藻類葉綠素a的測定(精)

1、藻類葉綠素a的測定一、實(shí)驗(yàn)名稱藻類葉綠素a的測定二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊灰唬ㄋ┉h(huán)境化學(xué)中葉綠素a測定意義在地表水環(huán)境的富營養(yǎng)化的研究中，葉綠素a是表征浮游植物生物量的最常用的指標(biāo)之一。同時，葉綠素a也是用來衡量水體水質(zhì)，評價(jià)水體富營養(yǎng)化水平的標(biāo)準(zhǔn)之一。三、實(shí)驗(yàn)原理葉綠素介紹葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要脂溶性色素，它在光合作用的光吸收中起核心作用所有光合器官中都含有葉綠素。葉綠素a和b都溶于乙醇、乙醚、丙酮等，難溶于石油醚，有旋光，主要吸收橙紅光和藍(lán)光。因此，這兩種光對光合作用最有效。當(dāng)植物細(xì)胞死亡后，葉綠素即游離出來，游離葉綠素不很穩(wěn)定，光、熱、酸、堿、氧、氧化劑等都會使其分解。在酸性條件下，葉綠素

2、中的鎂原子很容易被其他酸代替，綠色消失而變黃，葉綠素生成綠褐色的脫鎂葉綠素，加熱時反應(yīng)加速。葉綠素的實(shí)驗(yàn)室測量方法有分光光度法、熒光法、色譜法，其中以傳統(tǒng)的分光光度法應(yīng)用最為廣泛。根據(jù)葉綠體色素提取液對可見光譜的吸收，利用分光光度計(jì)在某一特定波長下測定其吸光度，即可用公式計(jì)算出提取液中各色素的含量。根據(jù)朗伯-比爾定律，某有色溶液的吸光度A與其中溶質(zhì)濃度C和液層厚度L成正比，即：A=aCL式中：a為比例常數(shù)。當(dāng)溶液濃度以百分比濃度為單位，液層厚度為1cm時，a為該物質(zhì)的吸光系數(shù)。各有色物質(zhì)溶液在不同波長下的吸光系數(shù)可通過測定已知濃度的純物質(zhì)在不同波長下的吸光度而求得。如果溶液中有數(shù)種吸光物質(zhì)，則

3、此混合液在某一波長下的總吸光度等于各組分在相應(yīng)波長下吸光度的總和，這就是吸光度的加和性。（1）單色法已知葉綠素a的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm，已知在波長663nm下，葉綠素a在該溶液中的比吸收系數(shù)分別為82.04,因此C/A663/82，可以計(jì)算出葉綠素a的含量（mg/L）。（2）三色法已知葉綠素a、b的80%丙酮提取液在紅光區(qū)的最大吸收峰分別為663nm和645nm，且兩吸收曲線相交于652nm處。因此測定提取液在645nm、663nm、652nm波長下的吸光值，根據(jù)經(jīng)驗(yàn)公式便可分別計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量。已知在波長663nm下，葉綠素a、b在該溶

4、液中的比吸收系數(shù)分別為82.04和9.27,在波長645nm下分別為16.75和45.60，可根據(jù)加和性原則列出以下關(guān)系式：A663=82.04Ca+9.27Cb(1)A645=16.75Ca+45.6Cb(2)式中A663、A664分別為波長663nm和645nm處測定葉綠素溶液的吸光度值；Ca、Cb分別為葉綠素a、b的濃度(g/L)。解聯(lián)立方程(1)、(2)可得以下方程：Ca=0.0127A663-0.00269A645(3)Cb=0.0229A645-0.00468A663(4)如把葉綠素含量單位由g/L改為mg/L，(3)、(4)式則可改寫為:Ca(mg/L)=12.7A663-2.6

5、9A645(5)Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663(6)葉綠素總量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663(7)葉綠素總量也可根據(jù)下式求導(dǎo)A652=34.5XCT由于652nm為葉綠素a與b在紅光區(qū)吸收光譜曲線的交叉點(diǎn)(等吸收點(diǎn))，兩者有相同的比吸收系數(shù)(均為34.5)，因此也可以在此波長下測定一次吸光度(A652)求出葉綠素總量：CT(g/L)=A652/34.5CT(mg/L)=A652X1000/34.5(8)因此，可利用(5)、(6)式可分別計(jì)算葉綠素a與b含量，利用(7)式或(8)式可計(jì)算葉綠素總量。從上可見，葉綠素提取后測定又可以分為兩種：

6、單色法(663nm)與三色法(645nm、663nm、652nm)。具體使用單色法還是三色法將依據(jù)測定對象而定。在標(biāo)準(zhǔn)方法、超聲波法、反復(fù)凍融法、延時提取法、熱丙酮法、丙酮加熱法、熱乙醇法、混合溶劑法等多種常見浮游植物葉綠素a測定方法中，針對實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的微囊藻(MicrocystisaeruginosO)水華樣品為研究對象進(jìn)行的葉綠素a含量測定。不管是從葉綠素a提取的完全性、測定數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性、試驗(yàn)操作的簡便性考慮等方面來看，包括國家標(biāo)準(zhǔn)方法在內(nèi)的大多數(shù)方法，存在操作耗時長、過程復(fù)雜、葉綠素提取不完全的缺點(diǎn)；而以丙酮加熱法測量葉綠素a的提取效率高、數(shù)據(jù)穩(wěn)定性好，操作耗時短、簡便，可推薦作為一種常

7、用的浮游植物葉綠素a的測量方法,尤其是應(yīng)急監(jiān)測或大批量水環(huán)境樣品測定時更顯現(xiàn)優(yōu)勢（表1）。表1不同提取方法實(shí)驗(yàn)耗時情況測疋方法標(biāo)準(zhǔn)方法延時提取法熱丙酮法反復(fù)凍融法超聲提取法丙酮加熱法熱乙醇法混合溶劑法P/(卩g-L-1)0.9741.0111.2161.4351.5171.6351.0261.397標(biāo)準(zhǔn)方差0.1490.1630.1570.0640.2530.0720.0770.126變異系數(shù)15.716.014.73.9116.53.265.249.42實(shí)驗(yàn)耗時/h8-8.57-7.59-9.524211.5-28-98-9丙酮加熱法測定的注意事項(xiàng)：隨著水浴加熱過程溫度的升高,丙酮的萃取能力

8、得到增強(qiáng),而且提取過程耗時短、操作簡單,樣品基本沒有損失。但在實(shí)驗(yàn)過程中,加熱的時間與溫度控制很重要,且需要采取避光措施。溫度過高、有光照條件以及加熱時間過長,均可能破壞葉綠素a的穩(wěn)定性。四、材料、儀器設(shè)備及試劑材料：待測浮游藻；本實(shí)驗(yàn)采用藍(lán)藻產(chǎn)毒銅綠微囊藻（左）與綠藻蛋白核小球藻（右）儀器設(shè)備：5mL或1mL移液槍、5mL或1mL槍頭、10mL離心管、離心機(jī)、錫箔紙、水浴鍋、溫度計(jì)、10mL刻度試管、比色皿、分光光度計(jì)。試劑：80丙酮。五、實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)一、確定藻密度的藍(lán)藻藻液。用移液槍吸取2mL藍(lán)藻液置于10mL離心管中，于12000rpm離心5min,用移液槍吸去上清液。藻餅于2mL80%

9、丙酮中重懸浮，后用錫箔紙完全包裹10mL離心管，并置于光線較暗處55°C水浴放置30min,后于12000rpm離心5min,吸出上清液轉(zhuǎn)移至10mL刻度試管中，并用80%丙酮定容于5mL,測定663nm處的光吸收值，測定結(jié)果按照CA=OD663/82，計(jì)算出葉綠素的含量（mg/L）。實(shí)驗(yàn)二、確定藻密度的綠藻藻液。用移液槍吸取2mL綠藻液置于10mL離心管中，于12000rpm離心5min,用移液槍吸去上清液。藻餅于2mL80%丙酮中重懸浮，后用錫箔紙完全包裹10mL離心管，并置于光線較暗處55°C水浴放置60min,后于12000rpm離心5min,吸出上清液轉(zhuǎn)移至10m

10、L刻度試管中，并用80%丙酮定容于5mL，測定663nm處的光吸收值，測定結(jié)果按照CA=A663/82，計(jì)算出葉綠素a的含量(mg/L)。用移液槍吸取2mL綠藻液置于10mL離心管中，于12000rpm離心5min，用移液槍吸去上清液。藻餅于2mL80%丙酮中重懸浮，后用錫箔紙完全包裹10mL離心管，并置于光線較暗處55°C水浴放置30min,后于12000rpm離心5min，吸出上清液轉(zhuǎn)移至10mL刻度試管中，并用80%丙酮定容于5mL,測定663nm、645nm、652nm處的光吸收值，測定結(jié)果按照三色法公式，可計(jì)算出葉綠素a、葉綠素b與總?cè)~綠素的含量(mg/L)。根據(jù)下式，計(jì)算

11、出原澡液中各葉綠素的含量(mg/L):l)=C(mg/L)x提取液總量(L)mg初始體積(L)根據(jù)下式，計(jì)算出不同藻液中單個細(xì)胞各葉綠素的含量(g/個細(xì)胞):Ch(lg/細(xì)胞-1)=C(mg/L)x提取液總量(L)藻細(xì)胞總數(shù)(個)六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理在不同波長下分別測藍(lán)藻和綠藻的吸光度，數(shù)據(jù)記錄如下表663nm645nm652nm藍(lán)藻0.772綠藻0.0520.0290.039對藍(lán)藻的葉綠素計(jì)算用公式Ca=OD663/82，計(jì)算結(jié)果見下表45.6A663對綠藻的葉綠素a、葉綠素b與總?cè)~綠素分別用公式：Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A

12、663CT(mg/L)=A652xl000/34.5計(jì)算結(jié)果如下表：葉綠素a(mg/L)葉綠素b(mg/L)總?cè)~綠素(mg/L)藍(lán)藻0.00940.0094綠藻(三色法)0.58240.42071.0031綠藻(單色法)0.63410.63601.2701根據(jù)下式，計(jì)算出原藍(lán)藻和綠藻溶液中各葉綠素的含量(mg/L)：Ch(lmg/L)=C(mg/L)x提取液總量(L)初始體積(L)Ch（lg/細(xì)胞-1）=C（mg/L）提取液總量（L）藻細(xì)胞總數(shù)（個）結(jié)果見下表：葉綠素a（mg/L）葉綠素b（mg/L）總?cè)~綠素（mg/L）藍(lán)藻0.02350.0235綠藻1.45601.05182.5078根據(jù)下

13、式，計(jì)算出藍(lán)藻和綠藻中單個細(xì)胞各葉綠素的含量（g/個細(xì)胞）:藍(lán)藻藻液密度為3.3x107個/mL，即每毫升藍(lán)藻藻液中含有3.3x107個藍(lán)藻細(xì)胞。綠藻藻液密度為8.4x107個/mL，即每毫升綠藻藻液中含有8.4x107個綠藻細(xì)胞。結(jié)果見下表:葉綠素a（g/細(xì)胞）葉綠素b（g/細(xì)胞）總?cè)~綠素（g/細(xì)胞）藍(lán)藻7.1x10-137.1x10-13綠藻1.735x10-111.252x10-112.987x10-11七、結(jié)果與討論（1）請說明藍(lán)藻只采用單色法測定葉綠素的原因。單色分光光度法測定葉綠素含量時，要測定665和750nm處的吸光度。藍(lán)藻只含有葉綠素a,不含有葉綠素b所以只采用單色法測定葉綠素。（2）請比較綠藻單色法與三色法測定結(jié)果的差異，并說明理由。從單色法與三色法的測定結(jié)果比較得出，一般單色法測定的Chl-a的數(shù)值要高于三色法。因?yàn)?，單色法?jì)算所得的葉綠素a的含量是在663nm處所有吸光的葉綠素含量，不僅僅包括葉綠素a，還有部分葉綠素b,而三色法計(jì)算所得的葉綠素a減去了在663nm處吸