構建點突變質粒步驟

1、基因定點突變一、定點突變的目的把目的基因上面的一個堿基換成另外一個堿基。二、定點突變的原理通過設計引物，并利用PCR將模板擴增出來，然后去掉模板，剩下來的就是我們的PCR產(chǎn)物，在PCR產(chǎn)物上就已經(jīng)把這個點變過來了，然后再轉化，篩選陽性克隆，再測序確定就行了。三、引物設計原則引物設計的一般原則不再重復。突變引物設計的特殊原則：(1) 通常引物長度為2545bp，我們建議引物長度為3035bp。一般都是以要突變的堿基為中心，加上兩邊的一段序列，兩邊長度至少為11-12bp。若兩邊引物太短了，很可能會造成突變實驗失敗，因為引物至少要11-12個bp才能與模板搭上，而這種突變PCR要求兩邊都能與引物搭

2、上，所以兩邊最好各設至少12個bp,并且合成多一條反向互補的引物。(2) 如果設定的引物長度為30bp，接下來需要計算引物的Tm值，看是否達到78°C(GC含量應大于40%)。(3) 如果Tm值低于78C，則適當改變引物的長度以使其Tm值達到78C(GC含量應大于40%)。(4) 設計上下游引物時確保突變點在引物的中央位置。(5) 最好使用經(jīng)過純化的引物。Tm值計算公式：Tm=041x(%ofGC)675/L+81.5注：L：引物堿基數(shù)；%ofGC：引物GC含量。四、引物設計實例以GCGACG為例：5'-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG3

3、-'(1)首先設計30bp長的上下游引物，并將A(T)設計在引物的中央位置。Primer#1:5'-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3'Primer#2:5'-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3'(2)引物GC含量為40%,L為30,將這兩個數(shù)值帶入Tm值計算公式,得到其Tm=75.5(Tm=0.41x40-675/30+81.5)。通過計算可以看出其Tm低于78°C,這樣的引物是不合適的，所以必須調整引物長度。(3)重新調整引物長度。Primer#1:5'-CCTCCTTCA

4、GTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3'Primer#2:5'-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3'在引物兩端加5mer(斜體下劃線處)，這樣引物的GC含量為45.7%,L值為35,將這兩個數(shù)值帶入Tm值計算公式，得到其Tm為80.952(Tm=0.41x47.5-675/35+81.5),這樣的引物就可以用于突變實驗了。五、突變所用聚合酶及Buffer引物和質粒都準備好后，當然就是做PCR嘍，不過對于PCR的酶和buffer，不能用平時的，我們做PCR把整個質粒擴出來，延伸長度達到幾個K,所以要用那些GCbuf

5、fer或擴增長片段的buffer，另外，要用保真性能較好的PFU酶來擴增，防止引進新的突變。除了使用基因定點突變試劑盒，如Stratagene和塞百盛的試劑盒，但價格昂貴。可以使用高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速taq酶、Takara的PrimeSTARTMHSDNApolymerase。六、如何去掉PCR產(chǎn)物最簡單的方法就是用DpnI酶，DpnI能夠識別甲基化位點并將其酶切，我們用的模板一般都是雙鏈超螺旋質粒，從大腸桿菌里提出來的質粒一般都被甲基化保護起來(除非你用的是甲基化缺陷型的菌株)，而PCR產(chǎn)物都是沒有甲基化的，所以DpnI酶能夠特異性地切割模板(質粒)而不會影響PCR產(chǎn)物，從而

6、去掉模板留下PCR產(chǎn)物，所以提質粒時那些菌株一定不能是甲基化缺陷株。DpnI處理的時間最好長一點，最少一個小時吧，最好能有兩三個小時，因為如果模板處理得不干凈，哪怕只有那么一點點，模板直接在平板上長出來，就會導致實驗失敗。七、如何拿到質粒直接把通過DpnI處理的PCR產(chǎn)物拿去做轉化就行了，然后再篩選出陽性克隆，并提出質粒，拿去測序，驗證突變結果。八、圖示PCRzmplHindNott/nndonindStep1.InducingmutatlorqPCR啤-UsingMiutd-dircelI5tsp2.SsldctionH龍1用Mutarvm$fpJ-.TrannnnqtirHUsingeem

7、patentecjNickrecovering；九、定點突變操作步驟A誘導突變基因（PCR反應）以待突變的質粒為模板，用設計的引物及Muta-direct酶進行PCR擴增反應，誘導目的基因突變。1. 設計點突變引物。注參考引物設計指導2.準備模板質粒DNA注用dam+型菌株（例如DH5a菌株）作為宿主菌。在end+型菌株中常有克隆數(shù)低的現(xiàn)象，但是對突變效率沒有影響。提取質粒DNA時我們建議您使用本公司的質粒提純試劑盒。3.選項對照反應體系（50卩1反應體系）lOxReactionBuffer5g1pUC18controlplasmid(10ng/y1,total20ng)2g1Controlp

8、rimermix(20pmo1/p1)2g1dNTPmixture(each2.5mM)2g1dHQ381Muta-directEnzymelpl4.樣品反應體系（50卩1反應體系）lOxReactionBuffer5y1Sampleplasmid(10ng/pl,total20ng)21Sampleprimer(F)(lOpmol/yl)lylSampleprimer(R)(10pmo1/y1)lyldNTPmixture(each2.5mM)2yldH2O38ylMuta-directEnzyme1g15.PCR反應條件注按如下參數(shù)設置PCR擴增條件。CyclesTemperatureRe

9、actionTime1cycle95C30sec15cycle95C30sec55C1min72C1minperplasmidKb6.PCR擴增反應完成后冰育5分鐘，然后置于室溫(避免反復凍融)。注按下列提供的PCR條件進行擴增，控制PCR循環(huán)數(shù)。注意當突變點位點超過4個時會發(fā)生突變率降低的現(xiàn)象。MutationCycles12Nucleotide15cycles3Nucleotides18cyclesB突變質粒選擇PCR反應結束后使用MutazymeT酶消化甲基化質粒從而選擇突變質粒DNA。1. 準備PCR反應產(chǎn)物2. 加入1卩1(lOU/yl)MutazymeTM酶37°C溫育1小時。注當質粒DNA用量過多時Mutazyme酶可能發(fā)生與樣品反應不完全的現(xiàn)象。因此我們建議為了保證突變率請嚴格遵照實驗步驟進行操作。如果突變率低，可以適當延長反應時間或增加Mutazyme酶用量。C轉化反應完畢后在質粒DNA上會產(chǎn)