聚醚類抗生素鹽霉素的高效毛細(xì)管電泳電導(dǎo)分離檢測

1、聚醚類抗生素鹽霉素的高效毛細(xì)管聚醚類抗生素鹽霉素的高效毛細(xì)管電泳電泳電導(dǎo)分離檢測電導(dǎo)分離檢測答辯人：羅潔答辯人：羅潔指導(dǎo)老師：謝天堯指導(dǎo)老師：謝天堯 鹽霉素（鹽霉素（salinomycinsalinomycin）又名沙利霉素、球蟲粉、優(yōu)素，屬）又名沙利霉素、球蟲粉、優(yōu)素，屬于聚醚類抗生素。在實(shí)際應(yīng)用中，常用其鈉鹽，即鹽霉素鈉，于聚醚類抗生素。在實(shí)際應(yīng)用中，常用其鈉鹽，即鹽霉素鈉，分子式為分子式為C C4242H H6969O O1111Na,Na,分子量為分子量為772.99772.99。結(jié)構(gòu)式比較復(fù)雜，可。結(jié)構(gòu)式比較復(fù)雜，可示意為：示意為：色態(tài)：白色或淺棕色無定形粉末，無味色態(tài)：白色或淺棕色

2、無定形粉末，無味溶解性：溶解性：微溶于水，易溶于低級(jí)醇、乙醚等有機(jī)溶劑微溶于水，易溶于低級(jí)醇、乙醚等有機(jī)溶劑穩(wěn)定性：在中性或堿性環(huán)境中穩(wěn)定，在高溫穩(wěn)定性：在中性或堿性環(huán)境中穩(wěn)定，在高溫120120時(shí)不失活，時(shí)不失活，在酸性介質(zhì)中不穩(wěn)定。在酸性介質(zhì)中不穩(wěn)定。 應(yīng)用現(xiàn)狀：應(yīng)用現(xiàn)狀： 國內(nèi)外廣泛用來防治牛、羊、雞、兔的球蟲??；同時(shí)可國內(nèi)外廣泛用來防治牛、羊、雞、兔的球蟲?。煌瑫r(shí)可作為飼料添加劑使用，促進(jìn)畜禽生長發(fā)育和提高飼料利用率。作為飼料添加劑使用，促進(jìn)畜禽生長發(fā)育和提高飼料利用率。但是聚醚類抗生素使用劑量的安全范圍較窄，鹽霉素對(duì)肉雞但是聚醚類抗生素使用劑量的安全范圍較窄，鹽霉素對(duì)肉雞的的為毫克千

3、克體重。其在飼料中的含量稍大為毫克千克體重。其在飼料中的含量稍大即可使動(dòng)物的增重減慢，飼料轉(zhuǎn)化率降低。即可使動(dòng)物的增重減慢，飼料轉(zhuǎn)化率降低。 現(xiàn)有的檢測方法：現(xiàn)有的檢測方法：高效液相色譜柱后衍生化法高效液相色譜柱后衍生化法 高效液相色譜柱前衍生化法高效液相色譜柱前衍生化法分光光度法分光光度法 本實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管電泳本實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管電泳電導(dǎo)檢測法（電導(dǎo)檢測法（CECDCECD）對(duì)鹽霉素）對(duì)鹽霉素進(jìn)行分離檢測進(jìn)行分離檢測實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容：實(shí)驗(yàn)主要內(nèi)容： 分離條件的選擇分離條件的選擇 重現(xiàn)性、線性范圍和檢測限重現(xiàn)性、線性范圍和檢測限 樣品測定樣品測定 緩沖體系種類及其濃度緩沖體系種類及其濃度 進(jìn)樣方式進(jìn)樣

4、方式 分離電壓分離電壓 提取方法提取方法分離條件的選擇分離條件的選擇緩沖體系種類及其濃度緩沖體系種類及其濃度 緩沖體系種類的選擇緩沖體系種類的選擇： Tris(Tris(三羥甲基氨基甲烷三羥甲基氨基甲烷 ) )硼酸：鹽霉素得不到檢測硼酸：鹽霉素得不到檢測 TrisTris：鹽霉素得不到檢測：鹽霉素得不到檢測 醋酸鈉氨水：可檢測到鹽霉素醋酸鈉氨水：可檢測到鹽霉素 TrisTrisHAcHAcCit(Cit(檸檬酸檸檬酸 ) )：可檢測到鹽霉素，：可檢測到鹽霉素， 且分離度和靈敏度最佳且分離度和靈敏度最佳 緩沖體系中各組分濃度的確定：緩沖體系中各組分濃度的確定： 經(jīng)過系列試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過系列試驗(yàn)后

5、發(fā)現(xiàn)， TrisTrisHacHacCitCit體系中三種組體系中三種組分的濃度對(duì)鹽霉素測定的分離度和靈敏度都有所影響分的濃度對(duì)鹽霉素測定的分離度和靈敏度都有所影響 分離條件的選擇分離條件的選擇緩沖體系種類及其濃度緩沖體系種類及其濃度 Tris Tris：主要用于調(diào)節(jié)緩沖容量以及主要用于調(diào)節(jié)緩沖容量以及pHpH值，但當(dāng)值，但當(dāng)TrisTris濃度太大時(shí)，水濃度太大時(shí)，水峰后容易形成正峰，影響對(duì)鹽霉素蜂的測定（圖峰后容易形成正峰，影響對(duì)鹽霉素蜂的測定（圖1 1）。其濃度的大小對(duì)）。其濃度的大小對(duì)靈敏度影響不大。靈敏度影響不大。 HacHac：濃度增加可避免水峰后的正峰出現(xiàn)，但隨著濃度的繼續(xù)增加，

6、濃度增加可避免水峰后的正峰出現(xiàn)，但隨著濃度的繼續(xù)增加，水峰形成拖尾，對(duì)鹽霉素峰造成干擾（圖水峰形成拖尾，對(duì)鹽霉素峰造成干擾（圖2 2）。靈敏度在）。靈敏度在HacHac濃度為濃度為1 1 mmol/Lmmol/L到到5 mmol/L5 mmol/L之間，隨之間，隨HacHac濃度的增加而降低。濃度的增加而降低。23t / m i n圖圖134t / m i n圖圖2 2 Cit Cit：主要用于調(diào)節(jié)：主要用于調(diào)節(jié)PHPH值，隨著值，隨著CitCit的加入，的加入，PHPH降低，水峰拖尾加重，降低，水峰拖尾加重，對(duì)鹽霉素峰造成干擾。靈敏度在對(duì)鹽霉素峰造成干擾。靈敏度在CitCit濃度為濃度為0.

7、05mmol/L0.05mmol/L到到0.4mmol/L0.4mmol/L之之間，隨間，隨CitCit濃度的增加稍微降低。濃度的增加稍微降低。 分離條件的選擇分離條件的選擇緩沖體系種類及其濃度緩沖體系種類及其濃度 綜合上述影響因素，確定綜合上述影響因素，確定12 mmol /LTris+1 mmol/L12 mmol /LTris+1 mmol/L醋酸醋酸+0.2 +0.2 mmol/Lmmol/L檸檬酸檸檬酸為電泳緩沖體系。該緩沖體系，基線平穩(wěn)，并且在保證該為電泳緩沖體系。該緩沖體系，基線平穩(wěn)，并且在保證該檢測方法的靈敏度的同時(shí)，不形成正峰，水峰對(duì)鹽霉素峰的基本無干擾檢測方法的靈敏度的同時(shí)

8、，不形成正峰，水峰對(duì)鹽霉素峰的基本無干擾（圖（圖3 3）。）。 4t / m i n圖圖3 3分離條件的選擇分離條件的選擇進(jìn)樣方式進(jìn)樣方式 分別用分別用純水純水，1 1：4 4甲醇水溶液甲醇水溶液，1 1：1 1甲醇水溶液甲醇水溶液，無水甲無水甲醇醇制備進(jìn)樣樣品，隨著甲醇含量的增加，水峰出峰時(shí)間推遲，制備進(jìn)樣樣品，隨著甲醇含量的增加，水峰出峰時(shí)間推遲，并且與鹽霉素的出峰時(shí)間差增大，分離度提高。并且與鹽霉素的出峰時(shí)間差增大，分離度提高。 0.00.20.40.60.81.0100150200250300350400450500550鹽霉素峰面積甲醇含量圖圖4 4：進(jìn)樣樣品中甲醇含量與鹽霉素峰面積

9、的關(guān)系圖：進(jìn)樣樣品中甲醇含量與鹽霉素峰面積的關(guān)系圖本實(shí)驗(yàn)采用本實(shí)驗(yàn)采用1 1：1 1甲醇水溶液甲醇水溶液 制備進(jìn)樣樣品，以制備進(jìn)樣樣品，以取得較高的靈敏度。取得較高的靈敏度。分離條件的選擇分離條件的選擇進(jìn)樣方式進(jìn)樣方式電動(dòng)進(jìn)樣：電動(dòng)進(jìn)樣：重力進(jìn)樣：重力進(jìn)樣：鹽霉素峰面積增加，但峰形不對(duì)稱；鹽霉素峰面積增加，但峰形不對(duì)稱；必須用緩沖溶液制備進(jìn)樣樣品；必須用緩沖溶液制備進(jìn)樣樣品；所得到的譜圖往往因?yàn)樗搴蟠嬖谡宥玫降淖V圖往往因?yàn)樗搴蟠嬖谡宥?難以對(duì)鹽霉素峰進(jìn)行測定難以對(duì)鹽霉素峰進(jìn)行測定 峰面積雖然減小，但峰形佳；峰面積雖然減小，但峰形佳；用用1 1：1 1甲醇水溶液甲醇水溶液制備進(jìn)樣樣品

10、，分離效果理想；制備進(jìn)樣樣品，分離效果理想；采用采用重力進(jìn)樣重力進(jìn)樣20 s20 s，可得到較好的重現(xiàn)性。，可得到較好的重現(xiàn)性。分離條件的選擇分離條件的選擇分離電壓分離電壓 電壓電壓水峰出峰時(shí)間水峰出峰時(shí)間鹽霉素峰出峰時(shí)間鹽霉素峰出峰時(shí)間出峰時(shí)間差出峰時(shí)間差12Kv12Kv3 3：34344 4：080834 s34 s10Kv10Kv4 4：20205 5：000040 s40 s8Kv8Kv5 5：32326 6：222250 s50 s分離電壓對(duì)出峰時(shí)間以及出峰時(shí)間差的影響分離電壓對(duì)出峰時(shí)間以及出峰時(shí)間差的影響 從上表可看出，隨著電壓的降低，水峰和鹽霉素峰的從上表可看出，隨著電壓的降低，

11、水峰和鹽霉素峰的出峰時(shí)間都推遲，并且兩者的出峰時(shí)間差逐步增大。出峰時(shí)間都推遲，并且兩者的出峰時(shí)間差逐步增大。 在保證水峰不干擾鹽霉素峰的前提下，選擇使用在保證水峰不干擾鹽霉素峰的前提下，選擇使用 12 Kv12 Kv作為分離電壓，可實(shí)現(xiàn)在作為分離電壓，可實(shí)現(xiàn)在5 5分鐘之內(nèi)對(duì)鹽霉素進(jìn)行分鐘之內(nèi)對(duì)鹽霉素進(jìn)行檢測。檢測。重現(xiàn)性、線性范圍和檢測限重現(xiàn)性、線性范圍和檢測限 重現(xiàn)性重現(xiàn)性：在上述選定的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)鹽霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)：在上述選定的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)鹽霉素的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)行進(jìn)行6 6次測定，出峰時(shí)間和峰面積次測定，出峰時(shí)間和峰面積RSDRSD為為0.7%0.7%和和2.8%2.8% 0204

12、06080100010002000300040005000600070008000峰面積濃度（m g / L）校正曲線上圖，檢測校正曲線上圖，檢測線性范圍線性范圍為：為：5 mg/L100 mg/L，峰面積，峰面積S與濃度與濃度C（mg/L）的回歸方程為：）的回歸方程為：S=75.5C-162，R=0.9996 檢出限檢出限（S/N=3S/N=3）為）為1mg/L。 樣品測定樣品測定四種提取方法四種提取方法方法一方法一：準(zhǔn)確稱取準(zhǔn)確稱取0.15 g鹽霉素飼料添加劑，倒入樣品瓶中，加入鹽霉素飼料添加劑，倒入樣品瓶中，加入5.00 ml 1：1甲醇水溶液甲醇水溶液，密封，超聲，密封，超聲10分鐘后

13、，取上層清液于分鐘后，取上層清液于4000 r/min離心機(jī)離心機(jī)離心離心10分鐘，移取分鐘，移取0.300ml上層清液到進(jìn)樣瓶中進(jìn)上層清液到進(jìn)樣瓶中進(jìn)行進(jìn)樣。行進(jìn)樣。方法二方法二：稱取約稱取約2 g鹽霉素飼料添加劑鹽霉素飼料添加劑研磨研磨10分鐘，準(zhǔn)確稱取研磨分鐘，準(zhǔn)確稱取研磨后的添加劑后的添加劑0.15 g，倒入樣品瓶中，加入，倒入樣品瓶中，加入5.00 ml 乙醚乙醚，密封，超，密封，超聲聲10分鐘后，移取分鐘后，移取0.300 ml上層清液到進(jìn)樣瓶中，在上層清液到進(jìn)樣瓶中，在60水浴中將水浴中將乙醚全部揮發(fā)乙醚全部揮發(fā)，再加入，再加入0.300ml 1：1甲醇水溶液，超聲甲醇水溶液，超

14、聲5分鐘后進(jìn)分鐘后進(jìn)樣。樣。樣品測定樣品測定四種提取方法四種提取方法方法三方法三：準(zhǔn)確稱取上述研磨后的添加劑：準(zhǔn)確稱取上述研磨后的添加劑0.15 g，倒入樣品瓶中，加，倒入樣品瓶中，加入入5.00 ml 乙醚，密封，超聲乙醚，密封，超聲10分鐘并分鐘并放置放置24小時(shí)小時(shí)后，移取后，移取0.300 ml上層清液到進(jìn)樣瓶中，在上層清液到進(jìn)樣瓶中，在60水浴中將乙醚全部揮發(fā)，再加入水浴中將乙醚全部揮發(fā)，再加入0.300ml 1：1甲醇水溶液，超聲甲醇水溶液，超聲5分鐘后進(jìn)樣。分鐘后進(jìn)樣。方法四方法四：稱取約：稱取約2 g鹽霉素飼料添加劑鹽霉素飼料添加劑研磨研磨20分鐘分鐘，準(zhǔn)確稱取研磨，準(zhǔn)確稱取研

15、磨后的添加劑后的添加劑0.15 g，倒入樣品瓶中，加入，倒入樣品瓶中，加入2.50 ml 乙醚乙醚，密封，超聲，密封，超聲10分鐘后，移取分鐘后，移取0.150 ml上層清液到進(jìn)樣瓶中，剩余的乙醚全部移上層清液到進(jìn)樣瓶中，剩余的乙醚全部移出，再加入出，再加入2.50 ml 乙醚乙醚，密封，超聲，密封，超聲10分鐘，再次移取分鐘，再次移取0.150 ml上上層清液到進(jìn)樣瓶中，在層清液到進(jìn)樣瓶中，在60水浴中將乙醚全部揮發(fā)后，加入水浴中將乙醚全部揮發(fā)后，加入0.300ml 1：1甲醇水溶液，超聲甲醇水溶液，超聲5分鐘后進(jìn)樣。分鐘后進(jìn)樣。四種提取方法的回收率及優(yōu)缺點(diǎn)比較四種提取方法的回收率及優(yōu)缺點(diǎn)比

16、較 樣品測定樣品測定方法方法回收率回收率優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)一一大量同存組分被萃取出來，嚴(yán)重影響鹽大量同存組分被萃取出來，嚴(yán)重影響鹽霉素的測定。霉素的測定。 二二55.458.9 操作簡便，省時(shí)，但回收率低。操作簡便，省時(shí)，但回收率低。 三三88.389.3 操作簡便，回收率較方法二有所提高，操作簡便，回收率較方法二有所提高，但較為耗時(shí)。但較為耗時(shí)。 四四93100.1 操作簡便，省時(shí)，回收率高操作簡便，省時(shí)，回收率高 。樣品測定樣品測定 采用采用第四種提取方法第四種提取方法，在，在上述的分離條件上述的分離條件下對(duì)鹽霉素飼料添下對(duì)鹽霉素飼料添加劑進(jìn)行測定，加劑進(jìn)行測定，測得其含量為標(biāo)示值的測得其含量為標(biāo)示值的95.295.2，回收率為，回收率為93.093.0100.1100.1。鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（鹽霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液（a a）及鹽霉素飼料添加劑（）及鹽霉素飼料添加劑（b b）的）的對(duì)照對(duì)照CE-CDCE-CD譜圖譜圖1 1：鹽霉素：鹽霉素; 2; 2：水：水2345621at /min23456b21t/min 本文采用本文采用高效毛細(xì)管電泳高效毛細(xì)管電泳/電導(dǎo)檢測法電導(dǎo)檢測法建立了鹽霉建立了鹽霉素的快