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文檔簡介
1、報(bào)告人:王東方噬菌體展示 Phage display 1.什么是噬菌體展示2.噬菌體展示技術(shù)的原理5菌體展示技術(shù)在其它3. 常用的噬菌體展示系統(tǒng)4.單鏈絲狀噬體展示在重組抗體制備中的應(yīng)用5.噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用與展望1.什么是噬菌體展示技術(shù)? 噬菌體展示技術(shù)(Phage Display Techniques ,PDT)是一項(xiàng)篩選技術(shù),將外源多肽或蛋白與噬菌體的衣殼蛋白融合表 達(dá),融合蛋白展示在病毒顆粒的表面,而編碼該融合子的 DNA則位于病毒粒子內(nèi)。使大量多肽與其DNA編碼序列之間、表型與基因型之間建立了直接聯(lián)系,使各種靶分子(抗體、酶、細(xì)胞表面受體等)的多肽配體通過淘選得以快速鑒定。1.1噬菌
2、體展示技術(shù)的發(fā)展 Smith 在 1985 年首次證實(shí)外源 DNA 可以插入 絲狀噬 菌體基因 III 中,并與 pIII 蛋白融合展示。 Smith GP. Science 1985; 228:1315-71985 第一次發(fā)表噬菌體展示技術(shù);展示多肽Smith GP. Science.1985; 228:1315-71988 噬菌質(zhì)粒系統(tǒng)1990 抗體片段的展示1993 展示cDNA文庫1994/1995 研發(fā)了phage two-hybrid技術(shù)1996 首次體內(nèi)in vivo 淘選試驗(yàn)1998 噬菌體展示載體作為基因?qū)胼d體1999 Combination of phage displa
3、y with high-density arrays2001 Automated phage display selection2.噬菌體展示技術(shù)的原理噬菌體展示技術(shù)是將多肽或蛋白質(zhì)的編碼基因或目的基因片段克隆入噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)基因的適當(dāng)位置,在閱讀框正確且不影響其他外殼蛋白正常功能的情況下,使外源多肽或蛋白與外殼蛋白融合表達(dá),融合蛋白隨子代噬菌體的重新組裝而展示在噬菌體表面。被展示的多肽或蛋白可以保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性,以利于靶分子的識別和結(jié)合。肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時(shí)間孵育后,洗去未結(jié)合的游離噬菌體,然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體,洗脫的噬菌體感染宿
4、主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增,進(jìn)行下一輪洗脫,經(jīng)過3輪5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后,與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。 外源多肽或蛋白質(zhì)表達(dá)在噬菌體的表面,而其編碼基因作為病毒基因組中的一部分可通過噬菌體DNA 序列測序出來,使得表達(dá)蛋白(表現(xiàn)型)和編碼基因(基因型)之間完美地結(jié)合起來,為生物科學(xué)提供高效而實(shí)用的研究手段。3.常用的噬菌體展示系統(tǒng)單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)噬菌體展示系統(tǒng)T4噬菌體展示系統(tǒng)3.1 噬菌體結(jié)構(gòu)圖1.噬菌體結(jié)構(gòu)示意圖3.2 噬菌體的分類 因?yàn)槭删w主要由蛋白質(zhì)外殼和核酸組成,所以,可以根據(jù)蛋白質(zhì)外殼或核酸的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對噬菌體進(jìn)行分類。 根據(jù)噬菌體蛋白結(jié)構(gòu)可分為: 無尾部結(jié)構(gòu)的二十
5、面體有尾部結(jié)構(gòu)的二十面體 線狀體按照噬菌體的核酸類型分類可分為:ss RNA:噬菌體中所含的核酸是單鏈RNA。ds RNA:噬菌體中所含的核酸是雙鏈RNA。ss DNA:噬菌體中所含的核酸是單鏈DNA。ds DNA:噬菌體中所含的核酸是雙鏈DNA。3.3 噬菌體侵染細(xì)菌 噬菌機(jī)理噬菌體顆粒感染一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞后可迅速生成幾百個(gè)子代噬菌體顆粒,每個(gè)子代顆粒又可感染細(xì)菌細(xì)胞,再生成幾百個(gè)子代噬菌體顆粒。如此重復(fù)只需4次,一個(gè)噬菌體顆粒便可使幾十億個(gè)細(xì)菌感染而死亡。 噬菌體除了能使宿主細(xì)菌裂解死亡外,還有一些噬菌體感染細(xì)菌后,并不使細(xì)胞死亡,稱為溫和噬菌體,這些噬菌體感染細(xì)菌后,將其自身的基因組整合進(jìn)宿
6、主細(xì)胞的基因組,此時(shí),這種宿主細(xì)菌稱為溶原性細(xì)菌。3.3 噬菌體侵染大腸桿菌 3.4 噬菌體展示系統(tǒng)(1)PV展示系統(tǒng)。噬菌體的PV蛋白構(gòu)成了它的尾部管狀部分。PV有兩個(gè)折疊區(qū)域,C端的折疊結(jié)構(gòu)域(非功能區(qū))可供外源序列插入或替換。噬菌體的裝配在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行,故可以展示難以分泌的肽或蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)展示的外源蛋白質(zhì)的拷貝數(shù)為平均1個(gè)分子/噬菌體,這表明外源蛋白質(zhì)或多肽可能干擾了噬菌體的尾部裝配。(2)D蛋白展示系統(tǒng)。D蛋白的參與野生型噬菌體頭部的裝配。當(dāng)突變型噬菌體基因組小于野生型基因組的82%時(shí),可以在缺少D蛋白的情況下完成組裝,故D蛋白可作為外源序列融合的載體,而且展示的外源多肽在空間上是可以
7、接近的。該系統(tǒng)有一個(gè)很好的特點(diǎn),噬菌體上融合蛋白和D蛋白的比例可以由宿主的抑制tRNA活性加以控制,這對于展示那些可以對噬菌體裝配造成損害的蛋白質(zhì)時(shí)特別有用。3.5 T4噬菌體展示系統(tǒng) T4噬菌體展示系統(tǒng)是20世紀(jì)90年代中期建立起來的一種新的展示系統(tǒng)。它的顯著特點(diǎn)是能夠?qū)煞N性質(zhì)完全不同的外源多肽或蛋白質(zhì),分別與T4衣殼表面上的外殼蛋白SOC(9 ku)和HOC(40 ku)融合而直接展示于T4噬菌體的表面,因此它表達(dá)的蛋白不需要復(fù)雜的蛋白純化,避免了因純化而引起的蛋白質(zhì)變性和丟失。T4噬菌體是在宿主細(xì)胞內(nèi)裝配,不需通過分泌途徑,因而可展示各種大小的多肽或蛋白質(zhì),很少受到限制。SOC與HOC
8、蛋白的存在與否,并不影響T4的生存和繁殖。SOC和HOC在噬菌體組裝時(shí)可優(yōu)于DNA的包裝而裝配于衣殼的表面,事實(shí)上,在DNA包裝被抑制時(shí),T4是雙鏈DNA噬菌體中唯一能夠在體內(nèi)產(chǎn)生空衣殼的噬菌體(SOC和HOC也同時(shí)組裝)。因此,在用重組T4做疫苗時(shí),它能在空衣殼表面展示目的抗原,這種缺乏DNA的空衣殼苗,在生物安全性方面具有十分光明的前景。 3.6 單鏈絲狀噬菌體展示系統(tǒng)絲狀噬菌體是一個(gè)能夠感染革蘭氏陰性細(xì)菌的病毒大家族,他們都含有單鏈DNA基因組,都包裝于由含有幾千拷貝的主要衣殼蛋白(P)和位于頂端的次要衣殼蛋白(P)所組成的少許柔韌性的管狀衣殼中。M13和Fd噬菌體均是絲狀噬菌體。M13
9、噬菌體遺傳圖譜和結(jié)構(gòu)示意圖3.6.1 M13噬菌體的組成和結(jié)構(gòu) 次要衣殼蛋白P P是病毒的次要外殼蛋白,位于病毒顆粒的尾端,是噬菌體感染大腸桿菌所必須的。每個(gè)病毒顆粒都有3個(gè)5個(gè)拷貝P蛋白,其在結(jié)構(gòu)上可分為N1、N2和CT 3個(gè)功能區(qū)域,這3個(gè)功能區(qū)域由兩段富含甘氨酸的連接肽G1和G2連接。其中,N1和N2與噬菌體吸附大腸桿菌菌毛及穿透細(xì)胞膜有關(guān),而CT構(gòu)成噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的一部分,并將整個(gè)P蛋白的C端結(jié)構(gòu)域錨定于噬菌體的一端。 3.6.2次要衣殼蛋白P展示系統(tǒng) P展示系統(tǒng),P有2個(gè)位點(diǎn)可供外源序列插入,當(dāng)外源的多肽或蛋白質(zhì)融合于P蛋白的信號肽(Sg)和N1之間時(shí),該系統(tǒng)保留了完整的P蛋白,
10、噬菌體仍有感染性;但若外源多肽或蛋白直接與P蛋白的CT結(jié)構(gòu)域相連,則噬菌體喪失感染性,這時(shí)重組噬菌體的感染性由輔助噬菌體表達(dá)的完整P蛋白來提供。P蛋白很容易被蛋白水解酶水解,所以有輔助噬菌體超感染時(shí),可以使每個(gè)噬菌體平均展示不到一個(gè)融合蛋白,即所謂“單價(jià)”噬菌體。 3.6.3主要衣殼蛋白P展示系統(tǒng) P展示系統(tǒng)。P是絲狀噬菌體的主要外殼蛋白,位于噬菌體外側(cè),每個(gè)病毒顆粒有2 700個(gè)左右P拷貝。P的N端附近可融合五肽,但不能融合更長的肽鏈,因?yàn)檩^大的多肽或蛋白會造成空間障礙,影響噬菌體裝配,使其失去感染力。但有輔助噬菌體參與時(shí),可提供野生型P蛋白,降低價(jià)數(shù),此時(shí)可融合多肽甚至抗體片段。3.6.4
11、 噬菌粒載體和輔助噬菌體 噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈?zhǔn)删w包裝序列、復(fù)制子以及質(zhì)粒復(fù)制子、克隆位點(diǎn)、標(biāo)記基因的特殊類型的載體。噬菌體的特征:攜帶有欲在噬菌體上融合展示的蛋白基因,沒有其它噬菌體基因;有質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)(322ori)和噬菌體復(fù)制起點(diǎn)(Ff ori用于合成ssDNA);有包裝序列信號;有供篩選的抗生素標(biāo)記基因;噬菌粒載體可以方便克隆,提高遺傳的穩(wěn)定性。相比噬菌體載體噬菌粒具有以下優(yōu)點(diǎn):1.雙鏈DNA既穩(wěn)定又高產(chǎn),具有常規(guī)質(zhì)粒的特征;2.免除了將外緣DNA片段從質(zhì)粒亞克隆于噬菌體載體這一繁瑣又費(fèi)時(shí)的步驟;3.由于載體足夠小,故可得到長達(dá)10kb的外源DNA區(qū)段的單鏈。pCANTAB
12、5e噬菌體質(zhì)粒圖譜 輔助噬菌體可以提供噬菌粒復(fù)制、合成ssDNA和病毒包裝所需的所有蛋白和酶。能夠幫助噬菌體載體在大腸桿菌體內(nèi)包裝復(fù)制。比如M13KO7輔助噬菌體。 M13KO7輔助噬菌體是由M13噬菌體改造而來,在M13復(fù)制起點(diǎn)插入了卡那霉素抗性基因用于篩選。 能夠在唔噬菌體質(zhì)粒的情況下復(fù)制 當(dāng)有噬菌體質(zhì)粒時(shí),由于噬菌體質(zhì)粒含有野生型M13或者是f1復(fù)制起點(diǎn),因此,單鏈?zhǔn)删w質(zhì)粒的DNA 會被優(yōu)先包裝并分泌。 噬菌粒在輔助噬菌體的幫助下在大腸桿菌體內(nèi)完成組裝4.單鏈絲狀噬體展示在重組抗體制備中的應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)的應(yīng)用:1.抗原表位分析2.制備特異性抗體3.制備疫苗,多價(jià)疫苗4.構(gòu)建新型生物
13、催化劑(Ren et al在1997年將T4DNA連接酶展示于T4噬菌體,所表達(dá)的融合蛋白能夠高效的連接粘性或是平末端。這就有可能吧催化某一代謝途徑的多種酶展示于噬菌體上,制造出人工的多酶復(fù)合體,或者把眾多的酶分子的活性位點(diǎn)展示到同一個(gè)噬菌體顆粒上,制作出superenzyme)4.1單鏈絲狀噬菌體展示在鼠源重組抗體制備中的應(yīng)用抗體制備時(shí)噬菌體展示技術(shù)的重要應(yīng)用之一,噬菌體展示技術(shù)可以用來從天然抗體文庫中篩選特定的抗體,也可以用于人源或是鼠源免疫抗體文庫的的抗體篩選制備。現(xiàn)在以鼠源單鏈重組抗體的制備為例,簡述一下噬菌體展示技術(shù)在抗體制備中的作用和方法。 噬菌體抗體文庫的構(gòu)建類型主要有三種:天然
14、抗體文庫,免疫文庫,合成抗體文庫。在殘留分析領(lǐng)域最為實(shí)用的技術(shù)是免疫抗體文庫。免疫抗體文庫在免疫過程中經(jīng)歷了一個(gè)親和突變的過程,因此從免疫抗體文庫中篩選出來的抗體具有更高的親和力和特異性。 抗體(Ab)指機(jī)體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下,由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。主要分布在血清中,也分布于組織液及外分泌液中。借助于基因工程技術(shù),既可以對完整抗體,又可以對抗體片段進(jìn)行改造。其中小分子抗體因其分子量小、穿透性強(qiáng)、抗原性低、可在原核系統(tǒng)中表達(dá)及易于對其進(jìn)行基因工程操作等優(yōu)點(diǎn)而受到研究者的重視,并成為基因工程抗體的研究熱點(diǎn)。常見的單價(jià)小分子抗體
15、有 scFv、Fab、Fv 等。其中scFv小分子抗體具有抗體抗原識別的全部位點(diǎn),而且分子量小,穩(wěn)定,易于表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)被廣泛的采用,現(xiàn)以scFv單鏈重組抗體為例做簡述。4.2 scFv單鏈重組抗體的制備scFv重組基因的構(gòu)建scFv基因與噬菌體質(zhì)粒pCANTAB5e連接 重組后的噬菌體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進(jìn)宿主細(xì)胞,并在輔助噬菌體的幫助下在宿主體內(nèi)完成組裝,復(fù)制,增值的過程。 融合蛋白的表達(dá)是低價(jià)的,只有不到10的噬菌體可以表達(dá)融合基因,其余噬菌體展示的均是野生型噬菌體的p3蛋白,所以想要獲得親和高特異性好的噬菌體文庫需要進(jìn)行多輪的淘篩來進(jìn)行篩選。淘篩親和淘篩4.多輪之后,克隆測序3.將特異性結(jié)合的噬菌體洗
16、脫下來2.洗滌去未結(jié)合的或是非特異性結(jié)合的噬菌體1.噬菌體肽庫與靶分子相互作用 經(jīng)過多輪淘篩之后獲得親和性高特異性好的噬菌體,然后擴(kuò)增保種,表達(dá)svFv基因,獲得抗體蛋白,然后抗體蛋白經(jīng)過純化定量之后,就可用于下一步的殘留檢測。5.噬菌體展示技術(shù)應(yīng)用與展望1、抗體制備 抗狂犬病毒的單鏈抗體,抗HIV-1囊膜糖蛋白的單鏈抗體,此抗體可專一性殺死被HIV-1感染并表達(dá)有g(shù)p120的淋巴細(xì)胞, 中和響尾蛇毒素的單鏈抗體,等等。 2、疫苗 展示在噬菌體表面的HIV-1 的gp120-V3 環(huán) 可象天然抗原一樣引起顯著的免疫應(yīng)答, 等等。3. 多肽類藥物 如一些激動劑或拮抗劑從多肽庫中分離鑒定出來;已獲
17、得一13 肽,它能中和蛇毒 -bungarotoxin;從CX7C 多肽庫中掏選到一個(gè)多肽能與 Hantavirus 結(jié)合,并使該病毒不能結(jié)合或感染細(xì)胞。人血管促生素(angiogenin)是一種能促進(jìn)腫瘤血管生長的蛋白,用這個(gè)蛋白去淘選一個(gè)噬菌體展示多肽庫,所獲得的一個(gè)環(huán)狀8肽能與血管促生素結(jié)合,并能阻遏血管促生素4、腫瘤藥物導(dǎo)航載體 用腫瘤細(xì)胞特殊的受體蛋白從展示文庫中淘選到的多肽或單鏈抗體,可以作為抗癌藥物的定向輸送工具 。5、信息傳遞研究 利用噬菌體展示多肽庫,發(fā)現(xiàn)了一些受體,如凝血致活酶、黑皮質(zhì)素受體、CD80 和一個(gè) Hantaviral 受體;受體的配體, 如血管促生素、-bungarotoxin, 和一些大蛋白分子中的折疊區(qū)域,如SH2、SH3 和 WW 區(qū)域。從多肽庫中可分離到與天然激素相似的、與受體結(jié)合的高親和力的多肽, 因此用完整細(xì)胞可以從多肽庫中找到受體的高選擇性配體。在不知道任何有關(guān)的受體和配體信息的情況下,用完整細(xì)胞和組織或動物,可篩選到特異與靶組織結(jié)合的多肽和蛋白。 6、DNA結(jié)合蛋白 鋅指蛋白是一類 DNA 結(jié)合小肽結(jié)構(gòu)物,這些結(jié)構(gòu)含有鋅,能用于構(gòu)建一個(gè)大的蛋白區(qū)域,去識別和結(jié)合特殊的 DNA 序列。噬菌體展示技術(shù)也可以用于創(chuàng)造一個(gè)大的、具有識別不同 DNA 序列的 鋅指的多肽庫。利用這
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