miRNA的研究方法

1、microRNA(miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)度在 22nt左右的內(nèi)源非編碼小RNA廣泛存在于動(dòng)物、植物、 病毒等多種有機(jī)體中。 1993 年， Lee 等人在秀麗新小桿線蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)了控制著線蟲(chóng)時(shí)序性發(fā)育的lin-4 。 2000 年， Reinhart 等發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)功能的小分子RNA： let-7 。隨后的幾年時(shí)間里，許多研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了這類(lèi)RNA并將這些具有時(shí)空表達(dá)特異性的非編碼小分子 RN前名為 microRNA(miRNA)。從長(zhǎng)的初級(jí) miRNA(pri-miRNA)到形成成熟的單鏈miRNA到與靶標(biāo)RNA結(jié)合，至少需要四步：首先是由核糖核酸酶出Drosha 和DGCR8a成

2、的復(fù)合物將初始miRNA轉(zhuǎn)錄本(pri-miRNA )加工成 miRNA前體(pre-miRNA);接著由轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Exportin-5 和 Ran GTP酶將 miRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)中；第三步是由另一種核糖核酸酶出Drosha 將miRNA前體剪切成成熟的miRNA雙鏈，miRNA雙鏈打開(kāi)，其中一條進(jìn)入到RNA誘導(dǎo)的沉默RISC復(fù)合體(RISC)中，該復(fù)合體還包含TarRNA結(jié)合蛋白(TRBP ;最終RISC復(fù)合體根據(jù) miRNA與靶標(biāo)RNA的互補(bǔ)配對(duì)，對(duì)靶基 因進(jìn)行剪切，或者翻譯抑制。圖 1 miRNA 生物學(xué)調(diào)控過(guò)程(摘自文獻(xiàn)8)miRNA通過(guò)作用于相應(yīng)靶 mRNA參與細(xì)胞增殖、凋

3、亡、分化、代謝、發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過(guò)程。預(yù)測(cè)超過(guò)1/3的人類(lèi)基因都是保守的 miRNA靶基因。近些年，隨著科學(xué)研究的進(jìn)展，大量的 miRNA 已經(jīng)被鑒定出來(lái)，截至目前發(fā)現(xiàn)的人的成熟的miRNA 有 2578 條，小鼠的有1908條。雖然 miRNA的數(shù)量很多，但大多miRNA的功能并不為人所知。因此，準(zhǔn)確快速地預(yù)測(cè)并鑒定 miRNA的靶基因，對(duì)研究 miRNA的功能具有十分重要的意義。下面本篇文章將著重 介紹一下在醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域中如何快速高效的鑒定與人類(lèi)疾病相關(guān)的miRNA及其功能研究方法。一、miRNA勺定量檢測(cè)成熟miRNA的片段小，只有 21bp左右，變異較大，在不同細(xì)胞中的表達(dá)差

4、異較大，低表達(dá)的 miRNA為其定量檢測(cè)帶來(lái)了很大的困難和挑戰(zhàn)。盡管如此，隨著科學(xué)的進(jìn)步，越來(lái)越多的miRNA檢測(cè)方法被建立起來(lái)，極大程度的促進(jìn)了 miRNA 研究進(jìn)展。下面介紹下在疾病研究中常用的五大 miRNAt量檢測(cè)方法。Northern blotting:是較為經(jīng)典的檢測(cè)各組織和器官中RNA 的量和大小及估計(jì)其豐度的實(shí)驗(yàn)方法。主要實(shí)驗(yàn)步驟包括：完整的RNA的分離；根據(jù) RNA的大小通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA進(jìn)行分離；將 RNA轉(zhuǎn)移到固相支持物上，在轉(zhuǎn)移過(guò)程中，要保持RNA在凝膠中的相對(duì)分布；將RNA固定到固體支持物上；固相RNA與探針?lè)肿与s交；除去非特異結(jié)合到固相支持物上的探針?lè)肿?；?duì)

5、特異結(jié)合的探針?lè)肿拥膱D像進(jìn)行檢測(cè)、捕獲和分析。優(yōu)點(diǎn)：高度靈敏，而且通過(guò)結(jié)合 RNA marker可以檢測(cè)出 miRNA的片段大小，能夠排除實(shí)驗(yàn)被其他小分子RNA污染的可能性性，但Northern blotting 對(duì)樣品的需求量較高，操作步驟繁瑣，不適用高通量分析。微陣列芯片技術(shù)( microarry ) ： 也稱(chēng)生物芯片、 DNA 芯片或者基因芯片技術(shù)，是一種平面的基 質(zhì)載體，上面規(guī)則地、特異性地吸附著基因或基因的產(chǎn)物。當(dāng)與熒光標(biāo)記過(guò)的樣本雜交后，相應(yīng)位 置熒光信號(hào)的強(qiáng)弱即可反映對(duì)應(yīng)基因表達(dá)的豐度。其優(yōu)點(diǎn)是能夠同時(shí)檢測(cè)多個(gè)樣本的表達(dá)量，實(shí)現(xiàn) miRNA的高通量分析。但芯片檢測(cè)技術(shù)對(duì)miRNA

6、的純度質(zhì)量要求較高，現(xiàn)行的RNA提取為了獲取高質(zhì)量了 RNA往往會(huì)在純化過(guò)程丟失掉許多小分子RNA影響一些低表達(dá)RNA的檢測(cè)。另外芯片技術(shù)的一個(gè)突出的缺點(diǎn)就是信息質(zhì)量的穩(wěn)為性和可重復(fù)性較差。這些方面都需要改進(jìn)。原位雜交： 該技術(shù)可以更為直觀的顯示出 miRNA 的表達(dá)情況，可直接觀測(cè)到 miRNA 的表達(dá)時(shí) 間，表達(dá)分布范圍，具體位置等，不僅可以檢測(cè)不同細(xì)胞系單個(gè)細(xì)胞中的 miRNA 表達(dá)，還可在不經(jīng) 分類(lèi)和分離的情況下，比較不同細(xì)胞系中miRNA的表達(dá)水平。但 miRNA分子太小，要對(duì)傳統(tǒng)的原位雜交技術(shù)進(jìn)一步改進(jìn)，增加雜交的親和性，結(jié)合牢固性，以防止洗脫過(guò)程中的丟失，造成結(jié)果不準(zhǔn) 確。RT-

7、PCR與雜交方法相比，PCR方法可以高度靈敏的檢測(cè)出低表達(dá)的miRNA并適合于高通量篩選。由于 miRNA分子片段小，研究者們通過(guò)對(duì)其反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行特異性設(shè)計(jì)使得RT-PCR定量檢測(cè)miRNA成為可能，根據(jù)所用引物的不同可以將其分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是 Oligo d(T)特異的RT引 物，miRNA在反轉(zhuǎn)錄前需要對(duì)其 3'末端加多聚尾 Poly(A),再使用Oligo-Universal Tag通用逆轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，最終生成miRNA對(duì)應(yīng)的cDNA第一鏈。莖環(huán)結(jié)構(gòu)的RT引物由可以自身呈莖環(huán)狀的特異序列加上 6個(gè)到8個(gè)miRNA3端反相互補(bǔ)堿基組成，一條miRNA序列對(duì)應(yīng)一個(gè)特異的莖

8、環(huán)結(jié)構(gòu)的反轉(zhuǎn)錄引物。兩者相比，前者引物設(shè)計(jì)容易且檢測(cè)通量高，但檢測(cè)靈敏度和特異性比后者 低。熒光定量PCR艮據(jù)所用熒光來(lái)源不同可以分為SYBR Green染料法和TagMan探針?lè)?。miRNA深度測(cè)序：該技術(shù)能夠直接對(duì)樣本中特定大小的miRNA分子進(jìn)行高通量測(cè)序，可以在無(wú)需任何miRNA序列信息的前提下研究 miRNA勺表達(dá)譜，并發(fā)現(xiàn)和鑒定新 miRNA分子。新一代測(cè)序最常使用的3種平臺(tái)是Illumina的基因組分析儀、 Roche454基因組測(cè)序儀以及 AB Life Technologies的SOLiD系統(tǒng)。因?yàn)閙iRNA勺序列較短，較多應(yīng)用于miRNA僉測(cè)的新一代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)為Illum

9、ina基因組分析儀和 ABLife Technologies的SOLiD系統(tǒng)。Illumina基因組分析儀具有所需樣品少，數(shù)據(jù)誤差小，操作流程簡(jiǎn)單等特點(diǎn)。SOLiD系統(tǒng)的t賣(mài)長(zhǎng)為35nt ,且準(zhǔn)確度最高，單次運(yùn)行所得的數(shù)據(jù)量最大，特別適用于miRNA勺研究。而Roche454基因組測(cè)序儀測(cè)序讀長(zhǎng)可達(dá) 400500堿基，而miRN屏列長(zhǎng)度僅為22堿基，所以該測(cè)序儀 常用于新物種的基因組測(cè)序和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，極少應(yīng)用于miRNA序。二、miRNA勺靶基因?qū)ふ已芯勘砻鳎粋€(gè)基因可以受多個(gè)miRNA調(diào)控，而一種 miRNA又可以參與調(diào)控多個(gè)靶基因，據(jù)預(yù)測(cè)，至少有30%勺人類(lèi)基因是 miRNA的靶基因。這就

10、足以顯示出miRNA群體的重要性。而在人類(lèi)疾病中多不同程度的表現(xiàn)出大量miRNA的上調(diào)和下調(diào)，這也足以顯示miRNA在疾病發(fā)生過(guò)程中占據(jù)著非常重要的作用。而探討miRNA的功能作用中最重要的一步就是高效準(zhǔn)確的尋找到其所調(diào)控的靶基因。目前尋找靶基因主要是從以下兩個(gè)方面入手。1 .生物信息學(xué)方法miRNA靶基因的預(yù)測(cè)主要是根據(jù)生物信息學(xué)的方式進(jìn)行，主要是根據(jù)以下幾個(gè)方面進(jìn)行預(yù)測(cè)：miRNA與靶基因結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)性；miRNA靶位點(diǎn)在不同物種之間的保守性；miRNA-mRNA吉合的熱穩(wěn)定性； miRNA靶位點(diǎn)處不應(yīng)有復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)； miRNA 5端與靶基因的結(jié)合能力強(qiáng)于 3'端。除以上幾個(gè)基

11、本原則外，不同的預(yù)測(cè)方法還會(huì)根據(jù)各自總結(jié)的規(guī)律對(duì)算法進(jìn)行不同的限制與優(yōu)化。目前比較常用的 靶基因預(yù)測(cè)軟 件有：miRanda、TargetScan、PicTar、miRWalk、 miRanda、miRDB等，其中在 miRWalk中可以查找到已經(jīng)被研究證實(shí)的miRNA的靶基因，也可以查找與某種疾病相關(guān)的 miRNA等。雖然靶基因預(yù)測(cè)軟件很多，但其預(yù)測(cè)特異性和敏感度還有待改善，一個(gè)軟件針對(duì)一個(gè)miRNA通?？梢灶A(yù)測(cè)出上千條靶基因，這就為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證帶來(lái)了許多困難，雖然我們可以結(jié)合多個(gè)軟件 進(jìn)彳t miRNA的靶基因預(yù)測(cè)，但在取幾個(gè)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集時(shí)也忽略了許多真實(shí)的靶基因，在這兩 者之間的

12、權(quán)衡就需要我們研究者去綜合參考其他方面的因素來(lái)抉擇。比如，我們可以結(jié)合DAVID軟件對(duì)所選靶基因進(jìn)行 GO析或通路分析，來(lái)針對(duì)某一特定功能方面進(jìn)行靶基因的選擇。預(yù)測(cè)方法網(wǎng)址檢索范圍算法特點(diǎn)miRanda人，果蠅，斑馬魚(yú)序列匹配， 性雙鏈結(jié)合自由能，物種間保守TargetScan/TargetScanS人，小鼠，大鼠，狗提出“miRNA中子區(qū)”的概念RNAhybrid哺乳動(dòng)物快速準(zhǔn)確計(jì)算miRNA-mRNA聚體自由能DIANA- microT人，小鼠，大鼠，果 蠅考慮miRN調(diào)控單個(gè)靶位點(diǎn)的情況PicTar脊椎動(dòng)物區(qū)分“完全匹配種子區(qū)”與“不完全匹配種 子區(qū)”RNA22哺乳動(dòng)物不考慮保守性，由m

13、RNA手預(yù)測(cè)相關(guān)miRNA2 .生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法由于計(jì)算機(jī)模擬在預(yù)測(cè) miRNAm基因時(shí)存在一定的局限性，因此很多醫(yī)學(xué)科研人員也希望能夠利用 生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法直觀地尋找 miRNAlB基因。 從mRNA平尋找 miRNAE基因一種方法是將miRNA莫擬物或過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，使得miRNAB細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，之后利用基因芯片分析mRNA變化以找出相應(yīng) miRNA勺靶基因。此外，Beitzinger等人利用AG僚白家族既能結(jié)合 miRNAZ能Z合mRNA特性，分別使用 AGO-休口AGO-如白的單克隆抗體在人類(lèi)細(xì)胞中進(jìn)行免疫共沉淀， 得至IJ與AGO-便口 AGO-如白結(jié)合的mRNAr600條，并通

14、過(guò)克隆測(cè)序?qū)@些 mRNA!行鑒定。同時(shí)從與 AGO-1 蛋白結(jié)合的mRNN隨機(jī)挑選6條進(jìn)行熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中有5條都是miRNA勺靶基因。Easow等人也是用J用純化 miRN既分析miRNA勺靶基因。他們利用基因芯片分析了miRNP吉合的mRNA1發(fā)現(xiàn)，大量計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)的 miRNAE基因得到了富集，同時(shí)為了分析單個(gè)miRNA勺靶基因，對(duì)野生型果蠅和miR-1缺失果蠅的miRNP吉合mRN進(jìn)行了分析，得到并利用實(shí)驗(yàn)方法鑒定miR-1調(diào)節(jié)的mRNA為miRNAE基因的尋找提供了新的思路。最近，Liu等 人在研究Mir-16家族的功能時(shí)建立了一種針對(duì)miRNAE基因的反向篩選法。首先

15、，確定了感興趣的基因ccnd1,將它的3' UTR勾建到熒光素酶報(bào)告載體中，之后與構(gòu)建的miRNA1達(dá)文庫(kù)共轉(zhuǎn)染HepG2ffl胞，得到熒光彳1明顯下降的miRNA再將彳#到的miRNA4體內(nèi)驗(yàn)證其功能，最終得到Mir-16家族能夠調(diào)節(jié)CCND1因。該方法的關(guān)鍵在于，利用了自行構(gòu)建的miRNA1達(dá)文庫(kù)，能夠方便同時(shí)研究多條 miRNA通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)對(duì)候選 miRNAS行初步篩選，從而快速地鑒定一條mRN所對(duì)應(yīng)的多條miRNA(2)從蛋白質(zhì)水平尋找 miRNAE基因Selbach和Baek兩個(gè)研究組分別利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究方法，建立了從蛋白質(zhì)水平尋找miRNAE基因的新方法。兩個(gè)課題組分別

16、將成熟miRN徼鏈車(chē)專(zhuān)染HeL隹田胞，利用細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(stableisotope labeling with amino acids in cell culture),將轉(zhuǎn)染了成熟 miRNAZ鏈的細(xì)胞和正常細(xì)胞分別培養(yǎng)于含輕/重型穩(wěn)定同位素標(biāo)記必需氨基酸的培養(yǎng)基中，經(jīng)過(guò)若干次細(xì)胞倍增后，穩(wěn)定同位素按 照序列特異的方式完全摻入到新合成的蛋白質(zhì)中，通過(guò)比較標(biāo)記前后同一肽段的質(zhì)譜峰值變化實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋 白質(zhì)的精確定量。在檢測(cè)了20005000個(gè)蛋白后，兩個(gè)研究組分別發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染一條miRN嗝有幾百個(gè)蛋白的表達(dá)水平發(fā)生了改變，許多改變?cè)趍RNAK平上不能得到體現(xiàn)。蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究方法的引入

17、，使得人們可以從蛋白質(zhì)水平上尋找miRNA勺靶基因，從而提高了靶基因的檢出率。三、miRNA靶基因的驗(yàn)證與miRNA靶基因的預(yù)測(cè)方法相比，對(duì) miRNA靶基因進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的方法并不多，目前還沒(méi)有一個(gè)快速、簡(jiǎn)便、高通量的鑒定方法。最直接的鑒定方法是，利用熒光定量 PCR及 Western blot方法分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染或敲低 miRNA后細(xì)胞中mRNAK平及蛋白水平的變化，從而確定miRNA與靶基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系。這種方法能夠直接鑒定出miRNA的靶基因，準(zhǔn)確度高但不能鑒定 miRNA的靶位點(diǎn)。轉(zhuǎn)染或敲低 miRNA方式主要有兩種，一種是構(gòu)建miRNA過(guò)表達(dá)載體的穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)，一種是人工合成miRNA類(lèi)似

18、物的瞬時(shí)表達(dá)方式。miRNA的過(guò)表達(dá)載體中有插入成熟miRNA pre-miRNA及pri-miRNA 序列三種形式。其中 pri-miRNA （含側(cè)翼序列）的方式由于保留了每個(gè)microRNA 獨(dú)自的原始天然雙臂結(jié)構(gòu)，效果更好，是應(yīng)用最為廣泛的方法。microRNA過(guò)表達(dá)系統(tǒng)中有 CM如動(dòng)子（II型啟動(dòng)子）和 H1啟動(dòng)子（III型啟動(dòng)子）兩種方式供選擇。III型啟動(dòng)子（H1、U6等）具有表達(dá)效率高、有效的確定終止位置等優(yōu)點(diǎn)，成為首選。 II 型啟動(dòng)子適用于pri-miRNA 序列中有連續(xù)的 5 個(gè)T- 導(dǎo)致 III 型啟動(dòng)子（CMV、 Ubi 等）終止轉(zhuǎn)錄的情況。載體系統(tǒng)也分多種，包括慢病毒

19、載體、腺病毒載體、質(zhì)粒載體等。瞬時(shí)過(guò)表達(dá)方式主要是經(jīng)過(guò)人工化學(xué)修飾的運(yùn)用化學(xué)方法合成的雙鏈RNA，能模擬細(xì)胞中內(nèi)源性成熟miRNA的高水平表達(dá)，以增強(qiáng)內(nèi)源性miRNA的調(diào)控作用，進(jìn)行功能獲得性研究。只需直接轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞，即可檢測(cè)功能變化，快速，方便。miRNA靶位點(diǎn)鑒定：目前最為常用的 miRNA靶位點(diǎn)鑒定方法是熒光素酶報(bào)告基因法。其基本原 理是首先構(gòu)建熒光素酶表達(dá)載體，將希望鑒定的miRNA靶基因的3' UTR構(gòu)建到熒光素酶基因的3' UTR中，之后將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞并改變細(xì)胞中相應(yīng)miRNA的表達(dá)水平，最后檢測(cè)熒光素酶的表達(dá)情況以分析轉(zhuǎn)染3' UTR中是否含有m

20、iRNA的靶位點(diǎn)。近幾年來(lái)，對(duì)miRNA 的研究已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)科研領(lǐng)域中的一個(gè)重要方向。越來(lái)越多的研究揭示出其在疾病的發(fā)生及發(fā)展中處于重要地位，另外，它在疾病診斷、治療及預(yù)后提示方面的作用也被有 關(guān)研究所證實(shí)。在目前很多課題研究都會(huì)涉及miRNA領(lǐng)域，而了解miRNA基本研究思路及方法是研究中不可缺少的一步。在設(shè)計(jì)課題方案時(shí)，我們要靈活選擇運(yùn)用這些研究方法，以便使我們的研究 方案更加新穎、合理、嚴(yán)謹(jǐn)。參考文獻(xiàn)1. 王芳， 余佳 & 張俊武 . 小 RNA (MicroRNA) 研究方法 . Chinese Journal of Biochemistryand Molecular Biolog