聚合酶鏈反應(yīng)

1、第七章第七章 聚合酶鏈反應(yīng)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction ,PCR) DNADNA的的復(fù)制復(fù)制 (replication)(replication) 由親代由親代DNADNA合成兩個相同的子代合成兩個相同的子代 DNADNA的過的過程。程。 復(fù)制復(fù)制親代親代DNA子代子代DNA 一、一、PCR的基本原理的基本原理A AG GA AA AC CT TT TT TC CT TT TG GA AA AA AG GA AA AC CT TT TT TC CT TT TG GA AA AT TC CT TT TG GA AA AA AG GA AA AC CT TT T

2、母代母代DNADNA子代子代DNADNA基本原理：基本原理： 在模板、引物、在模板、引物、4種種dNTP和賴熱和賴熱DNA聚合酶存在的條件下，特異擴(kuò)增位聚合酶存在的條件下，特異擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的酶促區(qū)段的酶促合成反應(yīng)。合成反應(yīng)。基本步驟：基本步驟： 變性：加熱使雙鏈變性：加熱使雙鏈DNA變?yōu)閱捂溩優(yōu)閱捂?退火：降溫使引物和互補(bǔ)模板在局部退火：降溫使引物和互補(bǔ)模板在局部 形成雜交鏈形成雜交鏈 延伸：耐熱延伸：耐熱DNA聚合酶按聚合酶按53方向方向催化以引物為起始點的延伸反應(yīng)催化以引物為起始點的延伸反應(yīng)一、一、PCR的基本原理的基本原理 示意圖示意圖二、二、

3、PCR引物設(shè)計引物設(shè)計PCR反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個關(guān)鍵條件在于引物的正確設(shè)反應(yīng)成功擴(kuò)增的一個關(guān)鍵條件在于引物的正確設(shè)計。計。引物設(shè)計的總原則就是提高擴(kuò)增的效率和特異性。引物設(shè)計的總原則就是提高擴(kuò)增的效率和特異性。其效率和特異性取決于兩個方面，一是引物與模板的其效率和特異性取決于兩個方面，一是引物與模板的特異結(jié)合，二是聚合酶對引物的有效延伸。特異結(jié)合，二是聚合酶對引物的有效延伸。PCR反應(yīng)中有兩條引物，即反應(yīng)中有兩條引物，即5引物和引物和3引物。設(shè)計引物引物。設(shè)計引物時，通常以信息鏈為基準(zhǔn)，時，通常以信息鏈為基準(zhǔn)，5引物與位于待擴(kuò)增片段引物與位于待擴(kuò)增片段5上游的一小段上游的一小段DNA序列相同，以

4、信息鏈的互補(bǔ)鏈為模序列相同，以信息鏈的互補(bǔ)鏈為模板，引導(dǎo)信息鏈的合成，板，引導(dǎo)信息鏈的合成，3引物與擴(kuò)增片段引物與擴(kuò)增片段3端的一小端的一小段段DNA序列互補(bǔ)，引導(dǎo)互補(bǔ)鏈的合成。序列互補(bǔ)，引導(dǎo)互補(bǔ)鏈的合成。PCR反應(yīng)擴(kuò)增反應(yīng)擴(kuò)增的就是這一對引物之間的的就是這一對引物之間的DNA片段。片段。（一）（一）PCR引物設(shè)計原則引物設(shè)計原則1、引物長度一般為、引物長度一般為1530個核苷酸。個核苷酸。引物過短會使引物過短會使PCR的特異性的特異性降低，過長會提高相應(yīng)的退火溫度，并使延伸溫度超過降低，過長會提高相應(yīng)的退火溫度，并使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶的最適溫度聚合酶的最適溫度74,亦會影響產(chǎn)物的

5、生成，且合成引物的成本亦會影響產(chǎn)物的生成，且合成引物的成本增加。增加。2、引物中的堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶的堆積、引物中的堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤，嘧啶的堆積現(xiàn)象?，F(xiàn)象。尤其是引物的尤其是引物的3端不應(yīng)有連續(xù)端不應(yīng)有連續(xù)3個個G和和C。否則會使。否則會使 引物在引物在模板的模板的G+C富集序列區(qū)錯誤配對。引物中富集序列區(qū)錯誤配對。引物中G+C的含量的含量 在在4555%左右。設(shè)計引物時要考慮左右。設(shè)計引物時要考慮3端和端和5端端 引物具有相似的引物具有相似的Tm值。值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物長度要確保解鏈溫度不低于）。引物長度要確保解鏈溫度不低于54C3、

6、引物自身內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。、引物自身內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。按按經(jīng)驗，引物自身存在的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過經(jīng)驗，引物自身存在的連續(xù)互補(bǔ)序列，一般不超過3bp。4、兩個引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列、兩個引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免，尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊。端的互補(bǔ)重疊。5、引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。、引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。尤其是引物尤其是引物3末端末端連續(xù)連續(xù)8個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致個堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。非特異性擴(kuò)增。6、引物、引物3端堿基是引發(fā)

7、延伸的起點，因此一定要與模板端堿基是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板DNA配對。配對。引物引物3端的最佳堿基選擇是端的最佳堿基選擇是G和和C。因為它們形成的堿基配對比較。因為它們形成的堿基配對比較穩(wěn)定。穩(wěn)定。7、引物的、引物的5端可以修飾，端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點，用生如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素，熒光物質(zhì)，地高辛標(biāo)記，加入其它短序列包括起始密碼子，物素，熒光物質(zhì)，地高辛標(biāo)記，加入其它短序列包括起始密碼子，終止密碼子等。在終止密碼子等。在PCR的起始反應(yīng)中，引物的起始反應(yīng)中，引物5端游離的堿基并不端游離的堿基并不影響引導(dǎo)新生鏈影響引導(dǎo)新生鏈DNA合成的能力。但在后

8、續(xù)的擴(kuò)增循環(huán)中，這些合成的能力。但在后續(xù)的擴(kuò)增循環(huán)中，這些與初始模板不配對的序列被帶到與初始模板不配對的序列被帶到PCR產(chǎn)物的雙鏈中去，所以如此產(chǎn)物的雙鏈中去，所以如此引物參與的引物參與的PCR產(chǎn)物，既含有目的擴(kuò)增片段又含有兩側(cè)引入的核產(chǎn)物，既含有目的擴(kuò)增片段又含有兩側(cè)引入的核苷酸序列。苷酸序列。（二）引物設(shè)計的方法（二）引物設(shè)計的方法現(xiàn)在現(xiàn)在PCR引物設(shè)計大都通過計算機(jī)軟件進(jìn)行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛞镌O(shè)計大都通過計算機(jī)軟件進(jìn)行?？梢灾苯犹峤荒０逍蛄械教囟ňW(wǎng)頁，列到特定網(wǎng)頁，(在線引物設(shè)計的網(wǎng)站有：在線引物設(shè)計的網(wǎng)站有：http:/cbr-rbc.nrc-cnrc.ca/cgi-bin/pri

9、mer3www.cgi;/cgi-bin/SGD/web-primer;http:/bioinformatics.weizmann.ac.il/cgi-bin/primer/primer3.cgi;/urolab/methprimer/index1.html;/rawprimer.html)得到設(shè)計好的引物，也可得到設(shè)計好的引物，也可以在本地計算機(jī)上運行引物設(shè)計專業(yè)軟件。軟件的引物設(shè)計功能主以在本地計算機(jī)上運行引物設(shè)計專業(yè)軟件。軟件的引物設(shè)計功能主要體

10、現(xiàn)在兩個方面：首先是引物分析評價功能，該功能只有少數(shù)商要體現(xiàn)在兩個方面：首先是引物分析評價功能，該功能只有少數(shù)商業(yè)版軟件能夠做到，其中以業(yè)版軟件能夠做到，其中以“Oligo 6”最為優(yōu)秀；其次是引物的自動最為優(yōu)秀；其次是引物的自動搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點不同，因此自動搜索的結(jié)果搜索功能，各種軟件在這方面的側(cè)重點不同，因此自動搜索的結(jié)果也不盡相同。也不盡相同。 。三、模板制備三、模板制備 PCR的模板可以是的模板可以是DNA，也可以是，也可以是RNA。當(dāng)用當(dāng)用RNA作模板時，首先作模板時，首先要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，然后再進(jìn)行正常的，然后再進(jìn)行正常的PCR循環(huán)。大多數(shù)

11、用途的循環(huán)。大多數(shù)用途的PCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，對對DNA模板的要求并不嚴(yán)格。模板的要求并不嚴(yán)格。首先對純度要求不嚴(yán)。大量首先對純度要求不嚴(yán)。大量的實驗數(shù)據(jù)表明存在一定量的蛋白質(zhì)，或的實驗數(shù)據(jù)表明存在一定量的蛋白質(zhì)，或SDS等對實驗過程影響不大，所等對實驗過程影響不大，所以只要沒有交叉污染，模板以只要沒有交叉污染，模板DNA的制備可以不必像克隆、酶切、連接、的制備可以不必像克隆、酶切、連接、標(biāo)記等反應(yīng)所用標(biāo)記等反應(yīng)所用DNA制備那樣嚴(yán)格。其次，模板用量很低，理論上制備那樣嚴(yán)格。其次，模板用量很低，理論上102104拷貝的模板是可滿足各種要求的拷貝的模板是可滿足各種要求的PCR反應(yīng)。由于種種原因，

12、準(zhǔn)備反應(yīng)。由于種種原因，準(zhǔn)備的模板量要求達(dá)一定水平。一方面可減少由于實驗操作和實驗精確度方面的模板量要求達(dá)一定水平。一方面可減少由于實驗操作和實驗精確度方面等原因而引起的擴(kuò)增失敗，同時用作擴(kuò)增的模板等原因而引起的擴(kuò)增失敗，同時用作擴(kuò)增的模板DNA量越多，由于交叉量越多，由于交叉污染引起的反應(yīng)失敗的可能性小。污染引起的反應(yīng)失敗的可能性小。（一）（一）DNA模板制備模板制備去垢劑破壞細(xì)胞，除雜質(zhì)，乙醇沉淀核酸去垢劑破壞細(xì)胞，除雜質(zhì)，乙醇沉淀核酸水煮沸溶解細(xì)胞水煮沸溶解細(xì)胞要求并不嚴(yán)格要求并不嚴(yán)格模板用量低，哺乳動物基因組模板用量低，哺乳動物基因組DNA1g，質(zhì)，質(zhì)粒粒DNA0.1ng(二二)RNA

13、模板的制備模板的制備RNA提取試劑盒提取試劑盒酸性硫氰酸胍酸性硫氰酸胍-酚酚-氯仿法氯仿法異硫胍氯化銫密度梯度分離法異硫胍氯化銫密度梯度分離法SDS-酚酚-氯仿法氯仿法注意防止注意防止RNA水解水解（三）模板的取材三）模板的取材病原體標(biāo)本：病毒、細(xì)菌、真菌、螺旋體、病原體標(biāo)本：病毒、細(xì)菌、真菌、螺旋體、立克次體、支原體等立克次體、支原體等病理生理標(biāo)本：細(xì)胞、血液、絨毛、尿液病理生理標(biāo)本：細(xì)胞、血液、絨毛、尿液等等法醫(yī)學(xué)標(biāo)本：血斑、精斑、毛發(fā)法醫(yī)學(xué)標(biāo)本：血斑、精斑、毛發(fā)考古標(biāo)本考古標(biāo)本四、四、PCR基本反應(yīng)基本反應(yīng)（一）以（一）以DNA為模板的反應(yīng)為模板的反應(yīng)反應(yīng)體積：反應(yīng)體積：50100l緩沖

14、液緩沖液引物引物底物：底物：4種種dNTP模板：模板：102105拷貝拷貝TaqDNA聚合酶聚合酶礦物油礦物油其中模板其中模板DNA的用量必須根據(jù)其分子量的大小加以調(diào)的用量必須根據(jù)其分子量的大小加以調(diào)整。整。（二）以（二）以mRNA為模板的反應(yīng)為模板的反應(yīng)以以mRNA為原始模板進(jìn)行的為原始模板進(jìn)行的PCR反應(yīng)稱為逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)稱為逆轉(zhuǎn)錄PCR一）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系一）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系體積：體積：20 l緩沖液緩沖液底物：底物：4種種dNTP引物：引物：oligo(dT)1218模板：模板：RNA逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶其他試劑：其他試劑：RNA酶抑制劑，酶抑制劑，MgCl2.DTT.牛血清白蛋白牛血清白蛋白二）

15、二）PCR反應(yīng)體系同以反應(yīng)體系同以DNA模模 板的反應(yīng)體系板的反應(yīng)體系 （三）（三）PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律產(chǎn)物的積累規(guī)律 在在PCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，DNA擴(kuò)增過程遵循酶的催化動力學(xué)原理。擴(kuò)增過程遵循酶的催化動力學(xué)原理。反應(yīng)初期，目的反應(yīng)初期，目的DNA片段呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的片段呈指數(shù)擴(kuò)增。隨著目的DNA產(chǎn)物逐產(chǎn)物逐漸積累，在引物一模板與漸積累，在引物一模板與DNA聚合酶達(dá)到一定比例時，酶的聚合酶達(dá)到一定比例時，酶的催化反應(yīng)趨于飽和，此時擴(kuò)增催化反應(yīng)趨于飽和，此時擴(kuò)增DNA片段的增加減慢進(jìn)入相對片段的增加減慢進(jìn)入相對穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，即出現(xiàn)“停滯效應(yīng)停滯效應(yīng)”，又稱，又稱“平臺期平臺期”

16、。到達(dá)平。到達(dá)平臺期所需臺期所需PCR循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)、PCR擴(kuò)擴(kuò)增效率、增效率、DNA聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的競爭等聚合酶種類和活性、以及非特異產(chǎn)物的競爭等因素。到達(dá)平臺期前，因素。到達(dá)平臺期前，TaqDNA聚合酶一般要進(jìn)行聚合酶一般要進(jìn)行25次以上次以上PCR循環(huán)。循環(huán)。 多數(shù)情況下，平臺期在多數(shù)情況下，平臺期在PCR反應(yīng)中不可避免。反應(yīng)中不可避免。 PCR產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖產(chǎn)物的積累規(guī)律示意圖 五、五、PCR反應(yīng)條件的控制反應(yīng)條件的控制(一一) 標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)流程反應(yīng)流程1.反應(yīng)體系：標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系：標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體積為反應(yīng)

17、體積為50100l,其其中含有緩沖液，中含有緩沖液，4種底物，引物，種底物，引物，DNA模板和模板和耐熱耐熱DNA聚合酶。聚合酶。2.反應(yīng)步驟：加入各種試劑，反應(yīng)步驟：加入各種試劑，950C熱變性熱變性510分鐘，使模板分鐘，使模板DNA充分變性，同時除去蛋白酶，充分變性，同時除去蛋白酶，氯仿對耐熱氯仿對耐熱DNA聚合酶的影響。然后加入聚合酶的影響。然后加入2UTaqDNA聚合酶，加聚合酶，加50l液體石蠟封蓋反應(yīng)液體石蠟封蓋反應(yīng)體系，防止液體揮發(fā)。進(jìn)行體系，防止液體揮發(fā)。進(jìn)行PCR反應(yīng)。但反應(yīng)。但PE9700儀設(shè)計了熱蓋，不需加液體石蠟。儀設(shè)計了熱蓋，不需加液體石蠟。(二二)循環(huán)參數(shù)數(shù)循環(huán)參

18、數(shù)數(shù)變性溫度和時間：按模板變性溫度和時間：按模板DNA復(fù)雜程度來調(diào)整變性溫度復(fù)雜程度來調(diào)整變性溫度和時間。和時間。94 ，1min；95 ，30 s ；97 ，15 s ；退火溫度和時間：退火溫度和時間：4555 ，30s1min延伸溫度和時間：延伸溫度和時間：72 ，時間因擴(kuò)增片段的長度而異：，時間因擴(kuò)增片段的長度而異：1kb，1min；34kb,34min循環(huán)次數(shù)：循環(huán)次數(shù)：2530次，視最初靶分子濃度而定次，視最初靶分子濃度而定兩步兩步PCR：將退火和延伸溫度合并為一個溫度，采用二：將退火和延伸溫度合并為一個溫度，采用二溫式兩步溫式兩步PCR(三三)PCR反應(yīng)成分反應(yīng)成分1.PCR反應(yīng)的

19、緩沖液：反應(yīng)的緩沖液：1050mmol/L Tris-Cl 緩沖緩沖液，液，72 時時pH7.2,調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，使值，使Taq DNA聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。緩沖液含聚合酶的作用環(huán)境維持偏堿性。緩沖液含50mmol/L的的KCl可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將可促進(jìn)引物退火，大于此濃度將會抑制會抑制TaqDNA聚合酶的活性。加入適量二甲基聚合酶的活性。加入適量二甲基亞砜或甲酰胺有利于破壞模板的二級結(jié)構(gòu)。亞砜或甲酰胺有利于破壞模板的二級結(jié)構(gòu)。 2.鎂離子濃度：鎂離子濃度：1.5mmol/L Taq DNA聚合酶活性需要聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+ 濃度過低，濃度過低，會

20、顯著降低酶活性。會顯著降低酶活性。Mg2+濃度過高又使酶催化非特濃度過高又使酶催化非特異性擴(kuò)增增強(qiáng)。異性擴(kuò)增增強(qiáng)。Mg2+濃度還會影響引物的退火、模濃度還會影響引物的退火、模板與板與PCR產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響擴(kuò)增片段的產(chǎn)產(chǎn)物的解鏈溫度，從而影響擴(kuò)增片段的產(chǎn)率。率。在在PCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，Mg2+的總量應(yīng)比的總量應(yīng)比dNTPs的濃度高。的濃度高。其原因是引物、模板、其原因是引物、模板、dNTP分子中的磷酸基團(tuán)可分子中的磷酸基團(tuán)可與與Mg2+結(jié)合而降低游離結(jié)合而降低游離Mg2+濃度，從而影響濃度，從而影響Taq DNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。 常用常用1.5mmol/L 。 3.底物濃度

21、：底物濃度：20200mol/L dNTP溶液具有較強(qiáng)的酸性。使用時應(yīng)用溶液具有較強(qiáng)的酸性。使用時應(yīng)用NaOH將將pH值值調(diào)至調(diào)至7.07.5，分裝小管，于，分裝小管，于-20存放，過多凍融會使存放，過多凍融會使dNTP產(chǎn)生降解。產(chǎn)生降解。 在在PCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，dNTPs濃度在濃度在20200mol/L, dNTP濃度濃度過高可加快反應(yīng)速度，同時還可增加堿基的錯誤摻入率和過高可加快反應(yīng)速度，同時還可增加堿基的錯誤摻入率和實驗成本。反之，低濃度的實驗成本。反之，低濃度的dNTP會導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降，會導(dǎo)致反應(yīng)速度的下降，但可提高反應(yīng)的特異性及實驗的精確性。但可提高反應(yīng)的特異性及實驗的精確性

22、。4種種dNTP在使用在使用時必須以等摩爾數(shù)濃度配制，以減少錯配誤差和提高使用時必須以等摩爾數(shù)濃度配制，以減少錯配誤差和提高使用效率。效率。 4.耐熱耐熱DNA聚合酶：聚合酶：2.55 u在在PCR反應(yīng)中，反應(yīng)中，DNA聚合酶是最關(guān)鍵的因素之聚合酶是最關(guān)鍵的因素之一。一。PCR發(fā)明的初期使用的發(fā)明的初期使用的DNA聚合酶是聚合酶是Klenow片段、片段、T4DNA聚合酶和聚合酶和T7DNA聚合酶，聚合酶，它們因?qū)岬姆€(wěn)定性差而未得到廣泛應(yīng)用。直它們因?qū)岬姆€(wěn)定性差而未得到廣泛應(yīng)用。直到耐熱的到耐熱的DNA聚合酶聚合酶(Taq DNA polymerase) 應(yīng)應(yīng)用于用于PCR反應(yīng)，才使這一技術(shù)

23、得到迅速發(fā)展和反應(yīng)，才使這一技術(shù)得到迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。廣泛應(yīng)用。 （1）TaqDNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶在聚合酶在7580具有最高的聚合酶活性。具有最高的聚合酶活性。7580每個酶分子每秒可延伸約每個酶分子每秒可延伸約150個核苷酸，個核苷酸，70時延伸速度在時延伸速度在60個核苷酸個核苷酸/秒以上。秒以上。55時為時為22個核苷酸個核苷酸/秒；秒；37和和22時分別為時分別為1.5個和個和0.25個核苷酸個核苷酸/秒。溫度超過秒。溫度超過80時，合成速度明顯下時，合成速度明顯下降，可能與引物和模板結(jié)合穩(wěn)定性遭到破壞有關(guān)。降，可能與引物和模板結(jié)合穩(wěn)定性遭到破壞有關(guān)。Taq DN

24、A聚合酶沒有聚合酶沒有35外切酶活性。沒有校正功能的。外切酶活性。沒有校正功能的。對于對于30次循環(huán)的次循環(huán)的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。此酶的錯配率為擴(kuò)增反應(yīng)。此酶的錯配率為0.1%0.25%。Taq DNA聚合酶體外擴(kuò)增聚合酶體外擴(kuò)增DNA的忠實性是所有已的忠實性是所有已知忠實性的知忠實性的DNA聚合酶中最低的。因此在特別考慮擴(kuò)增聚合酶中最低的。因此在特別考慮擴(kuò)增產(chǎn)物忠實性，推薦采用具有校對功能的其他耐熱的產(chǎn)物忠實性，推薦采用具有校對功能的其他耐熱的DNA聚合酶。如聚合酶。如Vent和和Pfu DNA聚合酶。聚合酶。Taq DNA聚合酶具有類似未端轉(zhuǎn)移酶的功能，能催化聚合酶具有類似未端轉(zhuǎn)移酶的功能，能

25、催化dNTP加到加到DNA的的3-OH端。端。但對但對4種種dNTP聚合到聚合到3-未端未端的能力不同，的能力不同，對對dATP的聚合能力高于其他的聚合能力高于其他3種核苷酸，因種核苷酸，因此此PCR產(chǎn)物的末端總是帶有兩個產(chǎn)物的末端總是帶有兩個A。我們利用它的這種特。我們利用它的這種特性，在構(gòu)建性，在構(gòu)建T載體時，在反應(yīng)體系載體時，在反應(yīng)體系 中只加一種底物，即只中只加一種底物，即只加加dTTP。此酶就催化在載體末端加上。此酶就催化在載體末端加上dT,這種載體即可直這種載體即可直接用來克隆接用來克隆PCR 產(chǎn)物。產(chǎn)物。（2）Tth DNA聚合酶聚合酶在在95 0C半衰期為半衰期為20分鐘，具有

26、逆轉(zhuǎn)錄酶分鐘，具有逆轉(zhuǎn)錄酶活性，可簡化活性，可簡化RT-PCR。但不具。但不具35 外外切酶活性，沒有校對功能，催化聚合反切酶活性，沒有校對功能，催化聚合反應(yīng)的錯誤摻入率為應(yīng)的錯誤摻入率為1/500（3）Vent DNA聚合酶聚合酶該酶在該酶在1000C時半衰期達(dá)時半衰期達(dá)95分鐘，分鐘，97.50C時半衰期長達(dá)時半衰期長達(dá)130分鐘，其擴(kuò)增產(chǎn)物的長分鐘，其擴(kuò)增產(chǎn)物的長度可達(dá)度可達(dá)1013kb。Vent DNA聚合酶具有聚合酶具有35 外切酶活性，具有校對功能，錯誤外切酶活性，具有校對功能，錯誤摻入率為摻入率為1/31000，忠實性比，忠實性比TaqDNA聚聚合酶提高合酶提高5 10倍。倍。（

27、4）Pfu DNA聚合酶聚合酶此酶耐熱性極好，在此酶耐熱性極好，在97.50C半衰期大于半衰期大于3小時，具有小時，具有35 外切酶活性，催化外切酶活性，催化DNA合成的忠實性比合成的忠實性比Taq DNA聚合酶高聚合酶高12倍。倍。 4.引物：引物：0.10.5 mol/L PCR 反應(yīng)引物濃度為反應(yīng)引物濃度為0.10.5mol/L,引物與引物與模板的摩爾比至少為模板的摩爾比至少為108：1。如此過量的引物如此過量的引物才能確保模板才能確保模板DNA一旦變性就與引物退火，一旦變性就與引物退火，而不能與其自身退火。但引物濃度偏高會引起而不能與其自身退火。但引物濃度偏高會引起錯配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)

28、增，且可增加引物之間錯配和非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，且可增加引物之間形成二聚體的幾率，降低擴(kuò)增效率。但如果該形成二聚體的幾率，降低擴(kuò)增效率。但如果該比例太低，比例太低，PCR效率也會降低。效率也會降低。 5.模板模板在一定范圍內(nèi)在一定范圍內(nèi)PCR產(chǎn)量隨模板濃度的升高而顯產(chǎn)量隨模板濃度的升高而顯著升高，但模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異著升高，但模板濃度過高會導(dǎo)致反應(yīng)的非特異性增加。為保證反應(yīng)特異性，一般采用微克水性增加。為保證反應(yīng)特異性，一般采用微克水平的基因組平的基因組DNA或或102 105拷貝的待擴(kuò)增片段作拷貝的待擴(kuò)增片段作為模板為模板 6.其他因素其他因素1）熱啟動：提高擴(kuò)增的特異性）熱啟動：提

29、高擴(kuò)增的特異性2）添加劑：消除引物與模板的二級結(jié)構(gòu)，降低）添加劑：消除引物與模板的二級結(jié)構(gòu)，降低DNA的解鏈溫度，增進(jìn)的解鏈溫度，增進(jìn)DNA復(fù)性時的特異配對，復(fù)性時的特異配對，增加或改進(jìn)增加或改進(jìn)DNA聚合酶的穩(wěn)定性，可添加一些聚合酶的穩(wěn)定性，可添加一些添加劑。添加劑。3）液體石蠟：防止反應(yīng)液蒸發(fā)后引起的冷卻與）液體石蠟：防止反應(yīng)液蒸發(fā)后引起的冷卻與反應(yīng)成分的改變。反應(yīng)成分的改變。六、六、PCR實驗中應(yīng)注意的事項實驗中應(yīng)注意的事項 由于由于PCR反應(yīng)極強(qiáng)的擴(kuò)增能力和檢測的靈反應(yīng)極強(qiáng)的擴(kuò)增能力和檢測的靈敏性，微量樣品的污染便有可能導(dǎo)致假陽性結(jié)敏性，微量樣品的污染便有可能導(dǎo)致假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。果的

30、出現(xiàn)。（一）（一）PCR實驗室的設(shè)置實驗室的設(shè)置樣品制備區(qū)樣品制備區(qū)：這個區(qū)域?qū)ｉT用于制備模板，要求：這個區(qū)域?qū)ｉT用于制備模板，要求：PCR產(chǎn)物和帶有待擴(kuò)增序列的產(chǎn)物和帶有待擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個克隆不能在這個區(qū)域操作，區(qū)域操作，用于樣品處理的工具不能被用作普通分用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。子克隆的工具，也不能用于操作靶序列。在提取在提取DNA樣品和樣品和RNA樣品時要帶手套，并要經(jīng)常更換。樣品時要帶手套，并要經(jīng)常更換。純化樣品對污染的風(fēng)險有極大的影響。純化樣品對污染的風(fēng)險有極大的影響。 PCR操作區(qū)：操作區(qū)：PCR儀應(yīng)單獨放在另一間實驗室。儀

31、應(yīng)單獨放在另一間實驗室。另外，在另外，在PCR反應(yīng)前應(yīng)對準(zhǔn)備和保持干凈的反應(yīng)前應(yīng)對準(zhǔn)備和保持干凈的PCR成分給予高度重視。成分給予高度重視。所用的所有溶液應(yīng)所用的所有溶液應(yīng)該沒有核酸和核酸酶；該沒有核酸和核酸酶；所用所用PCR試劑中的水試劑中的水都是高質(zhì)量的新鮮蒸餾水；都是高質(zhì)量的新鮮蒸餾水；所用試劑都應(yīng)大所用試劑都應(yīng)大體積配制，分裝保存（一次用量）；體積配制，分裝保存（一次用量）；所用吸所用吸頭和試管均為一次性并是滅菌過的。所用器皿頭和試管均為一次性并是滅菌過的。所用器皿和塑料制品都要嚴(yán)格消毒。和塑料制品都要嚴(yán)格消毒。反應(yīng)產(chǎn)物分析區(qū)：反應(yīng)產(chǎn)物分析區(qū)：在這區(qū)域中所用的試在這區(qū)域中所用的試劑，一

32、次性器材和儀器都必須專門用于劑，一次性器材和儀器都必須專門用于PCR產(chǎn)物的分析，絕對不能把這一區(qū)域產(chǎn)物的分析，絕對不能把這一區(qū)域的試劑或儀器用于樣品的制備，的試劑或儀器用于樣品的制備，PCR反反應(yīng)前的操作。應(yīng)前的操作。 （二）設(shè)置嚴(yán)格對照（二）設(shè)置嚴(yán)格對照陽性對照：陽性陽性對照：陽性DNA模板模板陰性對照：陰性陰性對照：陰性DNA模板模板試劑對照：無試劑對照：無DNA模板模板（三）陰性結(jié)果應(yīng)采取的措施（三）陰性結(jié)果應(yīng)采取的措施用第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增用第一次擴(kuò)增的產(chǎn)物作模板進(jìn)行第二次擴(kuò)增增加增加TaqDNA聚合酶的濃度聚合酶的濃度增加模板量增加模板量純化模板純化模板增加擴(kuò)增循環(huán)次

33、數(shù)增加擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)適當(dāng)降低退火溫度適當(dāng)降低退火溫度（四）出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物時應(yīng)采取的措施（四）出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物時應(yīng)采取的措施增加退火溫度增加退火溫度減少減少TaqDNA聚合酶的濃度聚合酶的濃度減少退火及延伸時間減少退火及延伸時間減少引物濃度減少引物濃度減少擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)減少擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)七、七、PCR相關(guān)技術(shù)的發(fā)展相關(guān)技術(shù)的發(fā)展 PCR技術(shù)建立以來，因其較高的實用性技術(shù)建立以來，因其較高的實用性而在各個領(lǐng)域廣泛使用。而在各個領(lǐng)域廣泛使用。PCR方法本身又在方法本身又在使用中不斷得到發(fā)展，形成了一系列適用不使用中不斷得到發(fā)展，形成了一系列適用不同目的的特殊方法。同目的的特殊方法。 設(shè)計一對外測引物和一

34、對內(nèi)測引物設(shè)計一對外測引物和一對內(nèi)測引物先用外測引物擴(kuò)增含目的先用外測引物擴(kuò)增含目的DNA的大片段的大片段再用內(nèi)測引物以擴(kuò)增的大片段為模板擴(kuò)增目的再用內(nèi)測引物以擴(kuò)增的大片段為模板擴(kuò)增目的DNA片段片段模板DNA加外側(cè)引物A和B引物A 引物BPCR加內(nèi)側(cè)引物C和D引物CPCR 引物D巢式巢式PCR示意圖示意圖1、巢式、巢式PCR和半巢式和半巢式PCR (nested primer PCR)2、共享引物、共享引物PCR （shared primer PCR）利用利用3條引物來擴(kuò)增兩種不同的條引物來擴(kuò)增兩種不同的DNA序列，其中一條引序列，其中一條引物可與兩種物可與兩種DNA序列互補(bǔ)結(jié)合序列互補(bǔ)結(jié)合

35、共享引物共享引物PCR示意圖示意圖PCR 引物C引物APCR引物A 引物B3、多重、多重PCR (multiple PCR)用多對引物擴(kuò)增同一模板的幾個區(qū)域用多對引物擴(kuò)增同一模板的幾個區(qū)域4、不對稱、不對稱PCR (asymmetric PCR)采用不同的引物濃度擴(kuò)增得到單采用不同的引物濃度擴(kuò)增得到單鏈鏈DNA兩引物濃度比為兩引物濃度比為50100：15、錨定、錨定PCR （anchored PCR)以以mRNA為模板經(jīng)為模板經(jīng)RT合成合成cDNA，末端轉(zhuǎn)移酶在，末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA3末末端加上端加上poly(dG)尾。尾。Poly(dC)錨定引物錨定引物與與poly（dG)尾互補(bǔ)尾互補(bǔ)結(jié)合引

36、導(dǎo)合成未知結(jié)合引導(dǎo)合成未知DNA序列序列6、反向、反向PCR（inverted PCR)用限制酶消化基因組用限制酶消化基因組DNA，用連接酶將各片段連，用連接酶將各片段連接成環(huán)狀。用限制酶切割已知序列，根據(jù)已知序接成環(huán)狀。用限制酶切割已知序列，根據(jù)已知序列設(shè)計列設(shè)計3端引物和端引物和5 端引物，擴(kuò)增未知序列。端引物，擴(kuò)增未知序列。7、彩色、彩色PCR （color complementation asay)用不同熒光染料分別標(biāo)記用不同熒光染料分別標(biāo)記PCR引物，采用多重引物，采用多重PCR擴(kuò)增同一擴(kuò)增同一DNA的不同區(qū)域，顯示不同顏色，的不同區(qū)域，顯示不同顏色，用于基因診斷。用于基因診斷。8、

37、原位、原位PCR（in situ PCR）固定組織細(xì)胞內(nèi)的固定組織細(xì)胞內(nèi)的DNA或或RNA，以其為模板，以其為模板進(jìn)行進(jìn)行PCR反應(yīng)的過程反應(yīng)的過程 將原位雜交的細(xì)胞定位技術(shù)和將原位雜交的細(xì)胞定位技術(shù)和PCR的高靈敏度的高靈敏度相結(jié)合，產(chǎn)生了原位相結(jié)合，產(chǎn)生了原位PCR技術(shù)。其原理是以組織固技術(shù)。其原理是以組織固定處理細(xì)胞內(nèi)的核酸或定處理細(xì)胞內(nèi)的核酸或RNA作為靶序列，進(jìn)行作為靶序列，進(jìn)行PCR反應(yīng)的過程。與其它反應(yīng)的過程。與其它PCR方法不同的是，原位方法不同的是，原位PCR不必從組織細(xì)胞中分離模板不必從組織細(xì)胞中分離模板DNA或或RNA。如冷凍。如冷凍的組織或經(jīng)有機(jī)試劑固定的組織細(xì)胞，用蛋

38、白酶，的組織或經(jīng)有機(jī)試劑固定的組織細(xì)胞，用蛋白酶，DNA 酶處理，進(jìn)行原位的逆轉(zhuǎn)錄，再加入酶處理，進(jìn)行原位的逆轉(zhuǎn)錄，再加入PCR擴(kuò)擴(kuò)增試劑，進(jìn)行原位增試劑，進(jìn)行原位PCR反應(yīng)。用于檢測靶基因的細(xì)反應(yīng)。用于檢測靶基因的細(xì)胞定位、組織分布及靶基因的表達(dá)等。胞定位、組織分布及靶基因的表達(dá)等。9、定量、定量PCR（quantified PCR）以以mRNA為模板合成為模板合成cDNA加入?yún)⒄栈?，待測基因，參照引物，待測基加入?yún)⒄栈?，待測基因，參照引物，待測基因引物因引物PCR擴(kuò)增擴(kuò)增以參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的量為基礎(chǔ)，觀測待測以參照基因的擴(kuò)增產(chǎn)物的量為基礎(chǔ)，觀測待測基因產(chǎn)物的相對量。進(jìn)行定量基因產(chǎn)物的

39、相對量。進(jìn)行定量PCR時，要考慮時，要考慮內(nèi)參照因素、內(nèi)參照因素、RNA制備、逆轉(zhuǎn)錄制備、逆轉(zhuǎn)錄PCR、凝膠電、凝膠電泳、定量檢測各個環(huán)節(jié)對結(jié)果的影響。泳、定量檢測各個環(huán)節(jié)對結(jié)果的影響。10、差異顯示、差異顯示PCR（differential display PCR）將兩種將兩種mRNA逆轉(zhuǎn)錄為逆轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈第一鏈加入錨定引物，隨機(jī)引物加入錨定引物，隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增，以擴(kuò)增產(chǎn)物代表相應(yīng)擴(kuò)增，以擴(kuò)增產(chǎn)物代表相應(yīng)mRNA分析兩種細(xì)胞基因表達(dá)的差異分析兩種細(xì)胞基因表達(dá)的差異11、重組、重組PCR（recombinant PCR）PCR參與的體外基因突變或基因融合過程參與的體外基因突變或基因

40、融合過程12、熒光實時定量、熒光實時定量PCR技術(shù)技術(shù) 熒光定量熒光定量PCR(FQ-PCR)是新近才出現(xiàn)的一是新近才出現(xiàn)的一種種PCR檢測方法，是基于熒光能量轉(zhuǎn)移檢測方法，是基于熒光能量轉(zhuǎn)移(FRET)的原理建立的。的原理建立的。FRET是指通過供受體發(fā)色團(tuán)之是指通過供受體發(fā)色團(tuán)之間偶極間偶極-偶極相互作用，能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移偶極相互作用，能量從供體發(fā)色團(tuán)轉(zhuǎn)移至受體發(fā)色團(tuán)，使受體發(fā)光。檢測方法有雙鏈至受體發(fā)色團(tuán)，使受體發(fā)光。檢測方法有雙鏈DNA內(nèi)插染料、水解探針檢測模式、分子信標(biāo)內(nèi)插染料、水解探針檢測模式、分子信標(biāo)技術(shù)等多種。技術(shù)等多種。 在普通在普通PCR 儀的基礎(chǔ)上再配備一個激發(fā)和儀的

41、基礎(chǔ)上再配備一個激發(fā)和檢測的裝置。通過檢測的裝置。通過PCR反應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，反應(yīng)的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，加入標(biāo)準(zhǔn)品，可以對待測樣品中的目標(biāo)基因進(jìn)加入標(biāo)準(zhǔn)品，可以對待測樣品中的目標(biāo)基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量。該法具有高特異性和可靠性，實行準(zhǔn)確定量。該法具有高特異性和可靠性，實驗結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，在臨床檢測方面有廣驗結(jié)果穩(wěn)定，重復(fù)性好，在臨床檢測方面有廣泛的用途，如對病毒、病菌和其他病源微生物泛的用途，如對病毒、病菌和其他病源微生物致病基因的檢測。致病基因的檢測。 13.增敏增敏PCR當(dāng)模板數(shù)小于當(dāng)模板數(shù)小于1000個拷貝時，采用增敏個拷貝時，采用增敏PCR，可明，可明顯提高顯提高PCR的產(chǎn)量。的產(chǎn)量。分兩期

42、進(jìn)行，第一期是在引物分兩期進(jìn)行，第一期是在引物與模板均少的狀態(tài)下進(jìn)行與模板均少的狀態(tài)下進(jìn)行，延長退火時間，進(jìn)行，延長退火時間，進(jìn)行15 20個循環(huán)。這一期擴(kuò)增的主要目的是增加模板個循環(huán)。這一期擴(kuò)增的主要目的是增加模板量，有效地防止第二期擴(kuò)增時加入過多引無間的相量，有效地防止第二期擴(kuò)增時加入過多引無間的相互反應(yīng)，阻止引物二聚體的形成?；シ磻?yīng)，阻止引物二聚體的形成。第二期反應(yīng)：補(bǔ)第二期反應(yīng)：補(bǔ)加引物至加引物至0.1mol/L,于常規(guī)條件下進(jìn)行于常規(guī)條件下進(jìn)行20個個PCR循循環(huán)。環(huán)。第一期增加特異性，第二期增加特異產(chǎn)物的量。第一期增加特異性，第二期增加特異產(chǎn)物的量。 14.表達(dá)表達(dá)PCR 表達(dá)表達(dá)

43、PCR是重組是重組PCR的一種，通過將高表達(dá)的啟動子的一種，通過將高表達(dá)的啟動子和高效轉(zhuǎn)錄的終止子附加與擴(kuò)增目的基因的兩個引物的和高效轉(zhuǎn)錄的終止子附加與擴(kuò)增目的基因的兩個引物的5 端，使目的基因的端，使目的基因的5 端帶上強(qiáng)的啟動子，端帶上強(qiáng)的啟動子， 3 端帶上高效轉(zhuǎn)端帶上高效轉(zhuǎn)錄終止序列，將其克隆到表達(dá)載體上可獲得高效表達(dá)。亦錄終止序列，將其克隆到表達(dá)載體上可獲得高效表達(dá)。亦可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯?？芍苯舆M(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。例如：將例如：將PCR 引物的引物的5 端帶上啟端帶上啟動子動子3 端的同源序列，擴(kuò)增的目的基因的產(chǎn)物與啟動子混端的同源序列，擴(kuò)增的目的基因的產(chǎn)物與啟動子混合進(jìn)行第二次合進(jìn)行

44、第二次PCR擴(kuò)增，經(jīng)變性，退火，其中有一種產(chǎn)物擴(kuò)增，經(jīng)變性，退火，其中有一種產(chǎn)物可作為可作為PCR反應(yīng)的模板，加入適當(dāng)?shù)囊?，可產(chǎn)生帶有啟反應(yīng)的模板，加入適當(dāng)?shù)囊?，可產(chǎn)生帶有啟動子序列目的動子序列目的DNA片段，即可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。片段，即可直接進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯。 八、八、PCR產(chǎn)物的檢測產(chǎn)物的檢測（一）瓊脂糖凝膠電泳（一）瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳是瓊脂糖凝膠電泳是PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分離、純化和鑒定最擴(kuò)增產(chǎn)物的分離、純化和鑒定最常用的方法。常用的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用溴化乙錠擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，用溴化乙錠(EB)染色，在紫外燈下便可以直接確定染色，在紫外燈下便可以直

45、接確定DNA片段在凝膠片段在凝膠板中的位置。其分辨率很高，可測出板中的位置。其分辨率很高，可測出1ngDNA。首先。首先根據(jù)根據(jù)PCR擴(kuò)增片段的大小選擇瓊脂糖凝膠濃度，一般擴(kuò)增片段的大小選擇瓊脂糖凝膠濃度，一般800bp以以上的片段用上的片段用0.8%的膠，的膠，800bp以下的片段用以下的片段用1.0%2.0%的膠。成功的的膠。成功的PCR擴(kuò)增應(yīng)可見到分子質(zhì)量均一的一條區(qū)擴(kuò)增應(yīng)可見到分子質(zhì)量均一的一條區(qū)帶帶，對照分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還可對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行半定量。，對照分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)還可對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行半定量。 聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的靈敏度比瓊脂糖凝膠電聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的靈敏度比瓊脂糖凝膠電泳高泳高，

46、主要用于分離制備小于，主要用于分離制備小于1kb長度的低分子質(zhì)量基長度的低分子質(zhì)量基因片段，因此特別適用于合成的基因片段的分離和檢測。因片段，因此特別適用于合成的基因片段的分離和檢測。PAGE有靜電效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，分辨率很高，在有靜電效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，分辨率很高，在DNA序列分析時，即使相差一個核苷酸片段也能很好地分開。序列分析時，即使相差一個核苷酸片段也能很好地分開。適用于適用于PCR擴(kuò)增效率低時產(chǎn)物的檢測。根據(jù)擴(kuò)增片段的擴(kuò)增效率低時產(chǎn)物的檢測。根據(jù)擴(kuò)增片段的大小選擇合適的膠濃度，電泳后可用銀染或溴乙錠染色大小選擇合適的膠濃度，電泳后可用銀染或溴乙錠染色檢測，銀染比檢測，銀染比EB染色檢測

47、靈敏度高染色檢測靈敏度高210倍。倍。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳 高效液相色譜高效液相色譜(HPLC)是在常壓基礎(chǔ)上發(fā)展起是在常壓基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一項現(xiàn)代化分析技術(shù)，其特點是分離速度快、來的一項現(xiàn)代化分析技術(shù)，其特點是分離速度快、效果好，是目前基因片段分離純化所廣泛采用的效果好，是目前基因片段分離純化所廣泛采用的方法之一。方法之一。 離子交換層析的基礎(chǔ)是溶質(zhì)分子所攜帶的電離子交換層析的基礎(chǔ)是溶質(zhì)分子所攜帶的電荷，而合成的基因片段恰好具有這一性質(zhì)。因此，荷，而合成的基因片段恰好具有這一性質(zhì)。因此，ICE分析廣泛應(yīng)用于分析廣泛應(yīng)用于DNA的合成及其擴(kuò)增后的分的合成及其擴(kuò)增后的

48、分離純化。離純化。（三）層析技術(shù)（三）層析技術(shù) 為了確定為了確定PCR產(chǎn)物是否是預(yù)先設(shè)計的目的產(chǎn)物是否是預(yù)先設(shè)計的目的片段，或產(chǎn)物是否有突變，都需做分子雜交檢片段，或產(chǎn)物是否有突變，都需做分子雜交檢測。分子雜交包括點雜交和測。分子雜交包括點雜交和Southern印跡雜交。印跡雜交。點雜交靈敏度較高，特別適用于特異性不高的點雜交靈敏度較高，特別適用于特異性不高的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析。擴(kuò)增產(chǎn)物分析。 Southern印跡雜交可鑒定印跡雜交可鑒定PCR產(chǎn)物的大小產(chǎn)物的大小和特異性，檢測靈敏度可達(dá)和特異性，檢測靈敏度可達(dá)10ng。基本過程是?；具^程是PCR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，然后，產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)的瓊脂糖凝膠電泳，然后，印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，再用標(biāo)記的探針進(jìn)行雜印跡轉(zhuǎn)移到尼龍膜上，再用標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交檢測。交檢測。（四）分子雜交（四）分子雜交 若知道若知道PCR擴(kuò)增片段的序列或限制性內(nèi)切酶酶切擴(kuò)增片段的序列或限制性內(nèi)切酶酶切圖譜，則可選擇合適的限制酶消化圖譜，則可選擇合適的限制酶消化PCR產(chǎn)物，再進(jìn)行產(chǎn)物，再進(jìn)行電泳分析，根據(jù)電泳分析，根據(jù)PCR酶切產(chǎn)物的電泳圖譜，可判定酶切產(chǎn)物的電泳圖譜，可判定PCR產(chǎn)物的特異性及是否存在突變。產(chǎn)物的特異性及是否存在突變。（六）（六）PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測序擴(kuò)增產(chǎn)物的直接測序 直接序