藥理檢測技術(shù)講課教案

1、藥理檢測技術(shù)(二) 實(shí)驗(yàn)治療學(xué)方法 這是預(yù)先用實(shí)驗(yàn)病理學(xué)方法使動物產(chǎn)生病理變化，或造成病理模型以觀察中藥治療作用的一種方法。如家兔喂食含1雙氫膽固醇飼料，24周即可形成多發(fā)性膽固醇結(jié)石；大鼠在乙醚麻醉下剖腹，于幽門和十二指腸處結(jié)扎，19小時(shí)后取胃剖檢，胃粘膜可出現(xiàn)多處淺表性出血性潰瘍。小鼠腹腔注射10蛋黃可使血脂升高。對這些動物模型分別給予相應(yīng)的中藥治療，觀察其治療效果。這種實(shí)驗(yàn)方法既可在整體動物（體內(nèi)）進(jìn)行，也可采用培養(yǎng)細(xì)菌、病毒、寄生蟲及腫瘤細(xì)胞等方法在體外進(jìn)行試驗(yàn)。(三) 臨床藥理學(xué)方法 由于種屬差異，動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不能直接搬用于人體，因此，在通過系統(tǒng)的動物實(shí)驗(yàn)取得充分資料后，還必須在人

2、體進(jìn)行觀察，只有這樣才能對中藥作出最后的準(zhǔn)確評價(jià)，這就是臨床藥理學(xué)方法。由于人體試驗(yàn)必須保證安全，進(jìn)行人體試驗(yàn)的中藥必須要有充分的動物實(shí)驗(yàn)資料或古代及民間的使用經(jīng)驗(yàn)，才能進(jìn)行人體試用、隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，許多臨床藥理觀察可在不損傷人體的情況下進(jìn)行。除了采用CT、ECT、MRI等先進(jìn)儀器進(jìn)行整體觀察以外，還可采用正常人或病人的血液、骨髓、肝活組織等樣本，以及外科手術(shù)切除的人體組織或器官如子宮、肺葉等，進(jìn)行體外藥理試驗(yàn)。 (四) 新技術(shù)在中藥藥理研究中的應(yīng)用 隨著藥理科學(xué)的不斷深入，藥理研究手段逐漸由生理轉(zhuǎn)變?yōu)樯蛎笇W(xué)手段為主了。成為分子藥理學(xué)的主要內(nèi)容。 藥理作用的觀測和作用機(jī)理的探

3、討內(nèi)容包括： （一）觀測生理機(jī)能的改變。如新藥對中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生興奮還是抑制；對心肌收縮力或胃腸道運(yùn)動是加強(qiáng)還是減弱；對血管或支氣管是擴(kuò)張還是收縮等。 （二）測定生化指標(biāo)的變化，如血糖、電解質(zhì)；生理活性物質(zhì)，如血管緊張素、前列腺素、環(huán)磷苷濃度的改變等。 （三）觀測組織形態(tài)學(xué)變化，如血細(xì)胞大小、甲狀腺大小、腎上腺皮質(zhì)萎縮等1核技術(shù)的應(yīng)用 核素有放射性核素和穩(wěn)定性核素二種。放射性核素可以發(fā)出射線，引起物質(zhì)的電離或激發(fā)，而這種電離作用或激發(fā)作用可以用正比計(jì)數(shù)管、蓋革彌勒計(jì)數(shù)管（GM計(jì)數(shù)管）、電離室、半導(dǎo)體探測器和閃爍計(jì)數(shù)器來測定，不論在體內(nèi)或離體情況下，凡是有放射性核素存在都可以測定。核技術(shù)已較廣泛

4、地應(yīng)用于中藥藥效學(xué)等方面的研究。通過標(biāo)定中藥某種有效成分，通過放射性檢測可以了解其在體內(nèi)的分布情況、存在形式或測定中藥作用后體內(nèi)某些成分含量的變化，有助于了解中藥的某些藥理作用及作用機(jī)理等內(nèi)容。C14a 用于影響心血管系統(tǒng)中藥的研究 近年國內(nèi)對中藥影響心肌細(xì)胞攝取放射性銣和銫進(jìn)行了大量的研究工作。心肌對的攝取量很大程度上取決于心肌內(nèi)毛細(xì)血管的開放數(shù)量和面積。在定條件下，心肌營養(yǎng)性血流量與心肌的銣和銫攝取量成正比關(guān)系。本法可用小鼠為實(shí)驗(yàn)動物，測定靈敏度高，特異性強(qiáng)，安全，操作方便，是篩選抗心絞痛藥和治冠心病藥的重要研究方法。b應(yīng)用放射性同位素測定免疫功能 以-胸腺嘧啶核苷酸（3H-TdR）摻入淋

5、巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)測定細(xì)胞免疫功能；以51Cr標(biāo)記雞紅細(xì)胞釋放試驗(yàn)測定巨噬細(xì)胞吞噬功能；以131I白蛋白膠體顆粒、198Au膠體顆粒及32P標(biāo)記的金黃色葡萄球菌等顆粒狀異物測定單核細(xì)胞吞噬功能。實(shí)驗(yàn)證明人參、黃芪、冬蟲夏草、刺五加等多種中藥及多種中藥多糖（如銀耳多糖、靈芝多糖、人參多糖、香菇多糖等）都具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。如人參皂甙能增加多種多物網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能，增強(qiáng)對血中金黃色葡萄球菌、雞紅細(xì)胞等的吞噬廓清能力；促進(jìn)小鼠IgG；、lgA、IgM的生成；促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化等。c用于影響核苷酸中藥的研究 用-乳清酸摻入可測定RNA的量，銀耳多糖能使正常小鼠RNA的量增加13.6，3HTdR

6、摻入能測定DNA的量，淫洋藿、肉蓯蓉等能促進(jìn)羥基脲所形成的“陽虛”動物的DNA合成增加（從5600848增加到99001660cpmmg。d用于影響環(huán)核苷酸中藥的研究 環(huán)磷酸腺苷（cAMP）和環(huán)磷酸鳥（cGMP）是二種具有重要生物活性的生物信息物質(zhì)，不僅能傳遞生物信息，調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝和機(jī)能活動，而且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。特別是近年來研究表明與免疫的調(diào)控、腫瘤的發(fā)生發(fā)展的調(diào)控都有重要關(guān)系。利用放射性標(biāo)記的cAMP（-cAMP），在液體閃爍計(jì)數(shù)器上測定樣品的放射性強(qiáng)度，可以測得用中藥后對動物組織、血清或細(xì)胞內(nèi)cAMP含量的影響。e用于中醫(yī)動物模型的制備 中醫(yī)有虛瘀等多種臨床證候。在藥理研究時(shí)，用

7、正常動物實(shí)驗(yàn)很難觀察到中藥的確實(shí)療效，還要制備不同證候的動物模型，再用中藥治療，觀察其療效，如用60Co-r射線3.5G-y，照射小鼠全身，造成血虛模型，可使造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞數(shù)目減少，這種血虛與再障性貧血接近。f用于中藥藥動學(xué)研究 應(yīng)用放射性核素標(biāo)記中藥的有效成分來研究中藥在內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，特別是研究血藥濃度隨時(shí)間而變化的規(guī)律，可為選擇合理的給藥方案、確定適宜的劑量、確定給藥時(shí)間間隔、預(yù)測多次給藥后體內(nèi)藥物的蓄積過程和可能出現(xiàn)的毒副作用，為有效、安全用藥提供科學(xué)依據(jù)。2 組織培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用 組織培養(yǎng)是指將機(jī)體的離體器官、組織和細(xì)胞等，在體外人為控制的條件下，使之繼續(xù)生長、繁殖

8、、傳代、維持其生理功能的方法，從而同用于研究其在生理、病理狀態(tài)下以及藥物等因素對其生長、發(fā)育等生命過程的影響。在中藥藥理研究中，組織培養(yǎng)技術(shù)已有較多的應(yīng)用，是體外實(shí)驗(yàn)研究的重要方法，在很多方面可以與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)互相補(bǔ)充，并且有整體實(shí)驗(yàn)或一般離體實(shí)驗(yàn)所不能代替的優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用較多的有如下幾個(gè)方面。a病毒的組織培養(yǎng) 許多病毒株如流感病毒、副流感病毒、皰疹病毒、腺病毒、鼻病毒、乙腦病毒，都能在組織培養(yǎng)中生長，如原代人胚腎單層細(xì)胞培養(yǎng)、原代人胚肺單層上皮細(xì)胞培養(yǎng)、原代人胚肌單層上皮細(xì)胞培養(yǎng)、雞胚培養(yǎng)、原代乳兔腎上皮細(xì)胞培養(yǎng)等。用這些方法可以來研究中藥的抗病毒作用，使用原代人胚肌皮單層細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，從472種中

9、藥中選出抗I型單純皰疹病毒作用最強(qiáng)的10種是青木香、劉寄奴、烏藥、敗醬草、馬尾松。另外，用組織培養(yǎng)法還證明金櫻子根、南蛇藤、一枝黃花、半枝蓮等18種中藥具有抗病毒作用，其中金櫻子根、南蛇藤和馬勃有廣譜抗病毒作用。b心肌細(xì)胞培養(yǎng) 心肌細(xì)胞培養(yǎng)（雞胚心肌組織培養(yǎng)、大鼠心肌組織培養(yǎng)、人胚心肌組織培養(yǎng)等）法既可用于研究中藥對心肌細(xì)胞生長、發(fā)育、代謝、搏動等各種生理功能的影響，又可造成各種細(xì)胞病理模型（如代謝異常、心肌損傷、搏動節(jié)律失常等）。進(jìn)行中藥作用觀察。是篩選對心臟作用的中藥和闡明其作用機(jī)理的一個(gè)重要途徑。已證明元胡、三梭、當(dāng)歸、土鱉蟲等有不同程度地減少體外培養(yǎng)的心肌耗氧量的作用。c腫瘤病細(xì)胞的培

10、養(yǎng) 常用的是Hela細(xì)胞（宮頸癌細(xì)胞株）和鼻咽癌細(xì)胞株的短期體外培養(yǎng)，可用于篩選抗癌中藥。細(xì)胞培養(yǎng)的方法有單層細(xì)胞培養(yǎng)法、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)法和組織缺氧培養(yǎng)法等。測定藥物作用的方法有美藍(lán)試管法、細(xì)胞染色法、放射性核素?fù)饺敕ǎ?TdR摻入法等）等。利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，在抗癌中藥的篩選和作用機(jī)理的研究已做了大量工作。已證明防己、蛇莓、王不留行、冬凌草等對食管癌細(xì)胞有較強(qiáng)的殺傷作用；漢防己甲素抑制人食管癌上皮細(xì)胞的增殖。d其它組織培養(yǎng)技術(shù) 體外培養(yǎng)的二倍體細(xì)胞仍有衰老現(xiàn)象，是篩選抗衰老藥和衰老機(jī)制的較好模型。已證明黃芪能延長人體肺二倍體細(xì)胞自然衰老過程；黃芪還能使人胚腎細(xì)胞和地鼠及小鼠腎細(xì)胞數(shù)量增加、生長旺

11、盛、壽命延長；三七精提物能使正常人肺上皮細(xì)胞核增大和增殖；“壽康”口服液（鹿茸、何首烏等l0余味中藥制成）能顯著延長大鼠、小鼠淋巴細(xì)胞壽命。應(yīng)用雞胚股骨培養(yǎng)法、新生小鼠頭蓋骨-細(xì)胞培養(yǎng)法和雞胚額骨分離細(xì)胞培養(yǎng)法，證明淫羊藿和黃芪注射液都可增加胚胎股骨的長度、重量和對的吸收量。3 免疫學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 免疫學(xué)技術(shù)主要分為免疫化學(xué)、細(xì)胞免疫、血清學(xué)、免疫標(biāo)記技術(shù)等。免疫化學(xué)技術(shù)包括各種類型免疫沉淀檢測方法。如單、雙向免疫擴(kuò)散等各類電泳法。這些方法多用于免疫球蛋白測定、補(bǔ)體測定、溶菌酶測定等。細(xì)胞免疫主要有以測定T細(xì)胞為主的E玫瑰花結(jié)試驗(yàn)、淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、白細(xì)胞移動抑制試驗(yàn)、遲發(fā)型皮膚試驗(yàn)二硝基氯苯（

12、DNCB）的皮膚試驗(yàn)等。應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)，研究中藥對免疫系統(tǒng)各個(gè)方面的影響。 提高細(xì)胞免疫：提高T細(xì)胞比值 促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化 促進(jìn)體液免疫：免疫球蛋白IgM、lgE及 cAMP顯著提高 調(diào)節(jié)免疫功能：補(bǔ)體含量恢復(fù)正常 抑制免疫功能：抑制T細(xì)胞轉(zhuǎn)化4層析法及分光光度法的應(yīng)用 包括薄層色譜、氣相色譜和高效液相色譜等各種色譜技術(shù)。分別可用于使用中藥后體內(nèi)某個(gè)化學(xué)物質(zhì)或中藥有效成分變化的測定。如利用CS-930TLCS儀測定使用絞股藍(lán)以后血清中絞股藍(lán)皂甙的含量，用日立163型氣相色譜儀測定靈芝注射液消除家兔血漿羥自由基的作用；用高效液相色譜法可測定單胺類神經(jīng)遞質(zhì)包括去甲腎上腺素（NA）。多巴胺（DA）和

13、5-羥色胺（5-HT）等，以及這些遞質(zhì)的主要代謝產(chǎn)物如3，4-二羥甲基苯乙二醇（DHPG）。分光光度法 可見分光光度法已廣泛應(yīng)用于血脂（TC、TG、HDL-C、LDL-C等）成分的測定，以觀察降脂藥（如山楂、澤瀉、當(dāng)歸等）的調(diào)血脂作用。也可用于尿蛋白的測定，如觀察復(fù)方黃芪對大鼠血清病型腎炎尿蛋白量的影響；紫外分光光度法在中藥理研究中應(yīng)用也較多，如用于測定腦、肝組織中B型單胺氧化酶（MAO-B）活性，已證明白術(shù)能降低腦組織MAOB活性，而不影響肝MAOB活性，歸牌湯能抑制體外大鼠肝線粒體MAOB活性；人參莖葉皂甙能提高小鼠紅細(xì)胞過氧化氫酶活性；丁香葉提取物能保護(hù)鄰苯三酚的老化人紅細(xì)胞膜（降低白氧化速率）。用熒光光度法測定證明，首烏能降低老年鵪鶉血漿中過氧化脂質(zhì)（LPO）。5電子顯微鏡技術(shù)的應(yīng)用 應(yīng)用電子顯微鏡技術(shù)研究生物和人體的超微結(jié)構(gòu)，使人們對于組織細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系的認(rèn)識達(dá)到了新的水平。近年來，我國科研人員應(yīng)用電鏡技術(shù)在中藥和方劑的藥理作用、中醫(yī)基礎(chǔ)理論及中醫(yī)臨床等方面的研究工作中已做了大量的工作，在中藥及方劑的藥理研究中尤為突出。6其它新技術(shù)的應(yīng)用 化學(xué)發(fā)光法 用化學(xué)發(fā)光分析儀測定光子數(shù)值可反映活性氧（包括單氧、超氧陰離子、過氧化氫和羥基梓自由基OH）的綜合變化。 功率潛分析法 將八道腦電圖機(jī)(NB82B)的信號用計(jì)算機(jī)進(jìn)行積分的教學(xué)處理和頻譜分析