第一章植物細(xì)胞培養(yǎng)(2)

1、第二節(jié)第二節(jié) 植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法植物細(xì)胞培養(yǎng)的方法植物細(xì)胞的培養(yǎng)方法：植物細(xì)胞的培養(yǎng)方法：根據(jù)培養(yǎng)基的類型分為根據(jù)培養(yǎng)基的類型分為: : 1 1、固體培養(yǎng)固體培養(yǎng): : 瓊脂、卡拉膠等固化。瓊脂、卡拉膠等固化。 2 2、半液半固體培養(yǎng)：固液雙層。、半液半固體培養(yǎng)：固液雙層。 3 3、液體培養(yǎng)：震蕩、旋轉(zhuǎn)或靜置培養(yǎng)。、液體培養(yǎng)：震蕩、旋轉(zhuǎn)或靜置培養(yǎng)。 固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)液體培養(yǎng)液體培養(yǎng)：體胚液體培養(yǎng)體胚液體培養(yǎng)根據(jù)培養(yǎng)材料分為：根據(jù)培養(yǎng)材料分為： 單細(xì)胞培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)、 原生質(zhì)體培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)、 固定化細(xì)胞培養(yǎng)、固定化細(xì)胞培養(yǎng)、 小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)等。小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)等。一一 單細(xì)胞培養(yǎng)單細(xì)胞培養(yǎng)單細(xì)

2、胞培養(yǎng)單細(xì)胞培養(yǎng)是從外植體、愈傷組織、是從外植體、愈傷組織、細(xì)胞團(tuán)中分離得到單細(xì)胞，然后在細(xì)胞團(tuán)中分離得到單細(xì)胞，然后在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)的過程。一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)的過程。通過單細(xì)胞培養(yǎng)可以觀察細(xì)胞個(gè)體的分通過單細(xì)胞培養(yǎng)可以觀察細(xì)胞個(gè)體的分裂、生長和繁殖情況，可以獲得細(xì)胞團(tuán)，裂、生長和繁殖情況，可以獲得細(xì)胞團(tuán)，進(jìn)而得到從單細(xì)胞形成的細(xì)胞系。進(jìn)而得到從單細(xì)胞形成的細(xì)胞系。從單細(xì)胞分裂、繁殖得到的細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞從單細(xì)胞分裂、繁殖得到的細(xì)胞團(tuán)和細(xì)胞系，可以認(rèn)為具有相同的基因和特性。系，可以認(rèn)為具有相同的基因和特性。用這種細(xì)胞系迸行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，得到用這種細(xì)胞系迸行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)，得到較為均一的細(xì)胞及

3、其代謝產(chǎn)物。較為均一的細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物。（一）植物單細(xì)胞的獲得（一）植物單細(xì)胞的獲得1 1、從外植體直接分離單細(xì)胞、從外植體直接分離單細(xì)胞外植體經(jīng)過切割、搗碎或酶解，然后經(jīng)過外植體經(jīng)過切割、搗碎或酶解，然后經(jīng)過一定孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞懸一定孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，得到細(xì)胞懸浮液。浮液。懸浮液中所含的完整細(xì)胞數(shù)量很少，懸浮液中所含的完整細(xì)胞數(shù)量很少，分散性較好，可以看作是游離的單細(xì)胞懸分散性較好，可以看作是游離的單細(xì)胞懸浮液。浮液。2 2、從愈傷組織分離單細(xì)胞、從愈傷組織分離單細(xì)胞1 1）經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)獲得脫分化愈傷組織）經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)獲得脫分化愈傷組織的薄壁細(xì)胞團(tuán)。的薄壁細(xì)胞團(tuán)。2

4、 2）將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行振）將細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，使細(xì)胞團(tuán)分散成為單細(xì)胞，然后用蕩培養(yǎng)，使細(xì)胞團(tuán)分散成為單細(xì)胞，然后用適當(dāng)孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞團(tuán)和適當(dāng)孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去細(xì)胞團(tuán)和殘?jiān)?，得到單?xì)胞懸浮液。殘?jiān)?，得到單?xì)胞懸浮液。3 3通過原生質(zhì)體再生法獲取單細(xì)胞通過原生質(zhì)體再生法獲取單細(xì)胞1 1）外植體、愈傷組織或細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過纖維素）外植體、愈傷組織或細(xì)胞團(tuán)經(jīng)過纖維素酶和果膠酶等的作用，除去細(xì)胞壁而獲得酶和果膠酶等的作用，除去細(xì)胞壁而獲得原生質(zhì)體。原生質(zhì)體。2 2）原生質(zhì)體分離后，在一定條件下進(jìn)行原生）原生質(zhì)體分離后，在一定條件下進(jìn)行原生質(zhì)體培養(yǎng)，

5、使細(xì)胞壁再生，而獲得單細(xì)胞懸質(zhì)體培養(yǎng)，使細(xì)胞壁再生，而獲得單細(xì)胞懸浮液。浮液。（二）植物單細(xì)胞培養(yǎng)的方法（二）植物單細(xì)胞培養(yǎng)的方法由于植物細(xì)胞具有群體生長特性，由于植物細(xì)胞具有群體生長特性，單細(xì)胞往往難以生長、繁殖。單細(xì)胞往往難以生長、繁殖。為此，需要采用一些特殊技術(shù)為此，需要采用一些特殊技術(shù)1. 1. 平板培養(yǎng)法平板培養(yǎng)法概念：將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定概念：將制備好的單細(xì)胞懸浮液，按照一定的細(xì)胞密度，接種在的細(xì)胞密度，接種在1 1mmmm的薄層固體培養(yǎng)基的薄層固體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng)。上進(jìn)行培養(yǎng)，稱之為平板培養(yǎng)。由由Bergman1960Bergman1960年首創(chuàng)的，其

6、目的是年首創(chuàng)的，其目的是為了獲得單細(xì)胞系為了獲得單細(xì)胞系 ，并研究其生理，并研究其生理生化和遺傳上的規(guī)律。生化和遺傳上的規(guī)律。特特 點(diǎn)點(diǎn)： -平板培養(yǎng)是選擇優(yōu)良單細(xì)胞株常用的方平板培養(yǎng)是選擇優(yōu)良單細(xì)胞株常用的方法。因?yàn)橛善桨迮囵B(yǎng)所增殖的細(xì)胞團(tuán)大多來法。因?yàn)橛善桨迮囵B(yǎng)所增殖的細(xì)胞團(tuán)大多來自一個(gè)單細(xì)胞。自一個(gè)單細(xì)胞。 -平板培養(yǎng)用的是平板培養(yǎng)用的是1 mm厚的薄層固體培養(yǎng)厚的薄層固體培養(yǎng)基，在顯微鏡下可對細(xì)胞的分裂和細(xì)胞團(tuán)的基，在顯微鏡下可對細(xì)胞的分裂和細(xì)胞團(tuán)的增殖進(jìn)行追蹤觀察增殖進(jìn)行追蹤觀察 單細(xì)胞培養(yǎng)過程單細(xì)胞培養(yǎng)過程單細(xì)胞懸浮液的密度：一般為單細(xì)胞懸浮液的密度：一般為10103 3個(gè)個(gè)mLm

7、L接種單細(xì)胞接種單細(xì)胞 將調(diào)整好細(xì)胞密度的單細(xì)胞懸將調(diào)整好細(xì)胞密度的單細(xì)胞懸浮液與浮液與5050左右的固體培養(yǎng)基混合均勻，分左右的固體培養(yǎng)基混合均勻，分裝于無菌的培養(yǎng)皿中，水平放置，冷卻，即裝于無菌的培養(yǎng)皿中，水平放置，冷卻，即為單細(xì)胞培養(yǎng)平板為單細(xì)胞培養(yǎng)平板。培養(yǎng)培養(yǎng) ：將上述單細(xì)胞培養(yǎng)平板置于培養(yǎng)箱：將上述單細(xì)胞培養(yǎng)平板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。中培養(yǎng)。 繼代培養(yǎng)：繼代培養(yǎng)： 選取生長良好的由單細(xì)胞形成選取生長良好的由單細(xì)胞形成的細(xì)胞團(tuán)，接種于新鮮的固體培養(yǎng)基上進(jìn)的細(xì)胞團(tuán)，接種于新鮮的固體培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，獲得由單細(xì)胞形成的細(xì)胞系。行繼代培養(yǎng)，獲得由單細(xì)胞形成的細(xì)胞系。單細(xì)胞平板培養(yǎng)效率的檢測

8、單細(xì)胞平板培養(yǎng)效率的檢測所謂植板率即在平板上形成細(xì)胞團(tuán)的百分所謂植板率即在平板上形成細(xì)胞團(tuán)的百分率率2 2 看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)概念：概念：有些植物細(xì)胞，一旦單離出來，有些植物細(xì)胞，一旦單離出來，不僅不能分裂、增殖，還可能死亡。不僅不能分裂、增殖，還可能死亡。如果用一塊愈傷組織（生長旺盛）來哺如果用一塊愈傷組織（生長旺盛）來哺育單細(xì)胞，從而使其正常分裂、增殖的育單細(xì)胞，從而使其正常分裂、增殖的方法，稱方法，稱“看護(hù)培養(yǎng)看護(hù)培養(yǎng)” 特點(diǎn)特點(diǎn)：方法簡便，但不能在顯微鏡：方法簡便，但不能在顯微鏡下追蹤細(xì)胞的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。下追蹤細(xì)胞的分裂和細(xì)胞團(tuán)的形成。 濾紙濾紙起滲透擴(kuò)散養(yǎng)分作用；起滲透擴(kuò)散養(yǎng)分作

9、用；愈傷組織塊可以促進(jìn)單細(xì)胞的生長繁殖愈傷組織塊可以促進(jìn)單細(xì)胞的生長繁殖愈傷組織給單細(xì)胞傳遞了某些生物信息，愈傷組織給單細(xì)胞傳遞了某些生物信息，或?yàn)閱渭?xì)胞的生長繁殖提供了某些物質(zhì)條件或?yàn)閱渭?xì)胞的生長繁殖提供了某些物質(zhì)條件例如植物激素等內(nèi)源化合物。例如植物激素等內(nèi)源化合物。將生長活躍的愈傷組織塊植人固體培養(yǎng)將生長活躍的愈傷組織塊植人固體培養(yǎng)基的中間部位；基的中間部位；愈傷組織愈傷組織接種幾天后，接種幾天后，在愈傷組織塊的上在愈傷組織塊的上方放置方放置1片面積為片面積為1 cm2左右的無菌濾紙，左右的無菌濾紙，取一小滴經(jīng)過稀釋的單細(xì)胞懸浮液接種取一小滴經(jīng)過稀釋的單細(xì)胞懸浮液接種于濾紙上方；于濾紙上

10、方；單細(xì)胞培養(yǎng)過程單細(xì)胞培養(yǎng)過程置于培養(yǎng)箱中，在一定的溫度和光照條件置于培養(yǎng)箱中，在一定的溫度和光照條件下培養(yǎng)若干天，單細(xì)胞在濾紙上進(jìn)行持續(xù)的下培養(yǎng)若干天，單細(xì)胞在濾紙上進(jìn)行持續(xù)的分裂和增殖，形成細(xì)胞團(tuán)；分裂和增殖，形成細(xì)胞團(tuán)；將在濾紙上由單細(xì)胞形成的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移將在濾紙上由單細(xì)胞形成的細(xì)胞團(tuán)轉(zhuǎn)移到新鮮的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，獲到新鮮的固體培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，獲得由單細(xì)胞形成的細(xì)胞系得由單細(xì)胞形成的細(xì)胞系3 3 微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)1）概念：概念： 將接種有單細(xì)胞的少量培養(yǎng)基，將接種有單細(xì)胞的少量培養(yǎng)基，置于微室中培養(yǎng)，使單細(xì)胞生長繁殖的置于微室中培養(yǎng)，使單細(xì)胞生長繁殖的培養(yǎng)方法。培養(yǎng)方法。

11、1955年，德若普（年，德若普（De Ropp）首次將接首次將接種有單細(xì)胞的一小滴液體培養(yǎng)基，在微種有單細(xì)胞的一小滴液體培養(yǎng)基，在微室中進(jìn)行單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)室中進(jìn)行單細(xì)胞懸浮培養(yǎng)。單細(xì)胞單細(xì)胞微室培養(yǎng)微室培養(yǎng)2）接種的細(xì)胞必須達(dá)到臨界細(xì)胞密度以上。）接種的細(xì)胞必須達(dá)到臨界細(xì)胞密度以上。10103 3個(gè)個(gè)mLmL; ;密度過低，單細(xì)胞無法進(jìn)行生長繁殖；密度過低，單細(xì)胞無法進(jìn)行生長繁殖；密度過高，則形成的細(xì)胞團(tuán)混雜在一起，密度過高，則形成的細(xì)胞團(tuán)混雜在一起，難于獲得單細(xì)胞形成的細(xì)胞系。難于獲得單細(xì)胞形成的細(xì)胞系。3 3）培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，）培養(yǎng)基少，營養(yǎng)和水分難以保持，pHpH值值變動輻

12、度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂，因變動輻度大，培養(yǎng)細(xì)胞僅能短期分裂，因此，當(dāng)細(xì)胞團(tuán)長到一定大小，將其轉(zhuǎn)移到此，當(dāng)細(xì)胞團(tuán)長到一定大小，將其轉(zhuǎn)移到另外培養(yǎng)基上。另外培養(yǎng)基上。 De Ropp1955年首先進(jìn)行微室培養(yǎng)研究，年首先進(jìn)行微室培養(yǎng)研究，進(jìn)行單細(xì)胞活體連續(xù)觀察。進(jìn)行單細(xì)胞活體連續(xù)觀察。Jones1960年首先觀察到煙草細(xì)胞分裂年首先觀察到煙草細(xì)胞分裂.4 4） 特點(diǎn)：特點(diǎn)：微室培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基用量少，可以通過微室培養(yǎng)所使用的培養(yǎng)基用量少，可以通過顯微鏡觀察單個(gè)細(xì)胞的生長、分裂、分化、顯微鏡觀察單個(gè)細(xì)胞的生長、分裂、分化、發(fā)育情況。發(fā)育情況。有利于對細(xì)胞特性和單個(gè)細(xì)胞生長發(fā)育的全有利于對細(xì)胞特

13、性和單個(gè)細(xì)胞生長發(fā)育的全過程進(jìn)行跟蹤研究。過程進(jìn)行跟蹤研究。三、單細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)關(guān)鍵三、單細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)關(guān)鍵1.細(xì)胞的起始密度細(xì)胞的起始密度 -細(xì)胞密度：系指單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)細(xì)胞密度：系指單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目，單位：目，單位：103個(gè)個(gè)mL -起始細(xì)胞密度起始細(xì)胞密度：系指開始培養(yǎng)時(shí)，單：系指開始培養(yǎng)時(shí)，單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目。位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目。起始密度也就是起始密度也就是最低有效密度。最低有效密度。2.植物生長激素植物生長激素 生長素和分裂素是植物細(xì)胞培養(yǎng)中主要的生長素和分裂素是植物細(xì)胞培養(yǎng)中主要的 生長激素。生長激素。 3溫度溫度:一般控制在一般控制在25左右。左右。4. pH: 一般控

14、制在一般控制在5.26.0的范圍的范圍二二 小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng) 小細(xì)胞團(tuán)小細(xì)胞團(tuán)是指由是指由28個(gè)植物細(xì)胞聚合在一個(gè)植物細(xì)胞聚合在一起而形成的細(xì)胞團(tuán)塊。起而形成的細(xì)胞團(tuán)塊。小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)是將小團(tuán)塊接種于培養(yǎng)基中，小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)是將小團(tuán)塊接種于培養(yǎng)基中，在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)的過程。在一定條件下進(jìn)行培養(yǎng)的過程。 （）植物小細(xì)胞團(tuán)的形成）植物小細(xì)胞團(tuán)的形成1愈傷組織分割法愈傷組織分割法 愈傷組織分割法是在無菌條件下用鑷子愈傷組織分割法是在無菌條件下用鑷子或者小刀將愈傷組織塊分割成為小細(xì)胞或者小刀將愈傷組織塊分割成為小細(xì)胞團(tuán)的過程。團(tuán)的過程。 2 2單細(xì)胞增殖法單細(xì)胞增殖法1)植物細(xì)胞具有群體生長特

15、性，植物細(xì)胞具有群體生長特性，2)細(xì)胞外圍有一層果膠等膠體物質(zhì)，容易將細(xì)細(xì)胞外圍有一層果膠等膠體物質(zhì)，容易將細(xì)胞粘在一起而形成細(xì)胞團(tuán)。胞粘在一起而形成細(xì)胞團(tuán)。3) 單細(xì)胞培養(yǎng)過程中，單細(xì)胞經(jīng)過分裂繁殖單細(xì)胞培養(yǎng)過程中，單細(xì)胞經(jīng)過分裂繁殖也形成細(xì)胞團(tuán)。也形成細(xì)胞團(tuán)。3 3 細(xì)胞團(tuán)分散法細(xì)胞團(tuán)分散法 細(xì)胞團(tuán)分散法是通過機(jī)械攪拌或者通人無細(xì)胞團(tuán)分散法是通過機(jī)械攪拌或者通人無菌空氣等，在剪切力的作用下，使大細(xì)胞菌空氣等，在剪切力的作用下，使大細(xì)胞團(tuán)分散成為小細(xì)胞團(tuán)的過程團(tuán)分散成為小細(xì)胞團(tuán)的過程。（二）植物小細(xì)胞團(tuán)的同步化方法（二）植物小細(xì)胞團(tuán)的同步化方法細(xì)胞團(tuán)大小不一樣，所處的生長期有所不同，細(xì)胞團(tuán)大

16、小不一樣，所處的生長期有所不同，生長繁殖的能力和新陳代謝的水平也就有很生長繁殖的能力和新陳代謝的水平也就有很大差別。大差別。為了使小細(xì)胞團(tuán)在懸浮培養(yǎng)時(shí)處于比較均一為了使小細(xì)胞團(tuán)在懸浮培養(yǎng)時(shí)處于比較均一的狀態(tài)，需要進(jìn)行同步化處理的狀態(tài)，需要進(jìn)行同步化處理。 1 1體積選擇法體積選擇法體積選擇法是根據(jù)細(xì)胞團(tuán)的體積大小進(jìn)行選擇體積選擇法是根據(jù)細(xì)胞團(tuán)的體積大小進(jìn)行選擇.將培養(yǎng)一段時(shí)間的細(xì)胞懸浮液，在無菌條件下，將培養(yǎng)一段時(shí)間的細(xì)胞懸浮液，在無菌條件下，用一定孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去大細(xì)胞團(tuán)，用一定孔徑的不銹鋼篩網(wǎng)過濾，除去大細(xì)胞團(tuán)，再用較小孔徑的篩網(wǎng)過濾，獲得顆粒大小較均勻再用較小孔徑的篩網(wǎng)過濾，獲

17、得顆粒大小較均勻的小細(xì)胞團(tuán)，再懸浮于新鮮的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培的小細(xì)胞團(tuán)，再懸浮于新鮮的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。養(yǎng)。2低溫處理法1) 將收集得到的細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，在將收集得到的細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，在4左右左右的低溫條件下處理的低溫條件下處理13d，植物細(xì)胞在低溫植物細(xì)胞在低溫下全部停止生長繁殖，下全部停止生長繁殖，2)然后再懸浮于新鮮的液體培養(yǎng)基中，在然后再懸浮于新鮮的液體培養(yǎng)基中，在25培養(yǎng)，于是細(xì)胞幾乎同時(shí)開始生長繁殖，處培養(yǎng)，于是細(xì)胞幾乎同時(shí)開始生長繁殖，處于同步狀態(tài)。于同步狀態(tài)。3 3限制營養(yǎng)處理法限制營養(yǎng)處理法1)將細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在營養(yǎng)物質(zhì)受到限將細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)懸浮在營養(yǎng)物質(zhì)受到限制的培

18、養(yǎng)液中培養(yǎng)幾天，由于營養(yǎng)缺乏，制的培養(yǎng)液中培養(yǎng)幾天，由于營養(yǎng)缺乏，細(xì)胞的生長繁殖受到限制，幾乎所有的細(xì)細(xì)胞的生長繁殖受到限制，幾乎所有的細(xì)胞都停止生長；胞都停止生長；2)然后再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)液中，進(jìn)然后再將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的培養(yǎng)液中，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，則細(xì)胞幾乎同步地開始生長繁行懸浮培養(yǎng)，則細(xì)胞幾乎同步地開始生長繁殖。殖。 4細(xì)胞分裂抑制法1)在細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)過程中，通過向在細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)過程中，通過向培養(yǎng)液中添加某種細(xì)胞分裂抑制劑處理一培養(yǎng)液中添加某種細(xì)胞分裂抑制劑處理一段時(shí)間，所有的細(xì)胞都停止分裂；段時(shí)間，所有的細(xì)胞都停止分裂；2)然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮的液體培養(yǎng)基中，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)

19、移到新鮮的液體培養(yǎng)基中，在一定的條件下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，則所有的細(xì)在一定的條件下進(jìn)行懸浮培養(yǎng)，則所有的細(xì)胞幾乎同步地開始分裂。胞幾乎同步地開始分裂。（三）植物小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)的方法（三）植物小細(xì)胞團(tuán)培養(yǎng)的方法植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng):植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)植物細(xì)胞懸浮培養(yǎng)懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是指將組織培養(yǎng)物分離懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是指將組織培養(yǎng)物分離成單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，懸浮在液體培成單細(xì)胞或小細(xì)胞團(tuán)，懸浮在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的方法。養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 1 1、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的要求、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的要求（1 1）細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的材料要求為保持良）細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的材料要求為保持良好分散狀態(tài)的單個(gè)細(xì)胞或小細(xì)胞聚集體。好分散

20、狀態(tài)的單個(gè)細(xì)胞或小細(xì)胞聚集體。細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的材料一般通過愈傷組織細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的材料一般通過愈傷組織反復(fù)繼代培養(yǎng)獲得反復(fù)繼代培養(yǎng)獲得. .選擇疏松易碎的，外觀新鮮濕潤的愈傷組織選擇疏松易碎的，外觀新鮮濕潤的愈傷組織繼代培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過程中繼代培養(yǎng)，在培養(yǎng)的過程中不斷進(jìn)行攪拌和不斷進(jìn)行攪拌和振蕩振蕩, ,使愈傷組織上的細(xì)胞被剝落到培養(yǎng)液中，使愈傷組織上的細(xì)胞被剝落到培養(yǎng)液中，得到分散程度高的游離細(xì)胞懸浮物得到分散程度高的游離細(xì)胞懸浮物. .（2 2）細(xì)胞接種）細(xì)胞接種：細(xì)胞：細(xì)胞合適的接種率為合適的接種率為1 1:10(:10(細(xì)胞細(xì)胞: :占培養(yǎng)基占培養(yǎng)基)。( (3)3)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)條件細(xì)胞懸

21、浮培養(yǎng)條件: :懸浮培養(yǎng)通常采用水平振蕩，速率為懸浮培養(yǎng)通常采用水平振蕩，速率為30-30-150150r/minr/min，或者通入氣體攪拌?；蛘咄ㄈ霘怏w攪拌。溫度溫度24-3024-30為宜。為宜。 pHpH值為值為5-75-7。(4)(4)植物細(xì)胞都是植物細(xì)胞都是好氧性好氧性的，因此需要連續(xù)不斷地的，因此需要連續(xù)不斷地供氧供氧。但是。但是需氧量較低，最大氧攝入速率需氧量較低，最大氧攝入速率1-3.5 1-3.5 mmol/hmmol/h，而微生物細(xì)而微生物細(xì) 胞是胞是5-90 5-90 mmol/hmmol/h. .2 2、懸浮細(xì)胞的生長與增殖、懸浮細(xì)胞的生長與增殖懸浮細(xì)胞擴(kuò)增生長曲線為

22、懸浮細(xì)胞擴(kuò)增生長曲線為S S型，型，經(jīng)歷經(jīng)歷延遲期，生長期和直線生長期，減延遲期，生長期和直線生長期，減慢期和靜止期。慢期和靜止期。圖圖5-6懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長曲線 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞起始密度一般應(yīng)在懸浮培養(yǎng)細(xì)胞起始密度一般應(yīng)在0 05-2.5 5-2.5 10105 5cellscellsmLmL，在培養(yǎng)過程中增加到在培養(yǎng)過程中增加到1-4 1-4 10106 6mLmL，每個(gè)細(xì)每個(gè)細(xì)胞平均分裂胞平均分裂4-64-6次，歷經(jīng)次，歷經(jīng)18-2518-25d d。 3 3、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)注意問題注意問題（1）防止細(xì)胞凝聚成塊）防止細(xì)胞凝聚成塊 植物細(xì)胞具有植物細(xì)胞具有聚聚集

23、集在一起的特性，它們?nèi)菀拙奂杉?xì)胞團(tuán)在一起的特性，它們?nèi)菀拙奂杉?xì)胞團(tuán)（2-200個(gè)細(xì)胞，直徑個(gè)細(xì)胞，直徑2mm），），或者細(xì)胞或者細(xì)胞分裂后沒有分離或分泌的粘多糖和蛋白質(zhì)分裂后沒有分離或分泌的粘多糖和蛋白質(zhì)-細(xì)胞密度過大或粘性高引起混合和循細(xì)胞密度過大或粘性高引起混合和循環(huán)的不良。細(xì)胞增殖速度變慢，影響產(chǎn)物環(huán)的不良。細(xì)胞增殖速度變慢，影響產(chǎn)物的質(zhì)量和產(chǎn)量。的質(zhì)量和產(chǎn)量。( (2 2) )剪切力的影響剪切力的影響 植物細(xì)胞壁脆，植物細(xì)胞壁脆，對剪切力敏感。對剪切力敏感。剪切力積極影響表現(xiàn)為增加通氣剪切力積極影響表現(xiàn)為增加通氣, ,保持良好的混合狀態(tài)和細(xì)胞分散保持良好的混合狀態(tài)和細(xì)胞分散性性,

24、, 對細(xì)胞生長繁殖有利，提高對細(xì)胞生長繁殖有利，提高細(xì)胞產(chǎn)率和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量細(xì)胞產(chǎn)率和次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量 多數(shù)情況下則呈現(xiàn)副作用多數(shù)情況下則呈現(xiàn)副作用, ,較高的較高的攪拌速度會造成細(xì)胞損傷攪拌速度會造成細(xì)胞損傷, ,引起胞引起胞內(nèi)化合物的釋放，影響細(xì)胞形態(tài)、內(nèi)化合物的釋放，影響細(xì)胞形態(tài)、代謝和產(chǎn)率及聚集狀態(tài)等。代謝和產(chǎn)率及聚集狀態(tài)等。 因此要選擇合適的攪拌方式因此要選擇合適的攪拌方式. .（3）保持細(xì)胞培養(yǎng)無菌 植物細(xì)胞培養(yǎng)成分復(fù)雜而豐富，適合真菌生長，植物細(xì)胞培養(yǎng)成分復(fù)雜而豐富，適合真菌生長， 植物細(xì)胞生長速度慢，生長周期長，植物細(xì)胞生長速度慢，生長周期長， 要要2-32-3周或者周或者2-32-3個(gè)月個(gè)月 極易造成污染。極易造成污染。 所以在植物細(xì)胞培