(完整word版)土壤酶活性測定方法

1、土壤酶活性測定方法土壤麻酶的測定方法（苯酚鈉一次氯酸鈉比色法）一、原理腺酶存在于人多數(shù)細(xì)菌、真菌和高等植物里。它是一種酰胺酶作用是極為專性的，它僅能水解尿素，水解的最終產(chǎn)物是氨和二氧化碳、水。土壤腺酶活性，與土壤的微生物數(shù)量、有機物質(zhì)含屋、全氮和速效磷含屋呈正相關(guān)。根際土壤腺酶活性較高，中性土壤腺酶活性大于堿性土壤。人們常用土壤聯(lián)酶活性表征土壤的氮素狀況。土壤中服酶活性的測定是以腺素為基質(zhì)經(jīng)酶促反應(yīng)后測定生成的氨量，也可以通過測定未水解的尿素量來求得。本方法以尿素為基質(zhì)，根據(jù)酶促產(chǎn)物氨與苯酚一次氯酸鈉作用生成藍(lán)色的靛酚，來分析腺酶活性。二、試劑1）甲苯2）10%尿素：稱取10g尿素，用水溶至l

2、OOmL3）檸檬酸鹽緩沖液（PH6.7）：184g檸檬酸和147.5g氫氧化鉀（KOH）溶于蒸懈水。將兩溶液合并，用Imol/LNaOH將PH調(diào)至6.7,用水桶釋定容至1000mlo4）苯酚鈉溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇,加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇桶釋至100ml（A液），存于冰箱中：27gNaOH溶于100ml水（B液）。將A、B溶液保存在冰箱中。使用前將A液、B液各20ml混合，用蒸館水橋釋至lOOmL5）次氯酸鈉溶液：用水桶釋試劑，至活性氯的濃度為0.9%,溶液穩(wěn)定。6）氮的標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取0.4717g硫酸饌?cè)苡谒⑼搬屩?000ml,得到1ml

3、含有O.lmg氮的標(biāo)準(zhǔn)液：再將此液棉釋10倍（吸取10ml標(biāo)準(zhǔn)液定容至100ml）制成氮的工作液（0.01mg/ml）o三、操作步驟稱取5g土樣于50ml三角瓶中，加1ml甲苯，振蕩均勻，15min后加lOrnllO%尿素溶液和20mlPH6.7檸檬酸鹽緩沖溶液，搖勻后在37°C恒溫箱培養(yǎng)24小時。培養(yǎng)結(jié)束后過濾，過濾后取1ml濾液加入50ml容量瓶中，再加4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。lh內(nèi)在分光光度計與578nm波長處比色。（靛酚的藍(lán)色在lh內(nèi)保持穩(wěn)定）。標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：在測定樣品吸光值之前，分別取0、1、3、5、7、9、11、13ml氮

4、工作液,移于50ml容量瓶中，然后補加蒸館!水至20ml。再加入4ml苯酚鈉溶液和3ml次氯酸鈉溶液，隨加隨搖勻。20min后顯色，定容。lh內(nèi)在分光光度計上于578nm波長處比色。然后以氮工作液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意事項：1、每一個樣品應(yīng)該做一個無基質(zhì)對照，以等體積的蒸飾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實驗相同，以排除土樣中原有的氨對實驗結(jié)果的影響。2、整個實驗設(shè)置一個無土對照，不加土樣，其他操作與樣品實驗相同，以檢驗試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計算：以24小時后lg土壤中NH3N的亳克數(shù)表示土壤腺

5、酶活性（Ure）。Ure=（a樣品一a無土一a無基質(zhì)）XVXn/m式中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N亳克數(shù)；a無土為無土對照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N亳克數(shù)；a無基質(zhì)為無基質(zhì)對照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的NH3N亳克數(shù)；V為顯色液體積；n為分取倍數(shù)，浸出液體積/吸取濾液體積；m表示烘干土重土壤磷酸酶活性測定（磷酸苯二鈉比色法）一、原理測定磷酸酶主要根據(jù)酶促生成的有機基團量或無機磷量計算磷酸酶活性。前一種通常稱為有有機基團含量法，是目前較為常用的測定磷酸酶的方法，后一種稱為無機磷含屋法。研究證明：磷酸酶有三種最適PH值:45、67、810o因此，測定酸性、中性和堿性土壤的磷酸酶，要

6、提供相應(yīng)的PH緩沖液才能測出該土壤的磷酸酶最人活性。測定磷酸酶常用的PH緩沖體系有乙酸鹽緩沖液（PH5.05.4）、檸檬酸鹽緩沖液（PH7.0）、三疑甲基氨基甲烷緩沖液（PH7.08.5）、和硼酸緩沖液（PH9V0）。磷酸酶測定時常用基質(zhì)有磷酸苯二鈉、酚釀磷酸鈉、甘油磷酸鈉、a-或者B-蔡酚磷酸鈉等?，F(xiàn)介紹磷酸苯二鈉比色法。二、試劑1）緩沖液：（1）醋酸鹽緩沖液（PH5.0）O.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L.O.2mol/L醋酸鈉溶液16.4gC2H3O2Na或27gC2H3O2Na.3H2O溶至IL.取14.8mlO.2mol/L醋酸溶液和35.2mlO.2mol/

7、L醋酸鈉溶液桶釋至1L.（2）檸檬酸鹽緩沖液（PH7.0）O.lmol/L檸檬酸溶液19.2gC6H7O8溶至1L.0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液53.63gNa2HPO4.7H2O或者71.7gNa2HPO4.12H2O溶至IL.取6.4mlO.lmol/L檸檬酸溶液加43.6ml0.2mol/L磷酸氫二鈉溶液橋釋至100ml.（3）硼酸鹽緩沖液（PH9.6）0.05mol/L硼砂溶液19.05g硼砂溶至1L.0.2mol/LNaOH溶液8gNaOH溶至IL.取50ml0.05mol/L硼砂溶液加23ml0.2mol/LNaOH溶液桶釋至200ml.2）0.5%磷酸苯二鈉（用緩沖液配制）3）

8、氯代二漠對苯醍亞胺試劑：稱取0.125g氯代二澳對苯醍亞胺，用10ml96%乙醇溶解，貯于棕色瓶中，存放在冰箱里。保存的黃色溶液未變褐色之前均可使用。4）甲苯5）0.3%硫酸鋁溶液6）酚標(biāo)準(zhǔn)溶液酚原液：取lg重蒸酚溶于蒸館水中，桶釋至1L,存于棕色瓶中。酚工作液（0.01mg/ml）：取10ml酚原液橋釋至1L。三、操作步驟稱5g土樣置于200ml三角瓶中,加2.5ml甲苯,輕搖15min后，加入20ml0.5%磷酸苯二鈉（酸性磷酸酶用乙酸鹽緩沖液；中性磷酸酶用檸檬酸鹽緩沖液;堿性磷酸酶用硼酸鹽緩沖液）,仔細(xì)搖勻后放入恒溫箱，37°C下培養(yǎng)24h。然后在培養(yǎng)液加入100ml0.3%硫

9、酸鋁溶液并過濾。吸取3ml濾液于50ml容量瓶中，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法顯色。用硼酸緩沖液時，呈現(xiàn)藍(lán)色，于分光光度計上660nm處比色。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取0、1、3、5、7、9、11.13ml酚工作液，置于50ml容量瓶中，每瓶加入5ml硼酸緩沖液和4滴氯代二澳對苯匪亞胺試劑，顯色后桶釋至刻度，30min后，在分光光度計上660nm處比色。以顯色液中酚濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意事項：1、每一個樣品應(yīng)該做一個無基質(zhì)對照，以等體積的蒸飾水代替基質(zhì)，其他操作與樣品實驗相同，以排除土樣中原有的氨對實驗結(jié)果的影響。2、整個實驗設(shè)置一個無土對照，不加土樣，其他操作與樣品實驗相同，以檢驗

10、試劑純度和基質(zhì)自身分解。3、如果樣品吸光值超過標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣四、結(jié)果計算以24h后遼土壤中釋放岀的酚的質(zhì)量（mg）表示磷酸酶活性。磷酸酶活性二（a樣品一a無土一a無基質(zhì)）XVXn/m式中：a樣品為樣品吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚亳克數(shù)；a無土為無土對照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚亳克數(shù)；a無基質(zhì)為無基質(zhì)對照吸光值由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的酚亳克數(shù)；V為顯色液體積；n為分取倍數(shù)，浸出液體積/吸取濾液體積；m表示烘干土重土壤蔗糖酶活性測定（3,5-二硝基水楊酸比色法）一、原理蔗糖酶與土壤許多因子有相關(guān)性，如與土壤有機質(zhì)、氮、磷含量，微生物數(shù)量及土壤呼吸強度有關(guān)，一般情況卞，土壤肥力

11、越高，蔗糖酶活性越高。蔗糖酶酶解所生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。二、試劑1）酶促反應(yīng)試劑：基質(zhì)8%蔗糖，pH5.5磷酸緩沖液：1/15M磷酸氫二鈉（11.876gNa2HPO42H2O溶于1L蒸餡水中）0.5ml加1/15M磷酸二氫鉀（9.078gKH2PO4溶于1L蒸懈水中）9.5ml即成，甲苯2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（lmg/mL）預(yù)先將分析純葡萄糖置80°C烘箱內(nèi)約12小時。準(zhǔn)確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸館水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4°C

12、保存期約一星期）。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)彖，則應(yīng)棄之，重新配制。3）3,5-二硝基水楊酸試劑（DNS試劑）稱0.5g二硝基水楊酸，溶于20ml2mol/LNaOH和50ml水中,再加30g酒石酸鉀鈉,用水橋釋定容至100ml（保存期不過7天）。三、操作步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制分別吸1mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL于試管中，再補加蒸館水至ImL,加DNS試劑3mL混勻，于沸水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5min（從試管放入重新沸騰時算起），取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長540nm處比色，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）土壤

13、蔗糖酶測定稱取5g土壤，置于50mL三角瓶中，注入15ml8%蔗糖溶液，5mlpH5.5磷酸緩沖液和5滴甲苯。搖勻混合物后，放入恒溫箱，在37°C下培養(yǎng)24h。到時取出，迅速過濾。從中吸取濾液lml,注入50ml容量瓶中，加3mlDNS試劑，并在沸騰的水浴鍋中加熱5min,隨即將容量瓶移至自來水流2令卻3mino溶液因生成3-氨基-5-硝基水楊酸而呈橙黃色，最后用蒸館水橋釋至50ml,并在分光光度計上于508nm處進行比色。（為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無基質(zhì)對照，整個試驗需做無土壤對照：如果樣品吸光值超過標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣

14、。）四、結(jié)果計算：蔗糖酶活性以24h,lg干土生成葡萄糖亳克數(shù)表示。蔗糖酶活性二（a樣品一a無土一a無基質(zhì)）Xn/ma樣品、a無土、a無機質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖亳克數(shù)；n為分取倍數(shù)；m表示烘干土重土壤纖維素酶活性測定（3,5-二硝基水楊酸比色法）一、原理纖維素是植物殘體進入土壤的碳水化合物的重要組分之一。在纖維素酶作用卞，它的最初水解產(chǎn)物是纖維二糖，在纖二糖酶作用下，纖維二糖分解成葡萄糖。所以，纖維素酶是碳素循環(huán)中的一個重要的酶。纖維素酶解所生成的還原糖與3,5-二硝基水楊酸反應(yīng)而生成橙色的3-氨基-5-硝基水楊酸。顏色深度與還原糖量相關(guān)，因而可用測定還原糖量來表示蔗糖酶的活性。二、

15、試劑1）甲苯2）1%竣甲基纖維素溶液：遼竣甲基纖維素鈉，用50%的乙醇溶至lOOmL3）pH5.5醋酸鹽緩沖液：0.2mol/L醋酸溶液11.55ml95%冰醋酸溶至1L.0.2mol/L醋酸鈉溶液16.4gC2H3O2Na或27.22gC2H3O2Na.3H2O溶至IL.取Ilml0.2mol/L醋酸溶液和88ml0.2mol/L醋酸鈉溶液混勻即成PH5.5醋酸鹽緩沖液.4）3,5二硝基水楊酸溶液:稱1.25g二硝基水楊酸，溶于50ml2mol/LNaOH和125ml水中,再加75g酒石酸鉀鈉，用水桶釋至250ml（保存期不過7天），5）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（lmg/mL）預(yù)先將分析純葡萄糖置80&

16、#176;C烘箱內(nèi)約12小時。準(zhǔn)確稱取50mg葡萄糖于燒杯中，用蒸館水溶解后，移至50mL容量瓶中，定容，搖勻（冰箱中4°C保存期約一星期）。若該溶液發(fā)生混濁和出現(xiàn)絮狀物現(xiàn)彖，則應(yīng)棄之，重新配制。三、操作步驟葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線:分別吸lmg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡糖糖溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mL于試管中，再補加蒸館水至lmL,加DNS溶液3ml混勻，于沸騰水浴中加熱5min,取出立即泠水浴中冷卻至室溫，以空白管調(diào)零在波長540nm處比色，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱10g土壤置于50ml三角瓶中，加入1.5ml甲苯，搖勻后放置15min,再加5ml1

17、%竣甲基纖維素溶液和5mlpH5.5醋酸鹽緩沖液，將三角瓶放在37°C恒溫箱中培養(yǎng)72h°培養(yǎng)結(jié)束后，過濾并取lml濾液，然后按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線顯色法比色測定。（為了消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖而引起的誤差，每一土樣需做無基質(zhì)對照，整個試驗需做無土壤對照：如果樣品吸光值超過標(biāo)曲的最大值，則應(yīng)該增加分取倍數(shù)或減少培養(yǎng)的土樣。）四、結(jié)果計算纖維素酶活性以72h,lg干土生成葡萄糖亳克數(shù)表示。纖維素酶活性=（a樣品一a無土一a無基質(zhì)）Xn/ma樣品、a無土、a無機質(zhì)分別表示其由標(biāo)準(zhǔn)曲線求的葡萄糖亳克數(shù)；n為分取倍數(shù)；m表示烘干土重過氧化氫酶活性測定（高鐳酸鉀滴定法）一、原理過氧化氫廣

18、泛存在于生物體和土壤中，是由生物呼吸過程和有機物的生物化學(xué)氧化反應(yīng)的結(jié)果產(chǎn)生的，這些過氧化氫對生物和土壤具有毒害作用。與此同時，在生物體和土壤中存有過氧化氫酶，能促進過氧化氫分解為水和氧的反應(yīng)（H2O2-H2O+O2）,從而降低了過氧化氫的毒害作用。土壤中過氧化氫酶的測定便是根據(jù)土壤（含有過氧化氫酶）和過氧化氫作用析出的氧氣體積或過氧化氫的消耗量，測定過氧化氫的分解速度，以此代表過氧化氫酶的活性。測定過氧化氫酶的具體方法比較多，如氣量法：根據(jù)析出的氧氣體積來計算過氧化氫酶的活性；比色法:根據(jù)過氧化氫與硫酸銅產(chǎn)生黃色或橙黃色絡(luò)合物的量來表征過氧化氫酶的活性;滴定法：用高怯酸鉀溶液滴定過氧化氫分解

19、反應(yīng)剩余過氧化氫的量，表示出過氧化氫酶的活性。本實驗重點采用高鎰酸鉀滴定法。二、試劑2mol/LH2SO4溶液:量取5.43ml的濃硫酸稲釋至500ml,置于冰箱貯存；0.02mol/L高猛酸鉀溶液:稱取1.7g高銹酸鉀,加入400mL水中，緩緩煮沸15min,冷卻后定容至500mL,避光保存，用時用0.1mol/L草酸溶液標(biāo)定；0.1mol/L草酸溶液：稱取優(yōu)級純H2C2O4-2H2O3.334g/用蒸館水溶解后，定容至250ml；3%的H2O2水溶液：取30%H2O2溶液25ml,定容至250ml,置于冰箱貯存，用時用0.1mol/LKmnO4溶液標(biāo)定。三、操作步驟分別取5g土壤樣品于具塞三角瓶中（用不加土