引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析GFP融合蛋白引物設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)基本原則引物

1、引物設(shè)計(jì)實(shí)例分析(GFP(GFP融合蛋白引物設(shè)計(jì)) )引物設(shè)計(jì)基本原則弓I I物長(zhǎng)度(primerlength)primerlength)產(chǎn)物長(zhǎng)度(productlength)productlength)序歹！JTmJTm值(meltingtemperature)(meltingtemperature)G+CG+C含量(composition(composition引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)(duplexformationandhairpin)duplexformationandhairpin)閱讀框1 1 . .引物的長(zhǎng)度一般為15-30bp,15-30bp,常用白是18-27bp,18-27bp

2、,但不能大于38,38,因?yàn)檫^(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74C,74C,即TaqTaq酶的最適溫度2 2 . .產(chǎn)物的長(zhǎng)度擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為100600100600堿基對(duì)。3 3 .Tm.Tm值引物的TmTm值一般才5 5制在55-6055-60度，盡可能保證上下游引物的TmTm值一致，一般不超過(guò)2 2度。如果引物中的G+CG+C含量相對(duì)偏低，則可以使引物長(zhǎng)度稍長(zhǎng)，而保證一定的退火溫度。Tm=2(A+T)Tm=2(A+T)+4+4(C+G)(C+G)4 4 . .引物的GCGC含量有效引物中(G+C)(G+C)的比例為40-60%,40-60%,過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物的GCGC含量不能

3、相差太大。5 5 . .引物自身引物間3 3端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCRPCR反應(yīng)失敗任務(wù)用綠色熒光蛋白（GFPGFP）標(biāo)記蛋白NR1NR1pcDNA3.1ionSU55762ionSU55762458458I IDralll(ie?4iBamHI(GGATCC)pct)NA3.1NRl的編碼序列(4000bp)121ggggctcctagagaacccgggggcgcttgaccgcgcgcgggcggcccgcggg+cgtacat181cgcgaggtcgtcgcactcgcgcaacccagagccaggcccgc+gtgcccggagctcatgag241caccatg

4、cacctgctgacattcgccctgctttt+tcctgctcc+tcgcccgcgcggatcc301cgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgcaagca+gaacagatgtt361ccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgc421cacttc+gtcacccacaagcccaacgccatacaga+ggccctg+cag+gtg+gaggacct481catctctagccaggtctacgctatcctagttagccacccgcctactcccaacgac

5、cactt541cactcccacccctgtctcctacacagctggct+ctacagcatccctgtcctgggactgac601tacccgaa+gtccatctactctgacaagagtatccacctgagtttccttcgcacggtgcc661gccctactcccaccag+ccagcgtctggtttgagatgatgcgagtctacaactggaacca721catcatcctgctggtcagcgacgaccacgagggacgggcagcgcagaagcgcttggagac781gttgctggaggaacgggagtccaaggcagagaaggtgctg

6、cagtttgacccaggaaccaa紅色為信號(hào)肽,藍(lán)色為 BamHJ 夠切位點(diǎn),下劃線標(biāo)出蒲切位點(diǎn)的閱讀框GFP序歹U(700bp)ATG&TGAGCAA&ATG&TGAGCAA&GGC&AGGAGCGGC&AGGAGCTSTTCACC6GTSTTCACC6G6&TGGT&CCC6&TGGT&CCCATCCTGATCCTGGTC6GTC6A&CVGGACGGC6AC&TAAACGGCCACAAGTA&CVGGACGGC6AC&TAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCTC

7、AGCGTGTCC&CC&C6AG&C6A&GeC&AT&CCACCTACGGCAA&CT&ACCCT6AA&TTCATC6AG&C6A&GeC&AT&CCACCTACGGCAA&CT&ACCCT6AA&TTCATCTQCACCACTQCACCACCGSCAAGCTGCCCGT&CCCTCGSCAAGCTGCCCGT&CCCTGGCCCACCCTCGT&ACCACCGGCCCACCCTCGT&ACCACCTTCGGCTACGTTCGGC

8、TACGGCCTGCAGTGGCCTGCAGTGCTTC&CCCGCTACCCCGACCACTGAAGCTTC&CCCGCTACCCCGACCACTGAAGCAGCACGACTTCCAGCACGACTTCTTCAAfiTCCGTTCAAfiTCCGCCAT&CCCGAAG&GVACGTCCAG&ACCAT&CCCGAAG&GVACGTCCAG&A&CGCA&CGCACCATCTTCTTCCATCTTCTTCAAe&AC6AC6GCAACVACAAQACCC&CGCCQACAAe&AC6AC6

9、GCAACVACAAQACCC&CGCCQAGGT&AA&TTCGAG&GC&ACACCCTG&TGGT&AA&TTCGAG&GC&ACACCCTG&TGAACCGCTC6A&CT6AA&GGCATCGACTTCAAG&AGGACG&CAACATGAACCGCTC6A&CT6AA&GGCATCGACTTCAAG&AGGACG&CAACATCCTGGG&CACAAGCT&GA6TACAACTACAACAGCCACAAC&V

10、CCTGGG&CACAAGCT&GA6TACAACTACAACAGCCACAAC&VCTATACTATATCAT6TCAT66CCGACAAGCAGAA&AACG&6CCGACAAGCAGAA&AACG&CATCAAGGTSCATCAAGGTSAACTTCAA6ATCAACTTCAA6ATCCGCCACAACATC&AGeACCGCCACAACATC&AGeACG8A8GT8G8A8GT8AGCTC&CC6ACCACTACCA&CA6AACACCCAGCTC&CC6ACCACTACCA&CA

11、6AACACCCCCATCGGCGCCATCGGCGA ACGGCCCCGTTGCTGCT&CCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCCGGCCCCGTTGCTGCT&CCTACCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATTCACATGGTTCCTAACGAGAAGCGCGATTCACATGGTTCCTSCTSGASTTCSCTSGASTTC6TGACCGCC6TGACCGCC6CCG6GATCAC6CCG6GATCACTCTCS6CATSTCTCS6CATSGAC6AGCT6TGAC6AGCT6TACAA&TAAACA

12、A&TAA引物要求PCRPCR擴(kuò)增GFPGFPGFPGFP兩邊添加BamHIBamHI酶切位點(diǎn)保證NR1NR1的閱讀框不改變第一步：擴(kuò)增GFPGFP基本序列GFP字刊5TC-CQSCTGGACGAGC-G-ACAAG31變性.引物復(fù)t5hA ATG&T&A&CAA&G&CGAGA&CTCTCQGCAT&AC&ATG&T&A&CAA&G&CGAGA&CTCTCQGCAT&AC&AGCTGTACAA&TAX31A6AGCC&TACCTGCTCGAC

13、A7&TTCA,TTA6AGCC&TACCTGCTCGACA7&TTCA,TT5rPrimtnZFrimtrl：5T8Tg皿 XI1TACCACrCGTTCCC&CTCCTC&TACCACrCGTTCCC&CTCCTC&i：&TAeCTGCTCfiACAT6TTCATT5TTATTACTTGTCTTGTACAGCTCGTCCAT&CC&AGAACAGCTCGTCCAT&CC&AGA點(diǎn)的函CTTGTACA&CTCTCCATGCC&AGACTTGTACA&CTCTCCATGCC&

14、amp;AGA第二步：GCGC比值；TmTm值Primrl:5ATGGT&AGCAAG&GCGAGGA.Primer2：5,CTTGTACASCTCGTCCATT&CC&AGAPritnerl：5-ATGST&ACAAG&C&AGSA(6C：60%,Trn=64)Primr2*5CTT&TACA&CTCGTCCATGCC(GC：57%,Trtt66)第三步：酶切位點(diǎn)BamHI:99GtecBamHI:99GtecPrimerl:5Primerl:5ATGGT6AGCAAGGGC&AG&AATGGT6AGCA

15、AGGGC&AG&A(GC:60%,Tm(GC:60%,Tm：64)64)PrimerZi5PrimerZi5CVTffVACAGCTCGTCCAGCCCVTffVACAGCTCGTCCAGCCGC:GC:57%,57%,TmTm：66)66)IPrimeri:5,Primeri:5,S SgQtccATGGTGAGCAAG&6CGA&GAgQtccATGGTGAGCAAG&6CGA&GAPrimerl5AT&GT&A&CAAG&C&A&GAGCAT&GT&A&CAAG&am

16、p;C&A&GAGCPriE*rZPriE*rZ：5,5,Primerl：$Primei-2!5Primei-2!5Primer2:5Primer2:5T TggatccCTTfiTggatccCTTfiTACA&CTACA&CTCSTCCATGCCCSTCCATGCC第四步：閱讀框庫(kù)的時(shí)候也會(huì)在不知道模板序列的情況下進(jìn)行設(shè)計(jì)這個(gè)時(shí)候隨機(jī)核NR1序atgagcaccGtgcacctgctgacattcgccctgctttt+tcctgctccttegcccgcgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcgcggtgctgagcacgcgca

17、agcatgaacagatgttccgcgaggcagtaaaccaggccaataagcgacacggctcttggaagatacagctcaacgccacttctg+cacccacaagcccaacgccatacagatggccctgtcagtgtgtgaggacctPrimeri:5gggtcc4TGGTGAGCAAGGGCGAGGAIPrimeri;5599atccTAT6GT6AGCAAGGGCGAGGAotgagcaccatgcacctgc+gacattcgccctgc+tttttcctgctccttcgccc9cgcggatcccgaccccaagatcgtcaacatcggcg

18、cggtgctgagcacgcgeacgcatgaacagatgttccgcgaggcagtacaccaggccaataagcgacacggctcttggaaga+ocagc+caacgccac+ctg+cacccacaagcccaacgccatacaga+ggccctgtcagtgtg+gcggacctGFP序列5 5ATG6TGATG6TGA AAGG&CGA&GA&CTCTCeGCATG&ACeAGCTGTACAAGTAGTA AA3 3插入GFPGFP后的組合序cgcgcggetccTATG9T6AGCAA&GGC6A&6A&：.

19、TCTC66CAT&AC6AGCT&TACAA&?ggatcccgaccccaagatcg+caacatcggcgcggtgc+gcgcacgcgcaagcatgaacaga+gt+ccgcgaggcagtaaaccaggccaa+aagcgacacggctcttggaaga+acagctcaacgccacttc+g+cacccacaagcccaacgccatacagctggccctgtcagtgtgtgaggocct第五步保護(hù)序列Primeri:5GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5GCGCggatccPrimeri:5GC

20、GGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAPrimer2:5GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCCctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC記得當(dāng)初寫本科論文，感到不知道討論什么問(wèn)題好。愣是寫了一大段的PCPCR R條件摸索的討論。后來(lái)PCRPCR成為實(shí)驗(yàn)最基本的一步了，但是發(fā)現(xiàn)在PCRPCR中還是有許多需要注意的地方。PCRPCR的第一步就是引物設(shè)計(jì)了。引物設(shè)計(jì)需要注意的地方很多，在大多數(shù)情況下，我們都是在知道已知模板序列時(shí)進(jìn)行PCRPCR擴(kuò)增的。在某些情況比如構(gòu)建文甘酸序列就與模板不是完全匹配。 我們通常指的設(shè)計(jì)引物都是在已知模板序列的情況下

21、進(jìn)行。設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡：擴(kuò)增特異性和擴(kuò)增效率。引物分析軟件將試圖通過(guò)使用每一引物設(shè)計(jì)變化的預(yù)定值在這兩個(gè)目標(biāo)間取得平衡。設(shè)計(jì)引用有一些需要注意的基本原理：引物長(zhǎng)度一般引物長(zhǎng)度為18183030堿基。 總的說(shuō)來(lái)， 決定引物退火溫度(Tm(Tm值)最重要的因素就是引物的長(zhǎng)度。有以下公式可以用于粗略計(jì)算引物的退火溫度。在引物長(zhǎng)度小于20bp20bp時(shí)：4(G+C)+2(A+T)-5C4(G+C)+2(A+T)-5C在引物長(zhǎng)度大于20bp20bp時(shí)：62.3C+0.41C(%G-C)-500/length-5c62.3C+0.41C(%G-C)-500/length-5c另外有許多軟件

22、也可以對(duì)退火溫度進(jìn)行計(jì)算，其計(jì)算原理會(huì)各有不同，因此有時(shí)計(jì)算出的數(shù)值可能會(huì)有少量差距。為了優(yōu)化PCRPCR反應(yīng),使用確保退火溫度不低于5454C C的最短的引物可獲得最好的效率和特異性?？偟恼f(shuō)來(lái)，每增加一個(gè)核甘酸引物特異性提高4 4倍，這樣，大多數(shù)應(yīng)用的最短引物長(zhǎng)度為1818個(gè)核甘酸。引物長(zhǎng)度的上限并不很重要，主要與反應(yīng)效率有關(guān)。由于嫡的原因，引物越長(zhǎng)，它退火結(jié)合到靶DNADNA上形成供DNADNA聚合酶結(jié)合的穩(wěn)定雙鏈模板的速率越小。GCGC含量一般引物序列中G+G+C C含量一般為40%60%,40%60%,一對(duì)引物的G GC C含量和T Tm m值應(yīng)該協(xié)調(diào)。若是引物存在嚴(yán)重的GCGC傾向或

23、ATAT傾向則可以在引物55端加適量的A A、T T或G G、C C尾巴。退火溫度退火溫度需要比解鏈溫度低5C,5C,如果引物堿基數(shù)較少， 可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使PCRPCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，是DNADNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度相差4c4c6c6c不會(huì)影響PCRPCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的，可以在55C55C75c75c間變化。避免擴(kuò)增模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域選擇擴(kuò)增片段時(shí)最好避開(kāi)模板的二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。用有關(guān)計(jì)算機(jī)軟件可以預(yù)測(cè)估計(jì)目的片段的穩(wěn)定二級(jí)結(jié)構(gòu)，有助于選擇模板。實(shí)驗(yàn)表明，待擴(kuò)區(qū)域自由能（G G）小于58.6lkJ/

24、mol58.6lkJ/mol時(shí)，擴(kuò)增往往不能成功。若不能避開(kāi)這一區(qū)域時(shí)，用7-deaza2-7-deaza2-脫氧GTPGTP取代dGTPdGTP對(duì)擴(kuò)增的成功是有幫助的。與靶DNADNA的錯(cuò)配當(dāng)被擴(kuò)增的靶DNADNA序列較大的時(shí)候，一個(gè)引物就有可能與靶DNADNA的多個(gè)地方結(jié)合，造成結(jié)果中有多個(gè)條帶出現(xiàn)。這個(gè)時(shí)候有必要先使用BLASTBLAST軟件進(jìn)行檢測(cè)，網(wǎng)址：/BLAST//BLAST/o o選擇AligntwosequencesAligntwosequences(bl2seq),(bl

25、2seq),如下圖。加世 IJ|前 jp:ncbLnli.nlh,口7/BLASTBLAST的使用方法也十分簡(jiǎn)單，如下圖所示 TheTheSequSequ nceSinceSimilnnlyScomilnnlyScornrn5cftwarn5cftwarn*Download!*Download!DevalopsrhDevalopsrhfofoOtherresoOtherresourcaiurcaiReferencesReferencesNCBINCBICcnbibutorCcnbibutori iMaimghrtMaimghrtContactu(Contactu(TJ!：-I1,jit.：Jj

26、rJL.sLw屈mlTrftntlMedr*/7，附寸m.cve，.：/時(shí)/，二(fctKbi.Qjnm.4nAiivdMetarUse.BLASTStrandoption 拙“MMISengapE_：andextensiongapBpenaltiesgapx,_dixpoff歷=班三工回%wordsize.-Fi_!P火巴口I,；,JCDCEnteraccessionorGII IordownloadfromfileII IrsequenceinPASTAformatfr-r.b:：3-d3L4I-LEnteraccessionorGlordownloadfile.一.川%JQTsequen

27、ceinPASTAformat:：?丁3 3I1d將引物序列粘貼到1 1區(qū)，將靶DNADNA序列粘貼到2 2區(qū)，這兩者可以互換的，并且BLASTBLAST會(huì)計(jì)算互補(bǔ)、反義鏈等多種可能，所以不需要用戶注意兩條鏈?zhǔn)欠穸际怯辛x鏈。如果知道序列在數(shù)據(jù)庫(kù)中的GIGI號(hào)也可以直接輸入GIGI號(hào)，這樣就不用粘貼一大段的序列了。最后在3 3處點(diǎn)擊AlignAlign就可以查看引物在靶DNADNA中是否有多個(gè)同源位點(diǎn)了。可是使用BLASTBLAST還是有其不方便的地方。因?yàn)樗淮沃荒鼙容^兩條序列，那么一對(duì)引物就需要分開(kāi)進(jìn)行比對(duì)。如果存在錯(cuò)配，還需要自己計(jì)算由于錯(cuò)配形成的片段長(zhǎng)度有多大。在下一篇中將介紹一個(gè)軟件，

28、可以直接將靶DNADNA和引物輸入對(duì)產(chǎn)物片段進(jìn)行預(yù)測(cè)。引物末端引物33端是延伸開(kāi)始的地方，因此要防止錯(cuò)配就從這里開(kāi)始。33端不應(yīng)超過(guò)3 3個(gè)連續(xù)的G G或C,C,因這樣會(huì)使引物在G+CG+C富集序列區(qū)錯(cuò)誤引發(fā)。3 3端也不能有形成任何二級(jí)結(jié)構(gòu)可能，除在特殊的PCRPCR(AS-PCR)(AS-PCR)反應(yīng)中，引物3 3端不能發(fā)生錯(cuò)配。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物33端不要終止于密碼子的第3 3位，因密碼子的第3 3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾狀結(jié)構(gòu)，這種二級(jí)結(jié)構(gòu)會(huì)因空間位阻而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。若用人工判斷，引物自身連續(xù)互

29、補(bǔ)堿基不能大于3bp3bp。兩引物之間不應(yīng)該存在互補(bǔ)性，尤應(yīng)避免3 3端的互補(bǔ)重疊以防引物二聚體的形成。一般情況下，一對(duì)引物間不應(yīng)多于4 4個(gè)連續(xù)堿基的同源性或互補(bǔ)性。為了下一步操作而產(chǎn)生的不完全匹配5 5端對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大，因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物55端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNADNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。額外的堿基或多或少會(huì)影響擴(kuò)增的效率，還加大引物二聚體形成的幾率，但是為了下一步的操作就要作出適當(dāng)?shù)摹盃奚薄：芏鄷r(shí)候PCRPCR只是初步克隆，之后我們還需要將目的片段亞

30、克隆到各種載體上， 那么就需要在PCPCR R這個(gè)步驟為下一步的操作設(shè)計(jì)額外的堿基。以下總結(jié)一些為了亞克隆所要設(shè)計(jì)的序列。a a添加限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)添加酶切位點(diǎn)是將PCRPCR產(chǎn)物進(jìn)行亞克隆使用得最多的手段。一般酶切位點(diǎn)是六個(gè)堿基，另外在酶切位點(diǎn)的55端還需要加2 23 3個(gè)保護(hù)堿基。但是不同的酶需要的保護(hù)堿基數(shù)目是不相同的，例如：SallSall不需要保護(hù)堿基，EcoRVEcoRV需要1 1個(gè)，NotlNotl需要2 2個(gè)，HindHind田3 3個(gè)。其中，在原核表達(dá)設(shè)計(jì)引物時(shí)還有一些小技巧，大家可以參考：原核表達(dá)之實(shí)驗(yàn)前的分析。里面一些規(guī)則是所有表達(dá)都通用的。有一種做法是在進(jìn)行PCRPCR反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行酶切，這樣就需要注意一些內(nèi)切酶在PCRPCR反應(yīng)中的酶切反應(yīng)率，見(jiàn)附錄。不過(guò)這種方法雖然方便但并不推薦。有時(shí)候，就是把PCRPCR產(chǎn)物回收后酶切再與載體連接效果都不盡理想，同步進(jìn)行會(huì)使出現(xiàn)問(wèn)題的原因變得更加復(fù)雜。一旦出