實(shí)驗(yàn)七 大腸桿菌檢測(cè)

1、實(shí)驗(yàn)七實(shí)驗(yàn)七 大腸菌群的測(cè)定大腸菌群的測(cè)定一一 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膎1、掌握大腸桿菌的鑒定和計(jì)數(shù)、掌握大腸桿菌的鑒定和計(jì)數(shù)方法方法n2、 鞏固無(wú)菌操作技術(shù)鞏固無(wú)菌操作技術(shù)二二 大腸桿菌鑒定原理大腸桿菌鑒定原理n大腸菌群：一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需大腸菌群：一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌。該菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污菌主要來(lái)源于人畜糞便，故以此作為糞便污染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中染指標(biāo)來(lái)評(píng)價(jià)食品的衛(wèi)生質(zhì)量，推斷食品中有否染腸道致病菌的可能。有否染腸道致病菌的可能。n 樣品中大腸菌群系以樣品中大腸菌群系以

2、100mL100mL（g g）檢樣內(nèi)大）檢樣內(nèi)大腸菌群最大可能數(shù)（腸菌群最大可能數(shù)（MPN)MPN)表示。表示。 細(xì)細(xì) 菌菌 學(xué)學(xué) 檢檢 驗(yàn)驗(yàn) 程程 序序 樣品樣品 細(xì)菌總數(shù)細(xì)菌總數(shù) 大腸菌群大腸菌群 水樣稀釋或不稀釋水樣稀釋或不稀釋 水樣稀釋或不稀釋水樣稀釋或不稀釋 第一步第一步- 初步發(fā)酵試驗(yàn)初步發(fā)酵試驗(yàn) 傾注平板培養(yǎng)傾注平板培養(yǎng) （乳糖發(fā)酵）（乳糖發(fā)酵） 37 24小時(shí)小時(shí) 37 24小時(shí)小時(shí) 菌落計(jì)數(shù)菌落計(jì)數(shù) 第二步第二步- 平板分離培養(yǎng)平板分離培養(yǎng)（取平均數(shù)報(bào)告）（取平均數(shù)報(bào)告） （轉(zhuǎn)種鑒別培養(yǎng)基）（轉(zhuǎn)種鑒別培養(yǎng)基） 37 24小時(shí)小時(shí) 革蘭染色鏡檢革蘭染色鏡檢 第三步第三步- 乳糖

3、復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)乳糖復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 報(bào)告結(jié)果報(bào)告結(jié)果 三、實(shí)驗(yàn)器材三、實(shí)驗(yàn)器材 1 1、恒溫培養(yǎng)箱（、恒溫培養(yǎng)箱（36361 1 ）、高壓滅菌）、高壓滅菌鍋鍋 、天平、滅菌培養(yǎng)皿、試管。、天平、滅菌培養(yǎng)皿、試管。 2 2、培養(yǎng)基及試劑：、培養(yǎng)基及試劑：n 乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊脂平板乳糖膽鹽發(fā)酵管、伊紅美藍(lán)瓊脂平板（EMBEMB）四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟大腸菌群的檢測(cè)大腸菌群的檢測(cè) 檢品檢品 膽鹽乳糖發(fā)酵管膽鹽乳糖發(fā)酵管 伊紅美蘭平板伊紅美蘭平板 大腸桿菌菌落純培養(yǎng)大腸桿菌菌落純培養(yǎng) 乳糖復(fù)發(fā)酵管（乳糖復(fù)發(fā)酵管（-） 乳糖復(fù)發(fā)酵管（乳糖復(fù)發(fā)酵管（） n1、檢樣稀釋、檢樣稀釋n以無(wú)菌操作將檢樣以無(wú)菌操

4、作將檢樣1mL1mL放于含有放于含有9mL9mL滅菌生理鹽水或滅菌生理鹽水或其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成其他稀釋液的滅菌玻璃瓶?jī)?nèi)，經(jīng)充分振搖或研磨做成1 1：1010的均勻稀釋液。的均勻稀釋液。n用用1ml1ml滅菌吸管吸取滅菌吸管吸取1 1：1010稀釋液稀釋液1mL1mL，注入含有，注入含有9mL9mL生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做生理鹽水或其他稀釋液的試管內(nèi)，振搖試管混勻，做成成1 1：100100的稀釋液。的稀釋液。n另取另取1ml1ml滅菌吸管，按上述操作依次作滅菌吸管，按上述操作依次作1010倍遞增稀倍遞增稀釋液。釋液。n根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣

5、品污染情況估計(jì)，選根據(jù)食品衛(wèi)生要求或?qū)z驗(yàn)樣品污染情況估計(jì)，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度，接種擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度，接種3 3管，每支試管接管，每支試管接種種1ml1ml。n2. 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)乳糖發(fā)酵試驗(yàn)n 將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內(nèi)，接種量在1mL1mL以上者，用以上者，用雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管雙料乳糖膽鹽發(fā)酵管；1mL1mL及及1mL1mL以以下者，用下者，用單料乳糖發(fā)酵管單料乳糖發(fā)酵管。每一個(gè)稀釋度接種。每一個(gè)稀釋度接種3 3管，管，置置363611溫箱內(nèi)，培養(yǎng)溫箱內(nèi)，培養(yǎng)24h24h2h2h，如所有乳糖，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)

6、告為大腸菌群陰性，膽鹽發(fā)酵管都不產(chǎn)氣，則可報(bào)告為大腸菌群陰性，如有產(chǎn)生者，則按下列程續(xù)進(jìn)行。如有產(chǎn)生者，則按下列程續(xù)進(jìn)行。3.3.分離培養(yǎng)分離培養(yǎng)n 將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置將產(chǎn)氣的發(fā)酵管分別轉(zhuǎn)種在伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置363611溫箱內(nèi)，培養(yǎng)溫箱內(nèi)，培養(yǎng)18h18h24h24h，然后取出，觀察菌，然后取出，觀察菌落形態(tài)并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。落形態(tài)并做革蘭氏染色和證實(shí)試驗(yàn)。4.4.證實(shí)試驗(yàn)證實(shí)試驗(yàn)n在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1 12 2個(gè)進(jìn)行革蘭個(gè)進(jìn)行革蘭氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置氏染色，同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管，置363611

7、的溫箱內(nèi)的溫箱內(nèi)培養(yǎng)培養(yǎng)24h24h2h2h，觀察產(chǎn)氣情況。，觀察產(chǎn)氣情況。n凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性無(wú)芽胞桿菌，即報(bào)告凡乳糖管產(chǎn)氣、革蘭氏染色為陰性無(wú)芽胞桿菌，即報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性。為大腸菌群陽(yáng)性。5.5.報(bào)告報(bào)告n根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查根據(jù)證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的管數(shù)，查MPNMPN檢索表，報(bào)告檢索表，報(bào)告每每100mL100mL（g g）食品中大腸菌群的）食品中大腸菌群的MPNMPN 值。表1 大腸菌群最可能數(shù)（MPN）檢索表 陽(yáng)性管數(shù) MPN 100mL(g） 95%可信限 1mL(g)3 0.1mL(g) 3 0.01mL(g) 3 下限 上限 0 0 0 0 0 0 0

8、 0 0 1 2 3 30 30 60 90 5 90 0 0 0 0 1 1 1 1 0 1 2 3 30 60 90 120 5 130 0 0 0 0 2 2 2 2 0 1 2 3 60 90 120 160 0 0 0 0 3 3 3 3 0 1 2 3 90 130 160 190 1 1 1 1 0 0 0 0 0 1 2 3 40 70 110 150 5 10 200 210 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 70 110 150 190 10 30 230 360 1 1 1 1 2 2 2 2 0 1 2 3 110 150 200 240 30 360 1

9、 1 1 1 3 3 3 3 0 1 2 3 160 200 240 290 2 2 2 200000123901402002601030360370 2 2 2 2111101231502002703403070440890 2 2 2 222220123210280350420401004701500222233330123290360440530333300000123230390640950407015012001300380033331111012343075012001600701403002100230038003333222201239301500210029001503003

10、503800440047003333333301232400460011000240003607101500130002400048000大腸菌群測(cè)定大腸菌群測(cè)定 挑選菌落特征：黑紫色、有光澤或無(wú)光澤菌落；挑選菌落特征：黑紫色、有光澤或無(wú)光澤菌落； 紅色、粉紅色菌落。紅色、粉紅色菌落。抑制劑：膽鹽、煌綠、十二烷基硫酸鈉。抑制劑：膽鹽、煌綠、十二烷基硫酸鈉。 產(chǎn)酸判斷：紫色培養(yǎng)液變成黃色產(chǎn)酸判斷：紫色培養(yǎng)液變成黃色產(chǎn)氣判斷：發(fā)酵導(dǎo)管內(nèi)有小氣泡，如輕輕打動(dòng)試產(chǎn)氣判斷：發(fā)酵導(dǎo)管內(nèi)有小氣泡，如輕輕打動(dòng)試管有氣泡沿管壁上浮，應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，管有氣泡沿管壁上浮，應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，需進(jìn)一步試驗(yàn)。需

11、進(jìn)一步試驗(yàn)。 飲用飲用水、乳、冷飲食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌指標(biāo)水、乳、冷飲食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)菌指標(biāo) 指指 標(biāo)標(biāo) 細(xì)菌總數(shù)細(xì)菌總數(shù) 大腸菌群大腸菌群 飲用飲用水水 100個(gè)個(gè)/ml 3個(gè)個(gè)/L 消毒牛奶消毒牛奶 30，000個(gè)個(gè)/ml 40個(gè)個(gè)/100ml 瓶裝汽水、果味水瓶裝汽水、果味水 及果汁類飲料及果汁類飲料 品品 種種 100個(gè)個(gè)/ml 5個(gè)個(gè)/100ml五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告五、實(shí)驗(yàn)報(bào)告（一）、列表記錄并計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果（一）、列表記錄并計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果（二）、思考題（二）、思考題1 1、怎樣判斷分離到的微生物是大腸桿菌？、怎樣判斷分離到的微生物是大腸桿菌？2 2、接種了微生物的培養(yǎng)皿為什么要倒置、接種了微生物的培養(yǎng)皿為什么要倒置培養(yǎng)？培養(yǎng)？實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備（2個(gè)樣品個(gè)樣品/組）組）n培養(yǎng)皿培養(yǎng)皿：1010套套/ /組組n無(wú)菌水：無(wú)菌水：1