基因工程制藥89節(jié)

1、基因工程制藥89節(jié)一、基因工程菌的組建一、基因工程菌的組建構(gòu)建干擾素工程菌構(gòu)建干擾素工程菌流程圖流程圖第1頁/共42頁一、干擾素基因工程菌的組建流程誘生的白細胞誘生的白細胞 提取全提取全RNA RNA 通過寡通過寡dT-dT-纖維素柱纖維素柱 蔗糖密蔗糖密度梯度度梯度 獲得寡獲得寡A A的的mRNA mRNA 離離心提取心提取12s12s 的的 mRNAmRNA 逆轉(zhuǎn)錄成逆轉(zhuǎn)錄成cDNA cDNA 雙鏈雙鏈cDNAcDNA接上接上dTdT或或dGdG尾尾 pBR322pBR322質(zhì)粒質(zhì)粒 pBR322pBR322質(zhì)粒加上質(zhì)粒加上dAdA或或dCdC第2頁/共42頁 退火獲的雜交質(zhì)粒退火獲的雜交

2、質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌 擴增雜交質(zhì)粒擴增雜交質(zhì)粒 篩選抗青霉素但對氨芐篩選抗青霉素但對氨芐 青霉素敏感細菌克隆青霉素敏感細菌克隆用雜交翻譯法挑選用雜交翻譯法挑選含干擾素含干擾素cDNA克隆克隆 將干擾素將干擾素cDNA克隆入表達載體克隆入表達載體 在大腸桿菌中進行高效表達在大腸桿菌中進行高效表達第3頁/共42頁二、基因工程干擾素的制備二、基因工程干擾素的制備啟開種子啟開種子 制備種子液制備種子液 發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng) 粗提粗提精提精提 半成品制備半成品制備 半成品檢定半成品檢定 分裝分裝凍干凍干 成品檢定成品檢定 成品包裝成品包裝制備基因工程干擾素 的工藝流程圖第4頁/共42頁三、人2b型

3、干擾素(hIFN2b)工程菌株的組建過程 應(yīng)用PCR的方法，從人的染色體片段制備人2b干擾素的cDNA，將其克隆到pRC23表達載體上，構(gòu)建成重組表達質(zhì)粒pMZI2B，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，組建成工程菌株。由于pMZI2B的2b基因5端起始密碼ATG上游編制了一段SD順序，與PL啟動子上連接的SD順序組成雙SD順序，所以克隆基因的表達水平有明顯的提高。第5頁/共42頁1. hIFN-2b基因的獲得 用于克隆的人2b干擾素基因是應(yīng)用PCR方法從帶有人2b干擾素基因的染色體片段獲得的：模板DNA 4ng，引物為50pmol/L，各25L 4dNTP 4L，TaqDNA聚合酶2.5L，10PCR反

4、應(yīng)緩沖液10L，補水使總反應(yīng)體積為100L。反應(yīng)條件：變性溫度為94 ，退火溫度為50，鏈延伸溫度為72 。共30個循環(huán)。第6頁/共42頁 采用PCR技術(shù)擴增的人2b干擾素基因片段，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，其片段大小約相當于0.55kb。將該片段插入質(zhì)粒pGEM-3的EcoR I和BamH I的位點上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，培養(yǎng)后提取質(zhì)粒DNA，用引物SP6和T7從兩端測定DNA順序。結(jié)果證明其順序與文獻報道的基因順序是一致的。第7頁/共42頁2重組表達質(zhì)粒pMZI2B的構(gòu)建 pGEM-32bB質(zhì)粒經(jīng)EcoR I和BamH I雙酶解，切下2b-B片段，純化后克隆到質(zhì)粒pRC23的EcoR I

5、和BamH I位點上，構(gòu)建成重組表達質(zhì)粒pMZI2B(見圖)。第8頁/共42頁3人2b型干擾素工程菌株的形成與基因的表達 將重組表達質(zhì)粒pMZI2B轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a形成工程菌。經(jīng)37 搖床培養(yǎng)后進行抗病毒活性檢測。第9頁/共42頁 結(jié)果表明，具有雙SD序列的pMZI2B的抗病毒活性(1.69x104IUmL)，與僅具有單SD序列的pMZI2A(其組建過程同上)的抗病毒活性(3.46xl03IUmL)相比，有顯著的提高。這是因為基因的表達水平與轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個主要環(huán)節(jié)密切相關(guān)，而SD序列在蛋白質(zhì)翻譯中是核糖體的識別和結(jié)合部位，因此，增加SD序列，即增加了蛋白質(zhì)翻譯時核糖體的識別和結(jié)合機率。第1

6、0頁/共42頁2b2b干擾素的生產(chǎn)干擾素的生產(chǎn)4.4.發(fā)酵發(fā)酵 工程菌：工程菌：SW-IFN-2b/E.coli DH5，質(zhì)粒用，質(zhì)粒用P PL L啟動子，含氨芐青霉素抗性基因。培養(yǎng)基含啟動子，含氨芐青霉素抗性基因。培養(yǎng)基含1%蛋白胨、蛋白胨、0.5%酵母提取物、酵母提取物、0.5%NaCl。搖。搖床培養(yǎng)床培養(yǎng)3030，10h10h，培養(yǎng)發(fā)酵罐種子。，培養(yǎng)發(fā)酵罐種子。15L15L發(fā)酵發(fā)酵罐培養(yǎng)，罐培養(yǎng)， 30 30 ，8h8h。然后。然后42 42 ，2-3h2-3h即可即可完成發(fā)酵。每隔完成發(fā)酵。每隔2h2h取樣測取樣測ODOD或離心去上清稱量或離心去上清稱量菌體濕重。菌體濕重。第11頁/共

7、42頁 4.4.產(chǎn)品的提取與純化產(chǎn)品的提取與純化 4,000r/min4,000r/min離心離心3030分鐘，去上清，得濕分鐘，去上清，得濕菌泥。菌泥。 濕菌超聲破碎，離心，取沉淀部分，溶液處理，濕菌超聲破碎，離心，取沉淀部分，溶液處理，離心取上清液，上清超濾濃縮，離心取上清液，上清超濾濃縮， Sephadex G50Sephadex G50 分離。分離。 經(jīng)經(jīng)SDS-PAGESDS-PAGE檢查。檢查。 再經(jīng)再經(jīng)DE-52DE-52柱純化人干擾素柱純化人干擾素2b2b。第12頁/共42頁質(zhì)量控制標準和要求質(zhì)量控制標準和要求 半成品檢定半成品檢定干擾素效價測定干擾素效價測定蛋白質(zhì)含量測定蛋白

8、質(zhì)含量測定比活性比活性純度測定純度測定相對分子量測定相對分子量測定殘余外源性殘余外源性DNA含量測定含量測定殘余血清殘余血清IgG含量測定含量測定第13頁/共42頁殘余抗生素活性測定殘余抗生素活性測定紫外光譜掃描紫外光譜掃描肽圖測定肽圖測定等電點測定等電點測定除菌半成品應(yīng)做干擾素效價測定、無菌試驗、熱原質(zhì)試驗。除菌半成品應(yīng)做干擾素效價測定、無菌試驗、熱原質(zhì)試驗。 第14頁/共42頁 成品檢定成品檢定物理性狀物理性狀鑒別試驗鑒別試驗水分測定水分測定無菌試驗無菌試驗熱原試驗熱原試驗干擾素效價測定干擾素效價測定安全試驗安全試驗 美洲商陸美洲商陸第15頁/共42頁第九節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制 基因工

9、程藥物與傳統(tǒng)意義上的一般藥品的生產(chǎn)不同，首先它是利用活的細胞作為表達系統(tǒng)，所獲蛋白質(zhì)產(chǎn)品往往相對分子質(zhì)量較大，并具有復(fù)雜的結(jié)構(gòu)；許多基因工程藥物還是參與人體一些生理功能精密調(diào)節(jié)所必需的蛋白質(zhì)，極微量就可產(chǎn)生顯著效應(yīng)(每劑量的用量：白介素-12僅0.1 g， 干擾素也只有1030 g)，任何藥物性質(zhì)或劑量上的偏差，都可能貽誤病情甚至造成嚴重危害。第16頁/共42頁 基因工程藥物需要在宿主細胞中表達的外源基因，在轉(zhuǎn)錄或翻譯、精制、工藝放大過程中，都有可能發(fā)生變化，所以從原料制備過程產(chǎn)品的每一步都必須嚴格控制條件和鑒定質(zhì)量，確保產(chǎn)品符合質(zhì)量標準、安全有效。第17頁/共42頁一、原材料的質(zhì)量控制 原材

10、料的質(zhì)量控制是要確保編碼藥品的DNA序列的正確性，重組微生物來自單一克隆，所用質(zhì)粒純而穩(wěn)定，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的安全性和一致性。第18頁/共42頁 應(yīng)該了解：需要明確目的基因的來源、克隆經(jīng)過、限制性內(nèi)切酶酶切圖譜、核苷酸序列；應(yīng)提供表達載體的名稱、結(jié)構(gòu)、遺傳特性及其各組成部分(如復(fù)制子、啟動子)的來源與功能，構(gòu)建中所用位點的酶切圖譜，抗生素抗性標志物；應(yīng)提供宿主細胞的名稱、來源、傳代歷史、檢定結(jié)果及其生物學特性等；第19頁/共42頁需闡明載體引人宿主細胞的方法及載體在宿主細胞內(nèi)的狀態(tài)，如是否整合到染色體內(nèi)及在其中的拷貝數(shù)、宿主細胞與載體結(jié)合后的遺傳穩(wěn)定性；提供插入基因與表達載體兩側(cè)端控制區(qū)內(nèi)的核苷

11、酸序列，在生產(chǎn)過程中，啟動與控制克隆基因在宿主細胞中表達的方法及水平等。第20頁/共42頁二、培養(yǎng)過程的質(zhì)量控制 在工程菌菌種貯存中，要求種子克隆純而穩(wěn)定；在培養(yǎng)過程中，要求工程菌所含的質(zhì)粒穩(wěn)定，始終無突變；在重復(fù)生產(chǎn)發(fā)酵中，工程菌表達穩(wěn)定；始終能排除外源微生物污染。第21頁/共42頁 三、純化工藝過程的質(zhì)量控制 產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學試驗數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱原質(zhì)都控制在規(guī)定限度以下。 在精制過程中避免宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分等的污染，并用相應(yīng)的方法進行檢測。第22頁/共42頁四、目標產(chǎn)品的質(zhì)量控制 需要綜合利用生物化學、免疫學、微

12、生物學、細胞生物學和分子生物學等多門學科的理論與技術(shù)所建立起來的鑒定方法，以保證基因工程藥品安全有效。第23頁/共42頁1、產(chǎn)品的鑒定肽圖分析氨基酸成分分析部分氨基酸序列分析重組蛋白質(zhì)的濃度和相對分子質(zhì)量測定蛋白質(zhì)二硫鍵分析第24頁/共42頁重組蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品常用的鑒定方法第25頁/共42頁2純度分析純度分析是基因工程藥物質(zhì)量控制的關(guān)鍵項目，它包括目的蛋白質(zhì)含量測定和雜質(zhì)限量分析兩個方面的內(nèi)容。(1)目的蛋白質(zhì)含量測定 測定蛋白質(zhì)含量的方法可根據(jù)目的蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和生物學特性來設(shè)計。通常采用的方法有還原性及非還原性SDS-PAGE、等電點聚焦、各種HPLC、毛細管電泳(CE)等。第26頁/共

13、42頁 (2)雜質(zhì) 基因工程產(chǎn)物的雜質(zhì)包括蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩類。 通常需要檢測的雜質(zhì)及其檢測方法見下表。第27頁/共42頁基因工程產(chǎn)物中常見雜質(zhì)和污染物及其檢測方法第28頁/共42頁3生物活性測定 生物活性測定是保證基因工程藥物產(chǎn)品有效性的重要手段，往往需要進行動物體內(nèi)試驗和通過細胞培養(yǎng)進行體外效價測定。第29頁/共42頁4穩(wěn)定性檢驗 藥品的穩(wěn)定性是評價藥品有效性和安全性的重要指標之一，也是確定藥品貯藏條件和使用期限的主要依據(jù)。 采用恰當?shù)奈锢砘瘜W、生物化學和免疫化學技術(shù)對其活性成分的性質(zhì)進行全面鑒定，要準確檢測在貯藏過程中由于脫氨、氧化、磺?；?、聚合或降解等造成的分子變化。第30頁/共42頁

14、5產(chǎn)品一致性的保證 以重組DNA技術(shù)為主的生物制藥是一個十分復(fù)雜的過程，生產(chǎn)周期可達一個月甚至更長，影響因素較多。需要對原料生產(chǎn)產(chǎn)品的每一環(huán)節(jié)都進行嚴格的控制和質(zhì)量檢定，才能確保各批最終產(chǎn)品都是安全有效、含量和雜質(zhì)限度一致并符合標準。第31頁/共42頁五、產(chǎn)品的保存1、液態(tài)保存（1）、低溫保存（2）、穩(wěn)定pH條件下保存（3）、高濃度保存（4）、加保護劑保存第32頁/共42頁 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定劑有糖類、脂肪類、蛋白質(zhì)類、多元醇、有機溶劑等；有些蛋白質(zhì)在高離子強度的極性環(huán)境下才能保持其活性，加入中性鹽可穩(wěn)定這些蛋白質(zhì)；某些蛋白質(zhì)表面或內(nèi)部含有半胱氨酸巰基，容易被空氣中的氧緩慢氧化為次磺酸或二硫化物，使

15、蛋白質(zhì)的電荷或構(gòu)象發(fā)生改變而失活，可加入2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等，在真空或惰性氣體中密閉保存。第33頁/共42頁2、固態(tài)保存 固態(tài)蛋白質(zhì)比液態(tài)穩(wěn)定，一般蛋白質(zhì)含水量降到5時，在室溫或冰箱中保存均比較穩(wěn)定，但在37保存時活性則明顯下降。 長期保存蛋白質(zhì)的最好方法是把它們制成干粉或結(jié)晶。凍干粉或結(jié)晶都具有強抗熱性和穩(wěn)定性，在干燥器中，4以下可保存相當長的時間。第34頁/共42頁第三章 基因工程制藥思考題（4）1、設(shè)計一個實驗方案用基因工程的方法生產(chǎn)人干擾素2b。2、常用的基因工程藥品的保存方法有哪些？第35頁/共42頁 退火獲的雜交質(zhì)粒退火獲的雜交質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌 擴增雜交質(zhì)粒擴增

16、雜交質(zhì)粒 篩選抗青霉素但對氨芐篩選抗青霉素但對氨芐 青霉素敏感細菌克隆青霉素敏感細菌克隆用雜交翻譯法挑選用雜交翻譯法挑選含干擾素含干擾素cDNA克隆克隆 將干擾素將干擾素cDNA克隆入表達載體克隆入表達載體 在大腸桿菌中進行高效表達在大腸桿菌中進行高效表達第36頁/共42頁 退火獲的雜交質(zhì)粒退火獲的雜交質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化大腸桿菌轉(zhuǎn)化大腸桿菌 擴增雜交質(zhì)粒擴增雜交質(zhì)粒 篩選抗青霉素但對氨芐篩選抗青霉素但對氨芐 青霉素敏感細菌克隆青霉素敏感細菌克隆用雜交翻譯法挑選用雜交翻譯法挑選含干擾素含干擾素cDNA克隆克隆 將干擾素將干擾素cDNA克隆入表達載體克隆入表達載體 在大腸桿菌中進行高效表達在大腸桿菌中進行高效表達第37頁/共42頁 三、純化工藝過程的質(zhì)量控制 產(chǎn)品要有足夠的生理和生物學試驗數(shù)據(jù)，確證提純物分子批間保持一致性；外源蛋白質(zhì)、DNA與熱原質(zhì)都控制在規(guī)定限度以下。 在精制過程中避免宿主細胞蛋白質(zhì)、核酸、糖類、病毒、培養(yǎng)基成分等的污染，并用相應(yīng)的方法進行檢