累期的最適條件是不一樣的。件和谷氨酸生成積累期的最適條件是不一樣的。 5. 由葡萄糖生由葡萄糖生物合成谷氨酸的物合成谷氨酸的代謝途徑代謝途徑 （1 1）在谷氨酸生成期，）在谷氨酸生成期，假如四碳二羧酸是假如四碳二羧酸是100100通過(guò)通過(guò)C0C02 2固定反應(yīng)供給，固定反應(yīng)供給，在生長(zhǎng)期之后，理在生長(zhǎng)期之后，理想的發(fā)酵按如下反應(yīng)進(jìn)行：想的發(fā)酵按如下反應(yīng)進(jìn)行：1mol1mol葡萄

6、糖可以生成葡萄糖可以生成1mol1mol的谷氨酸，谷氨酸對(duì)葡萄的谷氨酸，谷氨酸對(duì)葡萄糖的糖的質(zhì)量理論轉(zhuǎn)化率質(zhì)量理論轉(zhuǎn)化率為：為：6.葡萄糖對(duì)谷氨酸的轉(zhuǎn)化率葡萄糖對(duì)谷氨酸的轉(zhuǎn)化率（2 2）在谷氨酸生成期，若）在谷氨酸生成期，若 COCO2 2固定反應(yīng)固定反應(yīng)完全不起作用完全不起作用，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的，丙酮酸在丙酮酸脫氫酶的催化作用下，脫氫脫羧全部催化作用下，脫氫脫羧全部氧化成乙酰氧化成乙酰CoACoA，通過(guò)乙醛，通過(guò)乙醛酸循環(huán)供給四碳二羧酸。反酸循環(huán)供給四碳二羧酸。反應(yīng)如下：應(yīng)如下：3C6H12O66丙酮酸丙酮酸6乙酰乙酰CoA乙醛酸循環(huán)：乙醛酸循環(huán)：4乙酰乙酰CoA +4H2O2琥珀酸琥

7、珀酸+4CoASH6乙酰乙酰CoA +2NH3+3O22谷氨酸谷氨酸+2CO2+6H2O3mol葡萄糖可以生成葡萄糖可以生成2mol的谷氨酸，谷氨的谷氨酸，谷氨酸對(duì)葡萄糖的酸對(duì)葡萄糖的質(zhì)量理論轉(zhuǎn)化率質(zhì)量理論轉(zhuǎn)化率為：為：(3)實(shí)際轉(zhuǎn)化率：實(shí)際轉(zhuǎn)化率：處于二者之間，處于二者之間，即即54.4%81.7%。CO2固定反應(yīng)、乙醛酸循環(huán)的比率等對(duì)轉(zhuǎn)化率影固定反應(yīng)、乙醛酸循環(huán)的比率等對(duì)轉(zhuǎn)化率影響較大。響較大。乙醛酸循環(huán)活性越高，谷氨酸越不易生成與積累。乙醛酸循環(huán)活性越高，谷氨酸越不易生成與積累。 7.醋酸醋酸或或正石蠟正石蠟原料發(fā)酵谷氨酸的推測(cè)途徑原料發(fā)酵谷氨酸的推測(cè)途徑 在醋酸發(fā)酵谷氨酸或石油發(fā)酵谷氨

8、酸時(shí)，卻在醋酸發(fā)酵谷氨酸或石油發(fā)酵谷氨酸時(shí)，卻只能只能經(jīng)乙醛酸循環(huán)供給四碳二羧酸經(jīng)乙醛酸循環(huán)供給四碳二羧酸，四碳二羧酸經(jīng)草酰，四碳二羧酸經(jīng)草酰乙酸又轉(zhuǎn)化為檸檬酸。乙酸又轉(zhuǎn)化為檸檬酸。二、谷氨酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制二、谷氨酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制 在工業(yè)上，通過(guò)在工業(yè)上，通過(guò)對(duì)微生物代謝途徑的控制對(duì)微生物代謝途徑的控制來(lái)滿足來(lái)滿足生產(chǎn)的需要，提高生產(chǎn)效益。生產(chǎn)的需要，提高生產(chǎn)效益。所以，研究微生物代謝調(diào)節(jié)機(jī)制有極其重要的意義所以，研究微生物代謝調(diào)節(jié)機(jī)制有極其重要的意義。 合成代謝將分解代謝產(chǎn)生的能量和合成代謝將分解代謝產(chǎn)生的能量和中間體合成氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)中間體合成氨基酸、核酸、蛋白質(zhì)等物

9、質(zhì)。等物質(zhì)。微生物微生物的代謝的代謝分解代謝分解代謝：合成代謝合成代謝：從環(huán)境中攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，把它們轉(zhuǎn)從環(huán)境中攝取營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，把它們轉(zhuǎn)化為自身物質(zhì)，以此來(lái)提供能源和化為自身物質(zhì)，以此來(lái)提供能源和小分子中間體；小分子中間體； 1糖代謝糖代謝(EMP途徑和途徑和HMP途徑途徑)的調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié) 糖代謝可分為糖代謝可分為分解分解與與合成合成兩方面。兩方面。糖分解代謝糖分解代謝包括酵解與三羧酸循環(huán)；包括酵解與三羧酸循環(huán)；（提供能量（提供能量）合成代謝合成代謝包括糖的異生、糖原與結(jié)構(gòu)多糖的合成包括糖的異生、糖原與結(jié)構(gòu)多糖的合成等，中間代謝還有磷酸戊糖途徑、糖醛酸途徑等等，中間代謝還有磷酸戊糖途徑、糖醛酸途徑等

10、。（消耗能量）（消耗能量） (1)能荷的調(diào)節(jié)能荷的調(diào)節(jié)腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷腺嘌呤核苷三磷酸，又叫三磷酸腺苷(腺苷三磷酸腺苷三磷酸)，簡(jiǎn)稱為，簡(jiǎn)稱為ATP。 其其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式是：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式是：APPP，其相鄰的兩個(gè)磷酸，其相鄰的兩個(gè)磷酸基之間的化學(xué)鍵非?；钴S基之間的化學(xué)鍵非?；钴S，水解時(shí)可釋放約，水解時(shí)可釋放約30.54kJ/mol的能量，因的能量，因此稱為高能磷酸鍵。此稱為高能磷酸鍵。能荷調(diào)節(jié)是通過(guò)能荷調(diào)節(jié)是通過(guò)ATP、ADP和和AMP分子對(duì)某些酶分子對(duì)某些酶分子進(jìn)行變構(gòu)調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。分子進(jìn)行變構(gòu)調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。Atkinson提出了能荷的概念。提出了能荷的概念。認(rèn)為認(rèn)為能荷能荷是細(xì)胞中高

11、能磷酸狀態(tài)的一種數(shù)量上的衡量是細(xì)胞中高能磷酸狀態(tài)的一種數(shù)量上的衡量，能荷大小可以說(shuō)明生物體中，能荷大小可以說(shuō)明生物體中ATPADPAMP系統(tǒng)系統(tǒng)的能量狀態(tài)。能荷的大小決定于的能量狀態(tài)。能荷的大小決定于ATP和和ADP的多少。的多少。 能荷逐漸升高時(shí)，能荷逐漸升高時(shí)，即細(xì)胞內(nèi)的能量水平逐漸升高即細(xì)胞內(nèi)的能量水平逐漸升高，這一過(guò)程中，這一過(guò)程中AMP、ADP轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)變成ATP。 ATP的增加會(huì)的增加會(huì)抑制糖分解代謝，抑制糖分解代謝，抑制如檸檬酸合抑制如檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶等酶的活性，并激活糖類(lèi)合成酶、異檸檬酸脫氫酶等酶的活性，并激活糖類(lèi)合成的酶，加速糖原的合成。成的酶，加速糖原的合成。 糖

12、酵解糖酵解主要受三個(gè)酶調(diào)節(jié)：磷酸果糖激酶、己糖激酶、主要受三個(gè)酶調(diào)節(jié)：磷酸果糖激酶、己糖激酶、丙酮酸激酶，其中丙酮酸激酶，其中磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶是限速酶，己糖激酶控制是限速酶，己糖激酶控制酵解的入口，丙酮酸激酶控制出口；酵解的入口，丙酮酸激酶控制出口；三羧酸循環(huán)三羧酸循環(huán)的調(diào)控由的調(diào)控由三個(gè)酶調(diào)控，即三個(gè)酶調(diào)控，即檸檬酸合成酶檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶和和-酮戊二酮戊二酸脫氫酶酸脫氫酶。兩者都與能荷的控制調(diào)節(jié)相關(guān)。兩者都與能荷的控制調(diào)節(jié)相關(guān)。 當(dāng)生物體內(nèi)生物合成或其它需能反應(yīng)加強(qiáng)時(shí)，細(xì)當(dāng)生物體內(nèi)生物合成或其它需能反應(yīng)加強(qiáng)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)胞內(nèi)ATP分解生成分解生成ADP或或AMP

13、，ATP減少，減少，能荷降低能荷降低，就會(huì)，就會(huì)激活激活某些催化糖類(lèi)分解的酶某些催化糖類(lèi)分解的酶(糖原磷酸化酶、磷糖原磷酸化酶、磷酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶等酸果糖激酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶等)或解或解除除ATP對(duì)這些酶的抑制，并抑制合成糖原的酶對(duì)這些酶的抑制，并抑制合成糖原的酶(NN合合成酶、果糖成酶、果糖-1，6二磷酸酯酶等二磷酸酯酶等)，從而加速酵解、，從而加速酵解、TCA循環(huán)產(chǎn)生能量，通過(guò)氧化磷酸化作用生成循環(huán)產(chǎn)生能量，通過(guò)氧化磷酸化作用生成ATP。 (2)生物素對(duì)糖代謝速率的調(diào)節(jié)生物素對(duì)糖代謝速率的調(diào)節(jié) 生物素對(duì)糖代謝的調(diào)生物素對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)與能荷的調(diào)節(jié)是不同的

14、節(jié)與能荷的調(diào)節(jié)是不同的，能荷是對(duì)糖代謝流的調(diào)，能荷是對(duì)糖代謝流的調(diào)節(jié)，而節(jié)，而生物素能夠促進(jìn)糖生物素能夠促進(jìn)糖的的EMP、HMP途徑、途徑、TCA循環(huán)。循環(huán)。 谷氨酸產(chǎn)生菌大多為谷氨酸產(chǎn)生菌大多為生物素缺陷型生物素缺陷型。許多研究表。許多研究表明，生物素對(duì)從糖開(kāi)始到丙酮酸為止的糖降解途徑的明，生物素對(duì)從糖開(kāi)始到丙酮酸為止的糖降解途徑的比例并沒(méi)有顯著的影響，主要作用是比例并沒(méi)有顯著的影響，主要作用是對(duì)糖降解速率的對(duì)糖降解速率的調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)。 原因：原因：碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝中的碳水化合物、脂肪和蛋白質(zhì)代謝中的許多反應(yīng)都需要生許多反應(yīng)都需要生物素物素。 生物素的主要功能生物素的主要功能是在脫

15、羧是在脫羧-羧化反應(yīng)和脫氨反應(yīng)中起羧化反應(yīng)和脫氨反應(yīng)中起輔酶輔酶作用，并和碳水化合物與蛋白質(zhì)的互變、碳水化合物以及蛋白作用，并和碳水化合物與蛋白質(zhì)的互變、碳水化合物以及蛋白質(zhì)向脂肪的轉(zhuǎn)化有關(guān)。質(zhì)向脂肪的轉(zhuǎn)化有關(guān)。 在碳水化合物代謝中，生物素酶能催化脫羧和羧化反應(yīng)。在碳水化合物代謝中，生物素酶能催化脫羧和羧化反應(yīng)。碳水化合物代謝中依賴生物素的特異反應(yīng)有：丙酮酸轉(zhuǎn)化生成碳水化合物代謝中依賴生物素的特異反應(yīng)有：丙酮酸轉(zhuǎn)化生成草酰乙酸；蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸；琥珀酸與丙酮酸的互變；草草酰乙酸；蘋(píng)果酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸；琥珀酸與丙酮酸的互變；草酰琥珀酸轉(zhuǎn)化為酰琥珀酸轉(zhuǎn)化為-酮戊二酸。酮戊二酸。2三羧酸循環(huán)三羧酸循

16、環(huán)(TCA循環(huán)循環(huán))的調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié) 谷氨酸產(chǎn)生菌在代謝途徑中，三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)主要谷氨酸產(chǎn)生菌在代謝途徑中，三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)主要是通過(guò)是通過(guò)5種酶的調(diào)節(jié)進(jìn)行的。這五種酶是磷酸烯醇式丙酮種酶的調(diào)節(jié)進(jìn)行的。這五種酶是磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酸羧化酶、檸檬酸合成酶、異檸檬酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶和酶和-酮戊二酸脫氫酶。酮戊二酸脫氫酶。 谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過(guò)量后，谷氨酸比天冬氨酸優(yōu)先合成，谷氨酸合成過(guò)量后，谷氨酸抑制谷氨酸脫氫酶的活力并阻遏檸檬酸合成酶谷氨酸抑制谷氨酸脫氫酶的活力并阻遏檸檬酸合成酶的合成，使代謝轉(zhuǎn)向天冬氨酸的合成。的合成，使代謝轉(zhuǎn)向

17、天冬氨酸的合成。 草酰乙酸草酰乙酸+谷氨酸谷氨酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶天冬氨酸天冬氨酸+- -酮戊二酸酮戊二酸磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶受天冬氨酸的反饋抑受天冬氨酸的反饋抑制，受谷氨酸和天冬氨酸的反饋?zhàn)瓒簟Ｖ?，受谷氨酸和天冬氨酸的反饋?zhàn)瓒?。檸檬酸合成酶檸檬酸合成酶是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，除受能是三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵酶，除受能荷調(diào)節(jié)外，還受谷氨酸的反饋?zhàn)瓒艉蜑躅^酸的反荷調(diào)節(jié)外，還受谷氨酸的反饋?zhàn)瓒艉蜑躅^酸的反饋抑制。饋抑制。反饋抑制：是指最終產(chǎn)物抑制作用，即在合成過(guò)程中有生物合成途徑的終點(diǎn)反饋抑制：是指最終產(chǎn)物抑制作用，即在合成過(guò)程中有生物合成途徑的終點(diǎn)產(chǎn)物對(duì)該途徑的酶的活性調(diào)節(jié)，

18、所引起的產(chǎn)物對(duì)該途徑的酶的活性調(diào)節(jié)，所引起的抑制作用抑制作用。反饋抑制與反饋抑制與反饋?zhàn)瓒舴答佔(zhàn)瓒舻膮^(qū)別在于：的區(qū)別在于：反饋?zhàn)瓒羰寝D(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)反饋?zhàn)瓒羰寝D(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，產(chǎn)生效應(yīng)慢，產(chǎn)生效應(yīng)慢，反饋抑制是酶活性水平調(diào)節(jié)，產(chǎn)生效應(yīng)快。此外，前者的作用往往會(huì)影響，反饋抑制是酶活性水平調(diào)節(jié)，產(chǎn)生效應(yīng)快。此外，前者的作用往往會(huì)影響催化一系反應(yīng)的多個(gè)催化一系反應(yīng)的多個(gè)酶酶，而后者往往只對(duì)是一系列反應(yīng)中的第一個(gè)酶起作用，而后者往往只對(duì)是一系列反應(yīng)中的第一個(gè)酶起作用。 異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶活力強(qiáng)，而異檸檬酸裂解酶活力不活力強(qiáng)，而異檸檬酸裂解酶活力不能太強(qiáng)，這就有利于谷氨酸前體物能太強(qiáng)，這就有利于谷

19、氨酸前體物-酮戊二酸的生成酮戊二酸的生成，滿足合成谷氨酸的需要。，滿足合成谷氨酸的需要。 異檸檬酸脫氫酶催化的異檸檬酸脫氫脫羧生成異檸檬酸脫氫酶催化的異檸檬酸脫氫脫羧生成酮戊二酸的反應(yīng)和谷氨酸脫氫酶催化的酮戊二酸的反應(yīng)和谷氨酸脫氫酶催化的-酮戊二酸還酮戊二酸還原氨基化生成谷氨酸的反應(yīng)是一對(duì)氧化還原共軛反應(yīng)原氨基化生成谷氨酸的反應(yīng)是一對(duì)氧化還原共軛反應(yīng)，細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡酮戊二酸的量與異檸檬酸的量需維持平衡，當(dāng)，當(dāng)酮戊二酸過(guò)量時(shí)，對(duì)異檸檬脫氫酶發(fā)生反饋抑酮戊二酸過(guò)量時(shí)，對(duì)異檸檬脫氫酶發(fā)生反饋抑制作用，停止合成制作用，停止合成酮戊二酸。酮戊二酸。 在谷氨酸的生物合成

20、中，谷氨酸脫氫酶和異檸檬在谷氨酸的生物合成中，谷氨酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶在銨離子存在下，兩者非常密切地偶聯(lián)起酸脫氫酶在銨離子存在下，兩者非常密切地偶聯(lián)起來(lái)，來(lái)，形成強(qiáng)固的氧化還原共軛體系形成強(qiáng)固的氧化還原共軛體系，不與，不與NADPH2的末端氧化系相連接，使的末端氧化系相連接，使酮戊二酸還原氨基化生酮戊二酸還原氨基化生成谷氨酸。成谷氨酸。 沿著由檸檬酸至沿著由檸檬酸至酮戊二酸的氧化途徑，谷氨酸產(chǎn)酮戊二酸的氧化途徑，谷氨酸產(chǎn)生菌有兩種生菌有兩種NADP專性脫氫酶，即專性脫氫酶，即異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶和和L-谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶。 由于由于谷氨酸產(chǎn)生菌谷氨酸產(chǎn)生菌的的谷氨酸脫氫酶谷氨

21、酸脫氫酶比其它微生比其它微生物強(qiáng)物強(qiáng)大大得多，所以由三羧酸循環(huán)所得的檸檬酸的氧得多，所以由三羧酸循環(huán)所得的檸檬酸的氧化中間物就不再往下氧化，而以谷氨酸的形式積累化中間物就不再往下氧化，而以谷氨酸的形式積累起來(lái)。起來(lái)。 谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶存在著反饋抑制和反饋谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶存在著反饋抑制和反饋?zhàn)瓒?。若銨離子進(jìn)一步過(guò)剩供給時(shí)，發(fā)酵液偏酸性阻遏。若銨離子進(jìn)一步過(guò)剩供給時(shí)，發(fā)酵液偏酸性，pH在在5.56.5，谷氨酸會(huì)進(jìn)一步生成，谷氨酸會(huì)進(jìn)一步生成谷氨酰胺谷氨酰胺。在谷氨酸產(chǎn)生菌中，在谷氨酸產(chǎn)生菌中，酮戊二酸脫氫酶酮戊二酸脫氫酶先天先天性性缺失或微弱缺失或微弱，對(duì)導(dǎo)向谷氨酸形成具有重要意，對(duì)導(dǎo)向谷

22、氨酸形成具有重要意義，這是谷氨酸產(chǎn)生菌糖代謝的一個(gè)義，這是谷氨酸產(chǎn)生菌糖代謝的一個(gè)重要特征重要特征。谷氨酸產(chǎn)生菌的谷氨酸產(chǎn)生菌的酮戊二酸氧化力微弱，尤其酮戊二酸氧化力微弱，尤其在生物素缺乏的條件下，三羧酸循環(huán)到達(dá)在生物素缺乏的條件下，三羧酸循環(huán)到達(dá)酮酮戊二酸時(shí)即受到阻擋，這有利于戊二酸時(shí)即受到阻擋，這有利于酮戊二酸的酮戊二酸的積累，然后生成谷氨酸。積累，然后生成谷氨酸。 3乙醛酸循環(huán)乙醛酸循環(huán)(DCA循環(huán)循環(huán))的調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié) 乙醛酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶是乙醛酸循環(huán)中的關(guān)鍵酶是異檸檬酸裂解酶異檸檬酸裂解酶和和蘋(píng)果酸蘋(píng)果酸酶酶。通過(guò)乙醛酸循環(huán)異檸檬酸裂解酶的催化作用使。通過(guò)乙醛酸循環(huán)異檸檬酸裂解酶的催化作

23、用使琥珀酸、延胡索酸和蘋(píng)果酸的量得到補(bǔ)足，其反應(yīng)琥珀酸、延胡索酸和蘋(píng)果酸的量得到補(bǔ)足，其反應(yīng)如下：如下： 葡萄糖葡萄糖和和琥珀酸琥珀酸等對(duì)異檸檬酸裂解酶起著阻遏作用。等對(duì)異檸檬酸裂解酶起著阻遏作用。 在在生物素亞適量生物素亞適量條件下，琥珀酸氧化力降低，條件下，琥珀酸氧化力降低，積累的琥珀酸會(huì)積累的琥珀酸會(huì)反饋抑制反饋抑制異檸檬酸裂解酶活性，并異檸檬酸裂解酶活性，并阻遏該酶的生成，阻遏該酶的生成，DCA循環(huán)基本處于封閉狀態(tài)，循環(huán)基本處于封閉狀態(tài)，異檸檬酸高效率地轉(zhuǎn)化為異檸檬酸高效率地轉(zhuǎn)化為-酮戊二酸，酮戊二酸，再生成谷再生成谷氨酸氨酸。 在在生物素充足生物素充足的條件下，異檸檬酸裂解酶活性的條

24、件下，異檸檬酸裂解酶活性增大，通過(guò)增大，通過(guò)DCA循環(huán)提供能量，進(jìn)行蛋白質(zhì)的合循環(huán)提供能量，進(jìn)行蛋白質(zhì)的合成，不僅異檸檬酸轉(zhuǎn)化生成谷氨酸的反應(yīng)減弱使得成，不僅異檸檬酸轉(zhuǎn)化生成谷氨酸的反應(yīng)減弱使得谷氨酸減少，而且生成的谷氨酸在轉(zhuǎn)氨酶的催化作谷氨酸減少，而且生成的谷氨酸在轉(zhuǎn)氨酶的催化作用下又轉(zhuǎn)成其它氨基酸，也用下又轉(zhuǎn)成其它氨基酸，也不利于谷氨酸積累不利于谷氨酸積累。 (1)以糖質(zhì)為原料的谷氨酸發(fā)酵中生物素對(duì)以糖質(zhì)為原料的谷氨酸發(fā)酵中生物素對(duì)DCA循環(huán)的影響循環(huán)的影響以醋酸為原料發(fā)酵谷氨酸時(shí)，以醋酸為原料發(fā)酵谷氨酸時(shí)，醋酸濃度要低醋酸濃度要低，高濃度，高濃度的醋酸易被完全氧化。的醋酸易被完全氧化。當(dāng)

25、菌體內(nèi)的有機(jī)酸濃度當(dāng)菌體內(nèi)的有機(jī)酸濃度低低到一定程度，到一定程度，DCA循環(huán)循環(huán)啟啟動(dòng)動(dòng)，此時(shí)異檸檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸與細(xì)胞內(nèi)，此時(shí)異檸檬酸裂解酶催化生成的乙醛酸與細(xì)胞內(nèi)的草酰乙酸共同的草酰乙酸共同抑制抑制異檸檬酸異檸檬酸脫氫酶脫氫酶，TCA循環(huán)轉(zhuǎn)為循環(huán)轉(zhuǎn)為DCA循環(huán)，不利于谷氨酸生成與積累；循環(huán)，不利于谷氨酸生成與積累；當(dāng)當(dāng)DCA循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)使得循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)使得TCA循環(huán)包含的某些有機(jī)酸過(guò)循環(huán)包含的某些有機(jī)酸過(guò)剩時(shí)，異檸檬酸剩時(shí)，異檸檬酸裂解酶被抑制裂解酶被抑制，乙醛酸濃度下降，解，乙醛酸濃度下降，解除對(duì)異檸檬酸脫氫酶的抑制，除對(duì)異檸檬酸脫氫酶的抑制，TCA循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)。循環(huán)運(yùn)轉(zhuǎn)。(2)以醋酸為原

26、料的谷氨酸發(fā)酵對(duì)以醋酸為原料的谷氨酸發(fā)酵對(duì)DCA循環(huán)的影響循環(huán)的影響 4CO2固定反應(yīng)的調(diào)節(jié)固定反應(yīng)的調(diào)節(jié) COCO2 2固定反應(yīng)主要通過(guò)以下途徑完成：固定反應(yīng)主要通過(guò)以下途徑完成：C02的固定反應(yīng)的作用：的固定反應(yīng)的作用：補(bǔ)充草酰乙酸補(bǔ)充草酰乙酸；在谷氨酸合成過(guò)程中，在谷氨酸合成過(guò)程中，糖的分解代謝途徑與糖的分解代謝途徑與C02固定固定的適當(dāng)比例的適當(dāng)比例是提高谷氨酸對(duì)糖收率的是提高谷氨酸對(duì)糖收率的關(guān)鍵關(guān)鍵問(wèn)題。問(wèn)題。 5NH4+的調(diào)節(jié)的調(diào)節(jié) 谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶也能催化谷氨酸氧化也能催化谷氨酸氧化脫氨反應(yīng)脫氨反應(yīng)，脫，脫氨過(guò)程以氨過(guò)程以NAD+作為輔酶，該酶催化的反應(yīng)雖然作為輔酶，該酶

27、催化的反應(yīng)雖然偏向偏向氨合成谷氨酸一邊，但是脫氫過(guò)程產(chǎn)生的氨合成谷氨酸一邊，但是脫氫過(guò)程產(chǎn)生的NADH被氧被氧化成化成NAD+，同時(shí)產(chǎn)生的，同時(shí)產(chǎn)生的NH3很容易被除去。很容易被除去。 脫氨反應(yīng)被脫氨反應(yīng)被NH4+和和-酮戊二酸所酮戊二酸所抑制抑制，這對(duì)于谷，這對(duì)于谷氨酸的氨酸的積累積累也起到了很好的作用。也起到了很好的作用。 在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，在谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中，生物素缺陷型菌生物素缺陷型菌在在NH4+存在時(shí)，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率高；存在時(shí)，葡萄糖消耗速率快而且谷氨酸收率高； NH4+不存在時(shí)，葡萄糖消耗速率很慢，生成物是不存在時(shí)，葡萄糖消耗速率很慢，生成物是-酮戊二酸、丙酮酸等

28、物質(zhì)，不產(chǎn)生谷氨酸。酮戊二酸、丙酮酸等物質(zhì)，不產(chǎn)生谷氨酸。 四、細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié)四、細(xì)胞膜通透性的調(diào)節(jié) 對(duì)谷氨酸發(fā)酵的重要性對(duì)谷氨酸發(fā)酵的重要性：當(dāng)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣诠犬?dāng)細(xì)胞膜轉(zhuǎn)變?yōu)橛欣诠劝彼嵯蚰ね鉂B透的方式，氨酸向膜外滲透的方式，谷氨酸才能不斷地谷氨酸才能不斷地排出細(xì)排出細(xì)胞外胞外，這樣既有利于細(xì)胞，這樣既有利于細(xì)胞內(nèi)谷氨酸內(nèi)谷氨酸合成反應(yīng)的優(yōu)先合成反應(yīng)的優(yōu)先性、連續(xù)性性、連續(xù)性，也有利于谷，也有利于谷氨酸在氨酸在胞外的積累胞外的積累。細(xì)胞膜是在細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)之間的一層柔軟而富有細(xì)胞膜是在細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)之間的一層柔軟而富有彈性的彈性的半滲透性膜半滲透性膜，磷脂雙分子層磷脂雙分子層為其基本

29、結(jié)構(gòu)，為其基本結(jié)構(gòu)，在雙分子層中在雙分子層中鑲嵌蛋白質(zhì)鑲嵌蛋白質(zhì)。 一種是通過(guò)控制脂肪酸和甘油的合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷脂一種是通過(guò)控制脂肪酸和甘油的合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)磷脂合成的控制，使得細(xì)胞合成的控制，使得細(xì)胞不能形成完整的細(xì)胞膜不能形成完整的細(xì)胞膜；一種是通過(guò)一種是通過(guò)干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的形成干擾細(xì)菌細(xì)胞壁的形成，使得細(xì)胞不能，使得細(xì)胞不能形成完整的細(xì)胞壁，喪失了對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作用。形成完整的細(xì)胞壁，喪失了對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作用。在膜內(nèi)外滲透壓差等因素影響下，在膜內(nèi)外滲透壓差等因素影響下，細(xì)胞膜物理性損細(xì)胞膜物理性損傷，增大膜的通透性傷，增大膜的通透性。根據(jù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特性，根據(jù)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)特性，控制細(xì)胞膜控制細(xì)

30、胞膜通透性的方法通透性的方法主要有兩種：主要有兩種：1控制細(xì)胞膜的形成控制細(xì)胞膜的形成 利用利用生物素缺陷型菌株生物素缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí)，進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí)，限制限制發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度。發(fā)酵培養(yǎng)基中生物素的濃度。 生物素參與了脂肪酸的生物合成，進(jìn)而影響了生物素參與了脂肪酸的生物合成，進(jìn)而影響了磷脂的合成和細(xì)胞膜的形成。磷脂的合成和細(xì)胞膜的形成。 生物素是催化脂肪酸合成起始反應(yīng)的關(guān)鍵酶生物素是催化脂肪酸合成起始反應(yīng)的關(guān)鍵酶乙酰乙酰CoA羧化酶的輔酶羧化酶的輔酶，對(duì)脂肪酸的形成起促進(jìn)作用。，對(duì)脂肪酸的形成起促進(jìn)作用。選育生物素缺陷型菌株，阻斷生物素合成，亞適量選育生物素缺陷型菌株，阻斷

31、生物素合成，亞適量控制生物素添加，控制生物素添加，抑制不飽和脂肪酸的合成抑制不飽和脂肪酸的合成，使得，使得細(xì)胞膜不完整細(xì)胞膜不完整，提高了細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。，提高了細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。利用利用生物素過(guò)量的糖蜜原料生物素過(guò)量的糖蜜原料進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí)，進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵時(shí)，添添加加表面活性劑或飽和脂肪酸。表面活性劑或飽和脂肪酸。 在生物素過(guò)量的條件下，添加表面活性劑或飽和在生物素過(guò)量的條件下，添加表面活性劑或飽和脂肪酸仍能進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，其原因在于脂肪酸仍能進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，其原因在于這些物質(zhì)對(duì)這些物質(zhì)對(duì)生物素起拮抗作用生物素起拮抗作用，抑制不飽和脂肪酸的合成，導(dǎo)致，抑制不飽和脂肪酸的合成，

32、導(dǎo)致油酸合成量減少，磷脂合成不足，使得油酸合成量減少，磷脂合成不足，使得細(xì)胞膜不完整細(xì)胞膜不完整，提高了細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。常用的表面活性劑提高了細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。常用的表面活性劑有吐溫有吐溫-60、吐溫、吐溫-40等。常用的飽和脂肪酸有十七烷等。常用的飽和脂肪酸有十七烷酸、硬脂酸等。酸、硬脂酸等。利用利用油酸缺陷型菌株油酸缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，限制限制發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基油酸的濃度。油酸的濃度。 油酸缺陷型菌株喪失了自身合成油酸的能力，直接影油酸缺陷型菌株喪失了自身合成油酸的能力，直接影響磷脂的合成，響磷脂的合成，不能形成完整細(xì)胞膜不能形成完整細(xì)胞膜，必須添加油

33、酸才能，必須添加油酸才能生長(zhǎng)，所以通過(guò)控制油酸的添加量，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸生長(zhǎng)，所以通過(guò)控制油酸的添加量，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。的通透性。 當(dāng)當(dāng)油酸過(guò)量油酸過(guò)量時(shí)，該菌株只長(zhǎng)菌或產(chǎn)酸少；當(dāng)時(shí)，該菌株只長(zhǎng)菌或產(chǎn)酸少；當(dāng)油酸亞適油酸亞適量量時(shí)，隨著油酸的耗盡，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，使時(shí)，隨著油酸的耗盡，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能發(fā)生變化，使得谷氨酸的通透性提高。得谷氨酸的通透性提高。一種脂肪酸。一種脂肪酸。分子式分子式C18H34O2 甘油缺陷型菌株不能自身合成甘油缺陷型菌株不能自身合成-磷酸甘油和磷脂，外界供給甘油磷酸甘油和磷脂，外界供給甘油才能使其生長(zhǎng)，因此可以通過(guò)控才能使其生長(zhǎng)，因此可以通過(guò)

34、控制甘油添加量來(lái)控制細(xì)胞膜對(duì)谷制甘油添加量來(lái)控制細(xì)胞膜對(duì)谷氨酸的通透性。氨酸的通透性。 當(dāng)甘油添加量當(dāng)甘油添加量過(guò)多過(guò)多時(shí)，磷脂正時(shí)，磷脂正常合成，菌體正常生長(zhǎng)，不產(chǎn)酸常合成，菌體正常生長(zhǎng)，不產(chǎn)酸或產(chǎn)酸低；或產(chǎn)酸低； 當(dāng)甘油添加量當(dāng)甘油添加量過(guò)少過(guò)少時(shí)，菌體生時(shí)，菌體生長(zhǎng)不好，產(chǎn)酸低，所以控制甘油長(zhǎng)不好，產(chǎn)酸低，所以控制甘油亞適量是控制的關(guān)鍵。亞適量是控制的關(guān)鍵。利用利用甘油缺陷型菌株甘油缺陷型菌株進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，進(jìn)行谷氨酸發(fā)酵，限制限制發(fā)酵培養(yǎng)基甘油的濃度。發(fā)酵培養(yǎng)基甘油的濃度。 2控制細(xì)胞壁的形成控制細(xì)胞壁的形成細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)細(xì)胞壁的骨架結(jié)構(gòu)是肽聚糖。是肽聚糖。對(duì)細(xì)胞壁形成的控對(duì)細(xì)胞壁形

35、成的控制方法：添加青霉制方法：添加青霉素、頭孢霉素素、頭孢霉素C等等-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。 雙糖單位：雙糖單位：N-乙酰胞壁酸（乙酰胞壁酸（NAM）和）和N-乙乙酰葡萄糖胺（酰葡萄糖胺（NAG） 青霉素是糖肽末端結(jié)構(gòu)青霉素是糖肽末端結(jié)構(gòu)(DAlaDAla)的的類(lèi)似物類(lèi)似物，與轉(zhuǎn)肽酶的活性中心結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶受到了不可逆的與轉(zhuǎn)肽酶的活性中心結(jié)合，使轉(zhuǎn)肽酶受到了不可逆的抑制，糖肽合成不能完成，結(jié)果形成不完整的細(xì)胞壁抑制，糖肽合成不能完成，結(jié)果形成不完整的細(xì)胞壁，使細(xì)胞膜處于無(wú)保護(hù)狀態(tài)，易于破損，增大谷氨酸，使細(xì)胞膜處于無(wú)保護(hù)狀態(tài)，易于破損，增大谷氨酸的通透性。的通透性。 轉(zhuǎn)肽酶功能：在蛋

36、白質(zhì)生物合成過(guò)程中肽鍵的形成具有必須的作用。轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)肽酶功能：在蛋白質(zhì)生物合成過(guò)程中肽鍵的形成具有必須的作用。轉(zhuǎn)肽酶識(shí)別特異多肽肽酶識(shí)別特異多肽,催化不同的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。催化不同的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。 青霉素控制細(xì)胞壁形成的原因：青霉素控制細(xì)胞壁形成的原因：第二節(jié)第二節(jié) 谷氨酸產(chǎn)生菌的選育谷氨酸產(chǎn)生菌的選育主要是棒桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬和節(jié)桿菌屬主要是棒桿菌屬、短桿菌屬、小桿菌屬和節(jié)桿菌屬中的細(xì)菌。中的細(xì)菌。目前，我國(guó)企業(yè)使用的谷氨酸產(chǎn)生菌主要有：目前，我國(guó)企業(yè)使用的谷氨酸產(chǎn)生菌主要有：北京棒桿菌北京棒桿菌AS 1299；鈍齒棒桿菌鈍齒棒桿菌AS 1542；天津短桿菌天津短桿菌T6-13；它們的各種突變株。

37、它們的各種突變株。黃色短桿菌黃色短桿菌北京棒桿菌北京棒桿菌桿狀細(xì)菌 谷氨酸菌體的選育方法主要有五種，谷氨酸菌體的選育方法主要有五種，自然選育、自然選育、誘變選育、雜交選育、代謝控制選育和基因工程選誘變選育、雜交選育、代謝控制選育和基因工程選育。育。 一、自然選育一、自然選育以以基因自發(fā)突變基因自發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)。為基礎(chǔ)。有利于谷氨酸產(chǎn)生菌保持純系良種有利于谷氨酸產(chǎn)生菌保持純系良種，使谷氨酸生產(chǎn)，使谷氨酸生產(chǎn)具有相對(duì)穩(wěn)定性，提高發(fā)酵水平。具有相對(duì)穩(wěn)定性，提高發(fā)酵水平。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：菌體自身存在著修復(fù)機(jī)制和某些酶的校正作菌體自身存在著修復(fù)機(jī)制和某些酶的校正作用，使得自發(fā)突變率極低，導(dǎo)致選育耗時(shí)長(zhǎng)、工作用

38、，使得自發(fā)突變率極低，導(dǎo)致選育耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大、效率低。量大、效率低。也稱自然分離，是指對(duì)微生物細(xì)胞群體不經(jīng)過(guò)人工也稱自然分離，是指對(duì)微生物細(xì)胞群體不經(jīng)過(guò)人工處理而直接進(jìn)行篩選的育種方法。處理而直接進(jìn)行篩選的育種方法。 二、誘變選育二、誘變選育 物理因素物理因素：紫外線、：紫外線、60Co、X射線、射線、-射線、快中射線、快中子、子、-射線、射線、-射線、超聲波、射線、超聲波、He-Ne激光輻照、激光輻照、離子束等。離子束等?；瘜W(xué)因素：化學(xué)因素：氮芥、亞硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺氮芥、亞硝基胍、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亞硝基甲基脲、亞硝酸、酸乙酯、亞硝基甲基脲、亞硝酸、5-氟尿嘧啶、氟尿嘧啶

39、、5-溴尿嘧啶等。溴尿嘧啶等。其它因素其它因素：生物誘導(dǎo)因子，如噬菌體誘發(fā)抗性突變：生物誘導(dǎo)因子，如噬菌體誘發(fā)抗性突變等。等。 例：例：王歲樓；張一震；李志。谷氨酸高產(chǎn)菌王歲樓；張一震；李志。谷氨酸高產(chǎn)菌TZ-310TZ-310的誘變的誘變選育及其發(fā)酵的研究選育及其發(fā)酵的研究 。中國(guó)調(diào)味品中國(guó)調(diào)味品，19971997年年 0909期期 。 摘要：以天津短桿菌摘要：以天津短桿菌- -為出發(fā)菌株，經(jīng)為出發(fā)菌株，經(jīng)射線射線、紫外線紫外線和和硫酸二乙酯硫酸二乙酯復(fù)合誘變并經(jīng)高溫復(fù)合誘變并經(jīng)高溫馴化，獲得一株琥珀酸和生物素雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。馴化，獲得一株琥珀酸和生物素雙營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株。該菌株具有耐高

40、糖、耐高谷氨酸（）、不分解利該菌株具有耐高糖、耐高谷氨酸（）、不分解利用及耐高溫（用及耐高溫（）的優(yōu)點(diǎn)。）的優(yōu)點(diǎn)。原生質(zhì)體融合原生質(zhì)體融合就是將兩個(gè)親株的細(xì)胞壁分別通過(guò)酶解就是將兩個(gè)親株的細(xì)胞壁分別通過(guò)酶解作用加以剝除，制得原生質(zhì)體或原生質(zhì)球，在高滲條作用加以剝除，制得原生質(zhì)體或原生質(zhì)球，在高滲條件下混合，由聚乙二醇件下混合，由聚乙二醇(PEG)助融，促使原生質(zhì)體凝助融，促使原生質(zhì)體凝集、融合，兩個(gè)基因組之間接觸、交換、遺傳重組，集、融合，兩個(gè)基因組之間接觸、交換、遺傳重組，在再生細(xì)胞中獲得重組體。在再生細(xì)胞中獲得重組體。 三、雜交育種三、雜交育種雜交育種雜交育種常規(guī)雜交常規(guī)雜交原生質(zhì)體融合原

41、生質(zhì)體融合谷氨酸產(chǎn)生菌的前處理谷氨酸產(chǎn)生菌的前處理因?yàn)槠溆兄厥獾募?xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對(duì)溶菌酶一般不因?yàn)槠溆兄厥獾募?xì)胞壁結(jié)構(gòu)，對(duì)溶菌酶一般不敏感。敏感。方法：加入方法：加入EDTA（乙二胺四乙酸乙二胺四乙酸 ）、甘氨酸、青霉）、甘氨酸、青霉素和素和D-環(huán)絲氨酸等，這些物質(zhì)可以使細(xì)胞壁變得環(huán)絲氨酸等，這些物質(zhì)可以使細(xì)胞壁變得疏松，便于溶菌酶處理。疏松，便于溶菌酶處理。如，李蒲興等將如，李蒲興等將6株谷氨酸產(chǎn)生菌以株谷氨酸產(chǎn)生菌以甘氨酸、青霉素和溶菌酶的甘氨酸、青霉素和溶菌酶的不同組合不同組合處理處理，對(duì)其原生質(zhì)體形成進(jìn)行比較，對(duì)其原生質(zhì)體形成進(jìn)行比較，在最佳條件下，原生質(zhì)體在最佳條件下，原生質(zhì)體形成率

42、形成率可達(dá)可達(dá)95100。 張蓓等以谷氨酸產(chǎn)生菌天津短桿菌張蓓等以谷氨酸產(chǎn)生菌天津短桿菌T6-13為出發(fā)菌株，獲得了具有目的遺傳為出發(fā)菌株，獲得了具有目的遺傳標(biāo)記寡霉素抗性標(biāo)記寡霉素抗性(Orm)和氟乙酸抗性和氟乙酸抗性(FEAr)的突變株的突變株TN63和和TN115。然后。然后，分別以，分別以TN63和和TN115為親株，通過(guò)為親株，通過(guò)原生質(zhì)體融合，獲得了具有原生質(zhì)體融合，獲得了具有Orm +FEAr標(biāo)記的融合子標(biāo)記的融合子FTN9108，其原生質(zhì)體，其原生質(zhì)體融合頻率為融合頻率為2.610-3。OrmFEAr+OrmFEArOrmFEAr四、代謝控制選育四、代謝控制選育 以誘變育種為基

43、礎(chǔ)，獲得以誘變育種為基礎(chǔ)，獲得各種解除或繞過(guò)微生物正各種解除或繞過(guò)微生物正常代謝途徑的突變株，從常代謝途徑的突變株，從而人為地使有用產(chǎn)物選擇而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量生成積累。性地大量生成積累。 Glu產(chǎn)生菌產(chǎn)生菌誘變育種誘變育種突變株突變株代謝控制發(fā)酵代謝控制發(fā)酵大量積累大量積累Glu1.選育耐高糖、高谷氨酸的菌株選育耐高糖、高谷氨酸的菌株 如選育在含如選育在含2030葡萄糖的平板上生長(zhǎng)良好的葡萄糖的平板上生長(zhǎng)良好的耐高糖突變株；耐高糖突變株；在含在含15 20味精的平板上生長(zhǎng)良好的耐高谷氨味精的平板上生長(zhǎng)良好的耐高谷氨酸突變株；酸突變株；在在20的葡萄糖加的葡萄糖加15味精的平板上生長(zhǎng)

44、良好的耐味精的平板上生長(zhǎng)良好的耐高糖、耐高谷氨酸的菌株。高糖、耐高谷氨酸的菌株。2.選育能強(qiáng)化谷氨酸合成代謝、削弱或阻斷選育能強(qiáng)化谷氨酸合成代謝、削弱或阻斷支路代謝的菌株支路代謝的菌株（1）選育不分解利）選育不分解利用谷氨酸的突變株用谷氨酸的突變株 選育在以選育在以谷氨酸為谷氨酸為唯一碳源唯一碳源培養(yǎng)基上培養(yǎng)基上不長(zhǎng)或生長(zhǎng)微弱的不長(zhǎng)或生長(zhǎng)微弱的突變株突變株 。谷氨酸谷氨酸谷氨酰胺鳥(niǎo)氨酸瓜氨酸精氨酸（2）選育強(qiáng)化）選育強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)的突變株固定反應(yīng)的突變株 a.選育選育以琥珀酸或蘋(píng)果酸為唯一碳源，生長(zhǎng)良好以琥珀酸或蘋(píng)果酸為唯一碳源，生長(zhǎng)良好的的菌株。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)碳代謝必須走四碳二羧酸的脫羧菌株

45、。因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)碳代謝必須走四碳二羧酸的脫羧反應(yīng)，該反應(yīng)與反應(yīng)，該反應(yīng)與C02固定反應(yīng)是相同酶所催化，固定反應(yīng)是相同酶所催化，C02固定反應(yīng)相應(yīng)地加強(qiáng)。固定反應(yīng)相應(yīng)地加強(qiáng)。b.選育選育氟丙酮酸敏感氟丙酮酸敏感突變株。突變株。因?yàn)榉崾潜崦摎涿傅囊种苿?，即抑制因?yàn)榉崾潜崦摎涿傅囊种苿?，即抑制丙酮酸向乙酰丙酮酸向乙酰CoA轉(zhuǎn)化，相應(yīng)地轉(zhuǎn)化，相應(yīng)地CO2固定反應(yīng)加固定反應(yīng)加強(qiáng)。突變株對(duì)氟丙酮酸越敏感，效果越理想。強(qiáng)。突變株對(duì)氟丙酮酸越敏感，效果越理想。c.選育選育減弱乙醛酸循環(huán)減弱乙醛酸循環(huán)的突變株。的突變株。乙醛酸循環(huán)減弱不僅能使乙醛酸循環(huán)減弱不僅能使C02固定反應(yīng)比例增大，固定反應(yīng)

46、比例增大，而且異檸檬酸也能高效率地轉(zhuǎn)化為而且異檸檬酸也能高效率地轉(zhuǎn)化為-酮戊二酸，酮戊二酸，再生成谷氨酸。常見(jiàn)的該突變株有琥珀酸敏感型再生成谷氨酸。常見(jiàn)的該突變株有琥珀酸敏感型突變株和不分解利用乙酸的突變株。突變株和不分解利用乙酸的突變株。（3）選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的）選育解除谷氨酸對(duì)谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株突變株 有酮基丙二酸抗性突變株、谷氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性有酮基丙二酸抗性突變株、谷氨酸結(jié)構(gòu)類(lèi)似物抗性突變株和谷氨酰胺抗性突變株。突變株和谷氨酰胺抗性突變株。草酰乙酸草酰乙酸谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶天冬氨酸天冬氨酸+- -酮戊二酸酮戊二酸谷氨酸谷氨酸- -酮戊二酸酮戊二酸NH

47、3谷氨酸脫氫酶谷氨酸脫氫酶（4）選育強(qiáng)化能量代謝的突變株）選育強(qiáng)化能量代謝的突變株 原因：使原因：使TCA循環(huán)前一段代謝加強(qiáng)，谷氨酸合成速循環(huán)前一段代謝加強(qiáng)，谷氨酸合成速率加快。率加快。a.選育呼吸鏈抑制劑抗性突變株選育呼吸鏈抑制劑抗性突變株 如可選育丙二如可選育丙二酸、氧化丙二酸、氰化鉀、氰化鈉抗性突變株來(lái)酸、氧化丙二酸、氰化鉀、氰化鈉抗性突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)。實(shí)現(xiàn)。b.選育選育ADP磷酸化抑制劑抗性突變株磷酸化抑制劑抗性突變株 如可選育如可選育2,4-二硝基酚、羥胺、砷、胍等抗性突變株來(lái)實(shí)二硝基酚、羥胺、砷、胍等抗性突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)?，F(xiàn)。c.選育抑制能量代謝的抗生素的抗性突變株選育抑制能量代謝的抗生素

48、的抗性突變株 如如可選育纈氨霉素、寡霉素等抗性突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)?？蛇x育纈氨霉素、寡霉素等抗性突變株來(lái)實(shí)現(xiàn)。（5）其它遺傳標(biāo)記）其它遺傳標(biāo)記 選育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶類(lèi)似物、抗核苷酸選育莽草酸缺陷型、抗嘌呤嘧啶類(lèi)似物、抗核苷酸類(lèi)抗生素、異亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸類(lèi)抗生素、異亮氨酸缺陷、蛋氨酸缺陷、苯丙氨酸缺陷、缺陷、AEC抗性、抗性、AHV抗性、棕櫚酰谷氨酸等突抗性、棕櫚酰谷氨酸等突變株，都可以不同程度地提高谷氨酸產(chǎn)量。變株，都可以不同程度地提高谷氨酸產(chǎn)量。3.選育能提高谷氨酸通透性的菌株選育能提高谷氨酸通透性的菌株 （1）選育）選育生物素缺陷型生物素缺陷型菌株。菌株。（2）選育）選育油

49、酸缺陷型油酸缺陷型菌株。菌株。（3）選育）選育甘油缺陷型甘油缺陷型菌株。菌株。（4）選育）選育溫度敏感型溫度敏感型突變株突變株 突變位置發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的突變位置發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細(xì)胞膜細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的基因結(jié)構(gòu)的基因上，發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，一個(gè)堿基為另一上，發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換，一個(gè)堿基為另一個(gè)堿基所置換，這樣為基因所控制的酶在高溫下失活，導(dǎo)個(gè)堿基所置換，這樣為基因所控制的酶在高溫下失活，導(dǎo)致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變。致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變。 另一個(gè)特點(diǎn)是在生物素豐富的培養(yǎng)基上也能分泌出谷氨另一個(gè)特點(diǎn)是在生物素豐富的培養(yǎng)基上也能分泌出谷氨酸。酸。 (5)其它突變型菌株

50、其它突變型菌株抗藥性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙抗藥性、溶菌酶敏感型、二氨基庚二酸缺陷型、乙酸缺陷型、棕櫚酰谷氨酸敏感型突變株等，都能酸缺陷型、棕櫚酰谷氨酸敏感型突變株等，都能增增強(qiáng)谷氨酸的通透性強(qiáng)谷氨酸的通透性。 五、基因工程選育五、基因工程選育 基因工程育種是指利用基因工程方法對(duì)產(chǎn)生菌株進(jìn)基因工程育種是指利用基因工程方法對(duì)產(chǎn)生菌株進(jìn)行改造而獲得高產(chǎn)工程菌，或者是通過(guò)微生物間的行改造而獲得高產(chǎn)工程菌，或者是通過(guò)微生物間的轉(zhuǎn)基因而獲得新菌種的育種方法。轉(zhuǎn)基因而獲得新菌種的育種方法。 載體系統(tǒng)載體系統(tǒng) ：一般以質(zhì)粒、噬菌體或轉(zhuǎn)座子作為載體，尤以質(zhì)粒：一般以質(zhì)粒、噬菌體或轉(zhuǎn)座子作為載體，尤以質(zhì)粒為多。為多。 受體系統(tǒng)受體系統(tǒng) ：受體菌選用短桿菌屬和棒桿菌屬的野生菌或變異株。：受體菌選用短桿菌屬和棒桿菌屬的野生菌或變異株。 供體菌株供體菌株：供