纖維蛋白原的檢測(cè)方法及進(jìn)展

1、李志芳纖維蛋白原及其檢測(cè)進(jìn)展纖維蛋白原及其檢測(cè)進(jìn)展v即凝血因子I，是血漿中含量最高的一種凝血蛋白是凝血系統(tǒng)的核心蛋白質(zhì)，它在凝血過程的最后階段被凝血酶轉(zhuǎn)化成纖維蛋白單體，最終形成不溶性纖維蛋白凝塊而發(fā)揮血液凝固作用。纖維蛋白原纖維蛋白原(flbfinogen，F(xiàn)g)vFg是分子量為340 KDa的血漿糖蛋白，由肝細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成，約占血漿總蛋白的2 3 % 。健康人血漿中濃度為2040 gL，電泳分離顯示在2區(qū)帶。v在結(jié)構(gòu)上Fg是由兩條A鏈、兩條B鏈和兩條鏈組成，每三條肽鏈（A、B、肽鏈）絞合成索狀，形成兩條索狀肽鏈，兩者的N-端通過二硫鍵相連，整個(gè)分子成纖維狀。纖維蛋白原結(jié)構(gòu)纖維蛋白原結(jié)構(gòu)

2、纖維蛋白原功能纖維蛋白原功能v血漿Fg主要的生理功能是作為凝血蛋白(又稱凝血因子)直接參與體內(nèi)凝血過程，是纖維蛋白的前體，在凝血機(jī)制中參與凝血共同途徑，由可溶性Fg轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄岳w維蛋白，使血液凝固。(主要功能是它的可凝固性)v機(jī)制：機(jī)制：在凝血酶作用下，纖維蛋白原分子中的兩條鏈的A肽和兩條鏈的B肽都斷裂，形成纖維蛋白單體 ，凝血酶對(duì)纖維蛋白原的 鏈無裂解作用。v纖維蛋白單體生成后即開始聚合成纖維蛋白。在纖維蛋白穩(wěn)定分子（a）作用下，經(jīng)過共價(jià)交聯(lián)的纖維蛋白網(wǎng)更加牢固。纖維蛋白與凝血酶有高親和力，因此纖維蛋白生成后即能吸附凝血酶，有助于局部血凝塊的形成v當(dāng)Fg值超過正常參考范圍(2040 gL)

3、時(shí)，即表示凝血功能異常；若低于15 gL時(shí)，機(jī)體出血的概率明顯增加 vFg同時(shí)又是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，其增加往往是機(jī)體的一種非特異性反應(yīng)，血漿Fg升高（4g/L）見于糖尿病、急性傳染病、腎病綜合癥、妊高癥、心腦血管疾病、惡性腫瘤等v纖維蛋白原減少（2g/L）見于彌散性血管內(nèi)凝血、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎等纖維蛋白臨床意義纖維蛋白臨床意義纖維蛋白原與心腦血管疾病纖維蛋白原與心腦血管疾病v心腦血管疾病是現(xiàn)代人群中的常見病，其發(fā)生大都存在著Fg的異常增高。 Fg是血漿黏度增高的主要因子,Fg能增強(qiáng)紅細(xì)胞和血小板聚集性，提高全血黏度，使血液處于高凝和高黏狀態(tài)，影響組織血液灌注，促使血栓形成。纖維蛋白原

4、與腎病糖尿病纖維蛋白原與腎病糖尿病v腎病綜合征及慢性腎病患者均存在高凝狀態(tài)，F(xiàn)g含量增高為其重要特征。v機(jī)制：尿中大量丟失以白蛋白為主的小分子量蛋白質(zhì)，出現(xiàn)低蛋白血癥，刺激肝臟代償性合成蛋白質(zhì)增多，血漿Fg和凝血因子活性增高被認(rèn)為是肝臟合成蛋白質(zhì)增多的一種表現(xiàn)，這兩種高分子量的凝血前質(zhì)不能由尿丟失，它們?cè)谘獫{中的高濃度、高活性是腎病綜合征血栓形成的部分危險(xiǎn)因素。 v糖尿病是血栓前狀態(tài)，其血漿黏度、Fg濃度均明顯高于正常。v改善體內(nèi)血漿黏度和Fg含量對(duì)控制和治療腎病糖尿病有著重要的意義。纖維蛋白原與纖維蛋白原與DICv纖維蛋白原減低見于DIC：彌漫性血管內(nèi)凝血，激活纖維蛋白溶解酶原，使血中纖維蛋

5、白溶解酶活力增加，溶解纖維蛋白，消耗體內(nèi)原有的Fg，使其含量減少 纖維蛋白原的檢測(cè)方法纖維蛋白原的檢測(cè)方法v近年來對(duì)纖維蛋白原的測(cè)定日益重視，對(duì)其測(cè)定的精度也提出了更高的要求 ：美國(guó)規(guī)定檢測(cè)結(jié)果在靶值20 的范圍內(nèi)，目前測(cè)定主要包括Fg血漿水平、亞組分(HF和LF) 、纖維蛋白單體聚集功能、基因多態(tài)性等幾個(gè)方面，其中血漿Fg含量測(cè)定最為常用v血漿Fg含量測(cè)定方法多達(dá)數(shù)十種，按原理分為三類，即功能、物理化學(xué)和免疫學(xué)測(cè)定法v(一一)功能測(cè)定法功能測(cè)定法 該法又稱為可凝固蛋白法，即將Fg作為可凝固蛋白來測(cè)定，因普遍認(rèn)為Fg的主要特性是其可凝性，所以血漿可凝固Fg的檢測(cè)已成為Fg的主要評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)v功能測(cè)

6、定法利用Fg特異的2種生化反應(yīng)，即凝血酶的蛋白水解作用和隨后發(fā)生的纖維蛋白單體聚集為纖維蛋白多聚體。在這些 方法中，通過加入凝血酶形成纖維蛋白凝塊后的檢測(cè)手段不同，又可分為重量測(cè)定法、酚試劑比色法、紫外光度法、濁度法和凝血酶凝固時(shí)間法等。v1重量測(cè)定法重量測(cè)定法 將Fg轉(zhuǎn)變成纖維蛋白凝塊經(jīng)反復(fù)洗滌脫水后，用精密天平(精確到0000 1 g)稱重。該法簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的操作或精密儀器，技術(shù)誤差很小。在80年代有一些大型流行病學(xué)研究將該法作為參考方法v2酚試劑比色法酚試劑比色法 在世界衛(wèi)生組織(wH0)推薦的參考方法出來前曾作為參考方法。該法將過量的凝血酶加入血漿中，將產(chǎn)生的纖維蛋白凝塊洗滌數(shù)次后

7、溶于NaOH溶液中。用FolinCiocalteau酚試劑或Biuret反應(yīng)來測(cè)定。v3.紫外光度法紫外光度法 該法將纖維蛋白凝塊溶解于堿性尿素溶液中，然后通過在280nm波長(zhǎng)紫外光直接比色計(jì)算纖維蛋白原的含量 在此基礎(chǔ)上，又發(fā)展成為2種參考方法，即Ancrod法和改良的Jacobsson法 vAncrod法: Ancrod(凝血酶代替品)對(duì)Fg有高特異性，不象凝血酶會(huì)作用于除Fg外的其他幾種血漿蛋白，如因子 。純化的Ancrod只作用于a鏈并釋放A纖維蛋白肽，而不會(huì)被血漿中的肝素抑制，并對(duì)纖維蛋白降解產(chǎn)物靈敏度低。在許多方法不能檢測(cè)到Fg的低濃度血漿中，該法仍有大量凝塊形成，而且比酚試劑比色

8、法重復(fù)性更好。此法在70年代的一些方法學(xué)研究中曾作為參考方法v改良的改良的Jacobsson法法 是WHO推薦的參考方法，為第1個(gè)血漿Fg國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(89644)制備時(shí)所推薦使用的方法。該法準(zhǔn)確并滿足2項(xiàng)有效測(cè)定Fg的主要標(biāo)準(zhǔn)：首先通過凝血酶將可凝固的Fg從血漿中分離出來，其次使用了簡(jiǎn)便的分光光度法獨(dú)立操作的定量步驟.v4濁度法濁度法 該法原理是用凝血酶凝固的血漿，纖維蛋白形成增加了濁度，并達(dá)到一個(gè)與Fg濃度成比例的最后濁度。這種方法靈敏度低，對(duì)Fg的最低檢測(cè)限為0.5 gL。v5動(dòng)態(tài)動(dòng)態(tài)Fg測(cè)定法測(cè)定法(kinetic fibrinogen assay，KFA) 該法基于纖維蛋白凝塊形成的動(dòng)

9、態(tài)反應(yīng)，通過類似凝血酶將Fg轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的作用，測(cè)定由于纖維蛋白聚集而引起的濃度增加。該法使用由天然血漿提供的凝血因子，因此非常近似凝血酶和Fg在體內(nèi)的反應(yīng)。KFA法不僅可靠準(zhǔn)確而且可全自動(dòng)化，在常規(guī)檢測(cè)中極為簡(jiǎn)便快速。該法與WHO推薦的參考方法和Claus法均有很好的相關(guān)性，且不受肝素和香豆素治療的影響v6. von Clauss法 這是美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦的常規(guī)方法，是最常用的可凝固法，美國(guó)1975年使用率已占94 ，此法具有簡(jiǎn)單、方便、快速、亦可達(dá)到一定精密度和準(zhǔn)確度的優(yōu)點(diǎn) 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心1999年也VonClauss法為常規(guī)測(cè)定方法v原理原理：凝血酶可

10、將可溶性血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成不溶性的多倍體纖維素，在高濃度凝血酶及低濃度纖維蛋白原Fg(00508 gL)的條件下血漿凝固時(shí)間由纖維蛋白原濃度決定，在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，凝血酶凝固時(shí)間與纖維蛋白原濃度呈負(fù)相關(guān)的線性關(guān)系v功能法準(zhǔn)確特異，是wH0推薦的參考方法(Jacobsson法)和NCCLS推薦的常規(guī)方法。但這類方法的缺點(diǎn)是：在2個(gè)方面可引起測(cè)定誤差，一是測(cè)定的是纖維蛋白而非Fg。已知Fg變成纖維蛋白時(shí)，會(huì)切下2個(gè)短肽，這樣，纖維蛋白實(shí)際上比Fg的質(zhì)量少了約10。二是纖維蛋白一旦形成，就會(huì)吸附一些凝血因子或纖溶因子，這樣又會(huì)增加所測(cè)Fg的量。此外，在獲得纖維蛋白和洗滌時(shí)比較麻煩且難以做到完全

11、徹底，還容易造成污染。另外還易受肝素等抗凝藥物影響v(二二)物理化學(xué)測(cè)定法物理化學(xué)測(cè)定法 這類方法在我國(guó)應(yīng)用最廣，可分為鹽析法、熱沉淀法和電泳法等幾種。v1鹽析法鹽析法 即通過亞硫酸鈉、硫酸銨、甘氨酸或氯化鈉等鹽析后用蛋白質(zhì)顯色劑顯色或比濁法測(cè)定，常見的方法如雙縮脲法，即使用125 亞硫酸鈉溶液將血漿中Fg沉淀分離，然后以雙縮脲試劑顯色。常用的鹽溶液中，除甘氨酸為特異性沉淀外，其余均為非特異性沉淀，而甘氨酸的特異性也僅限于正常血漿；在異常血漿中，甘氨酸的沉淀特異性會(huì)受到很大干擾。所以，現(xiàn)在普遍認(rèn)為這類方法欠準(zhǔn)確。v2、熱沉淀法、熱沉淀法 即將血漿加熱到56，沉淀的Fg 用離心或非免疫學(xué)的濁度法

12、測(cè)定。這類方法簡(jiǎn)單快速，適于寬范圍的Fg濃度測(cè)定，且纖維蛋白降解產(chǎn)物即使處于高濃度也不會(huì)干擾此法，但特異性仍較差，一些研究指出該法與Clauss法的結(jié)果差異有顯著性。v3電泳法電泳法 原理是利用Fg電泳時(shí)特征性的遷移率。但Fg是一種相對(duì)較少的蛋白成分，故密度測(cè)定掃描在一定程度上不準(zhǔn)確，而且這種方法太繁瑣、費(fèi)時(shí)，不適于常規(guī)工作v這類方法都比較簡(jiǎn)單、快速，尤其適于急診檢驗(yàn)，但缺點(diǎn)是本法的特異性不強(qiáng)。所測(cè)的不是有凝固功能的纖維蛋白原，可能包括部分的降解產(chǎn)物和/或其它蛋白。而電泳法又太繁瑣，不適于常規(guī)工作。 v(三三)免疫學(xué)測(cè)定法免疫學(xué)測(cè)定法 這類方法是將純Fg作為抗原免疫動(dòng)物，制成多克隆或單克隆抗體

13、，然后用其致敏膠乳或以被動(dòng)或反向血凝、免疫比濁、單向免疫擴(kuò)散、火箭電泳、放射免疫及ELISA 等免疫學(xué)技術(shù)測(cè)定Fgv免疫學(xué)方法簡(jiǎn)便快速(除RIA)，與參考方法及Claus法的結(jié)果比較相關(guān)性好，但除可凝固的Fg外，還可測(cè)定變性Fg(如無功能Fg )和Fg降解產(chǎn)物(如果采用多克隆抗體)。v當(dāng)Fg存在異質(zhì)性(如惡性腫瘤、纖溶綜合征、消耗性凝血病等)時(shí)不會(huì)對(duì)免疫法產(chǎn)生明顯干擾。但由于血漿中存在大量無功能的Fg，用功能法測(cè)定時(shí)結(jié)果明顯偏低，而用免疫法或物理化學(xué)法測(cè)定，結(jié)果多正常?？偟恼f來，免疫學(xué)方法用于臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)室仍存在一定問題。 (四四)其他方法或技術(shù)其他方法或技術(shù)v1PT演算法演算法 該法根據(jù)PT

14、測(cè)定完成時(shí)，全部Fg均變成纖維蛋白，其形成的濁度或A 改變值與纖維蛋白的含量呈正比，因此可由產(chǎn)生的濁度推算出Fg含量。該法常見于一些自動(dòng)血凝分析儀上，測(cè)定PT的同時(shí)報(bào)告Fg值。一些文獻(xiàn)報(bào)道，在Fg含量正常時(shí)，該法與ClausS法相關(guān)性好，但當(dāng)Fg減低時(shí)，結(jié)果可能偏高。所以，雖然該法經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)單、快速，但如發(fā)現(xiàn)Fg含量較低或較高，應(yīng)改用Clauss法。也有學(xué)者認(rèn)為PT演算法與Clauss,法在正常及異常范圍均有明顯差異v2粘度測(cè)定法粘度測(cè)定法 由于Fg外形呈球狀且較大，故對(duì)血漿粘度影響很大，因此可通過從血漿粘度中扣除血清粘度來測(cè)定。粘度測(cè)定法與Clauss法相關(guān)性較好，其重復(fù)性比Clauss法在低

15、Fg濃度時(shí)略差，在中等濃度時(shí)相當(dāng)，在高濃度時(shí)稍好一些，其所需標(biāo)本量相對(duì)較大。雖然這是一種老方法，但對(duì)擁有毛細(xì)血管粘度計(jì)的實(shí)驗(yàn)室不失為一種廉價(jià)、快速且重復(fù)性好的可選方法v總之，所有血漿Fg測(cè)定方法中，功能法的精密度、準(zhǔn)確度、與參考方法的相關(guān)性最好，其中又以clauss 法為佳。物理化學(xué)法雖然相關(guān)性和精密度尚可，但準(zhǔn)確度較差，免疫法也是如此?，F(xiàn)有方法除本身存在不足之處外，還有許多干擾因素，如纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物、抗凝藥物等；另功能法還受Fg異質(zhì)性的影響v在血凝儀上測(cè)定纖維蛋白原方法主要有兩種，一是Von clauss法，另一種是P演算法v2008年室間質(zhì)評(píng)中有70家（38%）的實(shí)驗(yàn)室使用Clau

16、ss法，有43家（23.4%）使用PT一衍生法，40%實(shí)驗(yàn)室填報(bào)其它（不清楚檢測(cè)方法）項(xiàng)項(xiàng)目目批號(hào)批號(hào)組組實(shí)驗(yàn)室數(shù)實(shí)驗(yàn)室數(shù)平均值平均值標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)差變異系數(shù)（變異系數(shù)（%） 最大值最大值最小值最小值FIB200806缺省組缺省組154294.2 24.63 8.37 368.0 235.0 PT演算法組演算法組32302.8 25.77 9.39 378.7 264.9 Clauss法組法組67290.6 27.28 8.51 368.0 235.0 200807缺省組缺省組162349.2 42.41 12.15 448.0 230.0 PT演算法組演算法組35360.6 49.22 13.6

17、5 489.0 232.0 Clauss法組法組68347.6 39.39 11.33 443.1 264.0 200808缺省組缺省組162351.2 46.20 13.15 477.3 217.0 PT演算法組演算法組35363.8 53.40 14.68 499.0 217.0 Clauss法組法組68349.4 40.95 11.72 463.3 236.0 200809缺省組缺省組161351.0 46.09 13.13 485.3 221.0 PT演算法組演算法組33357.7 46.71 13.06 445.6 221.0 Clauss法組法組67347.5 40.89 11.7

18、7 437.1 226.0 200810缺省組缺省組161350.0 48.34 13.81 490.0 218.0 PT演算法組演算法組36371.6 76.62 20.62 596.3 218.0 Clauss法組法組68348.4 42.49 12.19 463.3 231.1 血漿血漿Fg測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化vl 血血漿纖維蛋白原測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)漿纖維蛋白原測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品品在國(guó)際參考制品出現(xiàn)前，F(xiàn)g的檢測(cè)方法多種多樣，同一方法的試劑盒其生產(chǎn)商所用的標(biāo)準(zhǔn)品也不盡一致，有研究將這些標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)可凝固Fg差異可達(dá)200。因此，需要建立一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)定各地區(qū)的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品，并實(shí)現(xiàn)逐級(jí)質(zhì)控，從而促使全球血漿Fg含量的檢測(cè)既具有廣泛的可比性，又盡可能準(zhǔn)確可靠。vWHO組織研究并于1992年建立了第1個(gè)血漿Fg國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(編號(hào)89644，取值24 mgm1) ，邁出了Fg標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵一步。該標(biāo)準(zhǔn)品建立后，其使用得到普及，但該標(biāo)準(zhǔn)品在復(fù)溶時(shí)有些混濁，長(zhǎng)期存放后尤為明顯。WHO于1999年又建立了第2個(gè)血漿Fg國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(編號(hào)98612，取值22 mg安瓿)以代替前一標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過近幾年的普及，血漿Fg測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化已經(jīng)成形。 2.纖維蛋白原（