ELISA知識(shí)簡(jiǎn)介

1、ELISA ELISA 知識(shí)簡(jiǎn)知識(shí)簡(jiǎn)介介1.ELISA的原理的原理2.ELISA的類型的類型3.試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑免疫吸附劑 結(jié)合物結(jié)合物 酶底物的準(zhǔn)備酶底物的準(zhǔn)備 4.對(duì)照設(shè)定對(duì)照設(shè)定5.標(biāo)本的采取和保存標(biāo)本的采取和保存6.結(jié)果判斷結(jié)果判斷 ELISA ELISA是一種免疫測(cè)定（是一種免疫測(cè)定（immunoassayimmunoassay，IAIA） ?；；A(chǔ)礎(chǔ): :抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由

2、此進(jìn)行定性的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析?；蚨糠治?。1.ELISA的原理的原理酶免疫測(cè)定類型酶免疫測(cè)定類型 這種固相酶免疫測(cè)定方法在這種固相酶免疫測(cè)定方法在19711971年最初建立時(shí)稱為酶聯(lián)年最初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（免疫吸附劑測(cè)定（Enzyme Linked ImmunoSorbentEnzyme Linked ImmunoSorbent AssayAssay），簡(jiǎn)稱），簡(jiǎn)稱ELISAELISA。酶免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫組化酶免疫測(cè)定酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定非均相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定固相酶免疫測(cè)定液相酶免疫測(cè)

3、定液相酶免疫測(cè)定1.11.1抗原抗體反應(yīng)抗原抗體反應(yīng) 1.1.11.1.1可逆性可逆性 抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過(guò)程是一種動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：動(dòng)態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+AbAgAg+AbAgAbAb 抗體的親和力（抗體的親和力（affinityaffinity），可以用平衡常數(shù)），可以用平衡常數(shù)K K表表示：示：K=AgK=AgAbAbAgAbAgAb ,Ag ,AgAbAb的解離程度與的解離程度與K K值有值有關(guān)。關(guān)。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不

4、易解離。間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固，不易解離。解離解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性。1.1.21.1.2特異性特異性 抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合抗原抗體的結(jié)合發(fā)生在抗原的決定簇與抗體的結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的位點(diǎn)之間。化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，具有高度的特異性。特異性。 測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物。1.1.31.1.3最適比例最適比例 1.1.41.1.4敏感性敏感性化學(xué)比色法的敏感度為化學(xué)比色法的敏感度為mg/mlmg/ml水平水平酶反應(yīng)測(cè)

5、定法的敏感度約為酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5-10g/ml5-10g/ml免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿相仿標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)標(biāo)記的免疫敏感度可提高數(shù)千倍，達(dá)ngng/ml/ml水平水平例如，例如，HBsAgHBsAg，其敏感度可達(dá)，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml0.1ng/ml。1.41.4免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以由于各種抗原成份，包括小分子的半抗原，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗

6、體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣。用范圍極廣。2 2ELISAELISA的類型的類型 ELISA ELISA可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑：（1 1）固相的抗原或抗體，即）固相的抗原或抗體，即 免疫吸附劑免疫吸附劑 （immunosorbentimmunosorbent）；（2 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為 結(jié)合物結(jié)合物 （conjugateconjugate）；（3 3）酶反應(yīng)的底物。）酶

7、反應(yīng)的底物。 可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法?？稍O(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。 2.2.12.2.1雙抗體夾心法測(cè)抗原雙抗體夾心法測(cè)抗原此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如此法適用于檢驗(yàn)各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，例如HBsAgHBsAg、HBeAgHBeAg、AFPAFP等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體等。只要獲得針對(duì)受檢抗原的異性抗體，就可用于，就可用于包被固相載體包被固相載體和制備和制備酶結(jié)合物酶結(jié)合物而建立此法而建立此法。2.2.2 2.2.2 雙抗原夾心法測(cè)抗體雙抗原夾心法測(cè)抗體 用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋

8、，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測(cè)定，因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAgHBsAg的檢測(cè)常采用的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。2.2.3 2.2.3 間接法測(cè)抗體間接法測(cè)抗體 傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用利用同一酶標(biāo)抗抗體同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。建立檢測(cè)相應(yīng)抗體的方法。2.2.4 2.2.4 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體競(jìng)

9、爭(zhēng)法測(cè)抗體 當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。純化抗原時(shí)，可用此法檢測(cè)特異性抗體。 2.2.5 2.2.5 競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn)位點(diǎn)，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定，可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合

10、在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等小分子激素、藥物等ELISAELISA測(cè)定多用此法。測(cè)定多用此法。2.2.6 2.2.6 捕獲包被法測(cè)抗體捕獲包被法測(cè)抗體IgMIgM的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人的檢測(cè)常用于傳染病的診斷。用抗人IgMIgM抗體包被抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的固相，以捕獲血清標(biāo)本中的IgMIgM（其中包括針對(duì)抗原的（其中包括針對(duì)抗原的特異性特異性IgMIgM抗體和非特異性的抗體和非特異性的IgMIgM）。）。此法常用于病毒此法常用于病毒性感染的早期診斷。性感染的早期診斷。2.2.7 ABS-ELIS

11、A2.2.7 ABS-ELISA法法 ：固相支持物固相支持物；：樣品；：樣品；：特異性：特異性IgGIgG；：生物素化抗小鼠：生物素化抗小鼠IgG IgG （BiotinBiotin）；）；：辣根過(guò)氧化物酶：辣根過(guò)氧化物酶HRP-HRP-酶標(biāo)鏈親和素（酶標(biāo)鏈親和素（AvidinAvidin）；）；：DABDAB顯色液；顯色液；：顯色；：顯色；3. ELISA3. ELISA的試劑的試劑(A(A、B B、C C三部分三部分) )ELISAELISA中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和中有三個(gè)必要的試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶的底物。酶的底物。（1 1）已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）

12、已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；（2 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；）酶標(biāo)記的抗原或抗體（結(jié)合物）；（3 3）酶的底物；）酶的底物；（4 4）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；）陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5 5）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；）結(jié)合物及標(biāo)本的稀釋液；（6 6）洗滌液；）洗滌液；（7 7）酶反應(yīng)終止液）酶反應(yīng)終止液ELISAELISA的試劑準(zhǔn)備的試劑準(zhǔn)備A A 固相載體固相載體 聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性?；虻鞍踪|(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來(lái)的免疫學(xué)活性。 聚氯乙烯。

13、聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯聚氯乙烯。聚氯乙烯對(duì)蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。高，但空白值也略高。 良好的良好的ELISAELISA板應(yīng)該是板應(yīng)該是吸附性能好吸附性能好，空白值低空白值低，孔底孔底透明度高透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間間性能相近性能相近。3.1.2 3.1.2 包被的方式包被的方式 將抗原或抗體固定在過(guò)程稱為包被將抗原或抗體固定在過(guò)程稱為包被(coating)(coating)。 蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的與聚苯乙烯固相載體是通過(guò)物理吸附結(jié)合的，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏

14、水基團(tuán)與固相載體表面，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團(tuán)與固相載體表面的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受的疏水基團(tuán)間的作用。這種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)疏水基團(tuán)，故更易吸，故更易吸附到固相載體表面。附到固相載體表面。不易吸附不易吸附的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)

15、較多的抗原也可采用捕獲包被法。此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。親和素生物素親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的即用親和素先包被載體，加入生物素化的DNADNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。物質(zhì)的定量測(cè)定。脂類物質(zhì)脂類物質(zhì)無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入乙醇）中溶解后加入ELISAELISA板孔中，開蓋置冰箱過(guò)夜或冷板孔中，開蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相

16、表面。 優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳。抗原用量少，僅為直接包被的性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的1/101/10乃至于乃至于/100/100。包被用抗原：包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原合成多肽抗原是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽是抗原決定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高片段。一般只含有一個(gè)抗原決定簇，純度高，特異性也高，但由于分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助，但由于分子量太小，往往難于直接

17、吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面于偶聯(lián)物與固相載體的吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。3.1.4 3.1.4 包被用抗體包被用抗體IgGIgG對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在對(duì)聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在FcFc段上，抗體段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液取材于抗血清或含單克隆抗體的培養(yǎng)液. .須除去雜抗體后須除去雜抗體后才能用于才能用于ELISAELISA，以保證試驗(yàn)的特異性。，以保證試驗(yàn)的特異性。腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作腹水中單抗的濃度較高，特異性亦較強(qiáng)，因此不需要作吸收層析處理，直接

18、包被。在某些情況下，用多種單抗吸收層析處理，直接包被。在某些情況下，用多種單抗混合包被，可取得更好的效果?；旌习?，可取得更好的效果。3.1.5 3.1.5 包被的條件包被的條件pH9.6pH9.6碳酸鹽緩沖液碳酸鹽緩沖液pH7.2pH7.2的磷酸鹽緩沖液的磷酸鹽緩沖液pH7-8pH7-8的的TrisTris-HCL-HCL緩沖液。緩沖液。 加入包被液后，在加入包被液后，在4-84-8冰箱中放置過(guò)夜，冰箱中放置過(guò)夜，3737中中保溫保溫2 2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)

19、驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為10ng/ml-20ug/ml10ng/ml-20ug/ml。3.1.6 3.1.6 封閉封閉封閉封閉(blocking)(blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥充填這些空隙，從而排斥ELISAELISA后的步驟中干擾物質(zhì)后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附。的再吸附。常用封閉劑：常用封閉劑：0.05%-0.5%0.05%-0.5%的的BSA; 10%BSA; 10%的小

20、牛血清或的小牛血清或1%1%明膠明膠; ;脫脂奶粉脫脂奶粉, ,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（比較價(jià)廉，可以高濃度使用（5%5%）。）。 所有的所有的ELISAELISA固相均需封閉？固相均需封閉？3.4 3.4 洗滌液洗滌液在板式在板式ELISAELISA中，常用的稀釋液為含中，常用的稀釋液為含0.05%0.05%吐溫吐溫2020磷酸鹽緩沖液。磷酸鹽緩沖液。ELISA的試劑準(zhǔn)備的試劑準(zhǔn)備B 3.2 3.2 結(jié)合物結(jié)合物 即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是即酶標(biāo)記的抗體（或抗原）是ELISAELISA中關(guān)鍵的試中關(guān)鍵的試劑劑 1 1 酶的催化活性酶的催化活性 2 2抗體（或抗原）的免疫活性抗體（或抗原）的

21、免疫活性 3 3含有或少含有游離的抗體（或抗原）含有或少含有游離的抗體（或抗原） 4 4結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。結(jié)合物尚要有良好的穩(wěn)定性。3.2.1 3.2.1 結(jié)合物用的抗原和抗體結(jié)合物用的抗原和抗體 制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的制備結(jié)合物時(shí)所用純度較高的IgGIgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)，以免在與酶聯(lián)結(jié)時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣時(shí)其他雜蛋白的干擾。最好用層析純化的抗體，這樣全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋全部酶結(jié)合物均具有特異的免疫活性，可以在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在度進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果本底淺淡。在ELISAELISA中用酶標(biāo)抗中用酶標(biāo)抗原的模式不

22、多，總的要求是抗原必須是高純度的。原的模式不多，總的要求是抗原必須是高純度的。3.2.23.2.2酶酶純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，純度高，催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。來(lái)源豐富，價(jià)格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同的酶。酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保酶結(jié)合物保留活性部分和催化能力，底物易于制備和保存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。存，價(jià)格低廉，有色產(chǎn)物易于測(cè)定等。在在ELISAELISA中，中，HRPHRP，APAP，葡萄糖氧化酶，葡萄糖氧化酶，-D-D-半乳糖苷半乳糖苷酶和脲酶等。酶和脲酶等。HRPHRP

23、是一種糖蛋白，含糖量約為是一種糖蛋白，含糖量約為18%18%，分子量為，分子量為4400044000，是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。）結(jié)合而成，是一種卟啉蛋白質(zhì)。3.2.3 3.2.3 結(jié)合物的制備結(jié)合物的制備酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)酶與蛋白質(zhì)的氨基通過(guò)它而聯(lián)結(jié)

24、。有效（結(jié)合率達(dá)60%-60%-70%70%）和重復(fù)性好。）和重復(fù)性好。 交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)的，結(jié)合物的大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2 2）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將）過(guò)碘酸氧化法：適用含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRPHRP分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的分子表面的多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上的氨基形成氨基形成chiffchiff氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效氏堿而結(jié)合。簡(jiǎn)便有效. . 結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響結(jié)合物中混有的游離酶一般不影響ELI

25、SAELISA中最后的酶活中最后的酶活性測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相性測(cè)定。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗原，因此制備的酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離的酶和抗體后用于檢測(cè)，效果更好?？贵w后用于檢測(cè)，效果更好。 制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這制得結(jié)合物，最適的工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈一濃度時(shí)，能維護(hù)一個(gè)低的本底，并獲得測(cè)定的最佳靈敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。敏度，達(dá)到最合適的測(cè)定條件和測(cè)定費(fèi)用的節(jié)省。3.2.43.2.4結(jié)合物的保存結(jié)合物的

26、保存 酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保存一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外物溶液中加入等體積的甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（再加入抗生素（例如慶大霉素）和防腐劑（HRPHRP結(jié)合結(jié)合物加硫柳泵，物加硫柳泵，APAP結(jié)合物可加疊氮鈉）。結(jié)合物可加疊氮鈉）。3.2.5 3.2.5 結(jié)合物的稀釋液結(jié)合物的稀釋液 用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合用于稀釋高濃度的結(jié)合物以配成工作液。為避免結(jié)合物在反應(yīng)中直

27、接吸附在固相載體上：物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%0.1%牛血清白蛋牛血清白蛋白，白， 0.05%0.05%吐溫吐溫20 20 。試劑盒均已用合適的緩沖液配。試劑盒均已用合適的緩沖液配成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在成工作液，使用時(shí)不需再行稀釋，在4-84-8保存期可達(dá)保存期可達(dá)6 6個(gè)月。個(gè)月。試劑準(zhǔn)備試劑準(zhǔn)備 C 酶的底物酶的底物3.3 3.3 酶的底物酶的底物3.3.1 3.3.1 HRPHRP的底物的底物OPDOPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是處有最高吸收峰，靈敏

28、度高，比色方便，是HRPHRP結(jié)結(jié)合物最常用的底物。合物最常用的底物。 DH2+ H2O2 D+ 2H2O 上式中，上式中， DH2為供氧體，為供氧體， H2O2為受氫體。為受氫體。DH2一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。一般為無(wú)色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺如：鄰苯二胺(OPD)(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺四甲基聯(lián)苯胺(TMB)(TMB)和和ABTS ABTS 。ETMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMBTMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與溶液試劑，只需與H H2 2O O2 2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終

29、止溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，后，TMBTMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量，最適吸收波長(zhǎng)為收波長(zhǎng)為450nm450nm。ABTSABTS雖不如雖不如OPDOPD和和TMBTMB敏感，但空白值極低，也為一些試敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采用。劑盒所采用。HRPHRP對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于對(duì)氫受體的專一性很高，僅作用于H2O2H2O2、小分醇的過(guò)、小分醇的過(guò)氧化物和尿素過(guò)氧化物氧化物和尿素過(guò)氧化物(urea peroxide)(urea peroxide)。 APAP的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)的底物為磷酸酯酶，一般采用對(duì)硝基苯

30、磷酸酯硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在作為底物。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚，在405nm405nm波波長(zhǎng)處有吸收峰。用長(zhǎng)處有吸收峰。用NaOHNaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間。定一時(shí)間。APAP也有發(fā)熒光底物（磷酸也有發(fā)熒光底物（磷酸4-4-甲基傘酮甲基傘酮），可用于），可用于ELISAELISA作熒光測(cè)定，敏感度較高于用作熒光測(cè)定，敏感度較高于用顯色底物的比色法。顯色底物的比色法。3.5 3.5 酶反應(yīng)終止液酶反應(yīng)終止液常用的常用的HRPHRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板度按加量及比色液的最終體積而異，在

31、板式式ELISAELISA中一般采用中一般采用2mol/L2mol/L。4 4 對(duì)照設(shè)定對(duì)照設(shè)定 陽(yáng)性對(duì)照品陽(yáng)性對(duì)照品(positive control)(positive control)和陰性對(duì)照品和陰性對(duì)照品(negative control)(negative control)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。也作為判斷結(jié)果的對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，陽(yáng)性對(duì)照品的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。加入的量應(yīng)與試劑的敏感度相稱；加入的量應(yīng)與試劑

32、的敏感度相稱；在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)在測(cè)定中得到的吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，可以估計(jì)標(biāo)本物質(zhì)的量。標(biāo)本物質(zhì)的量。參考標(biāo)準(zhǔn)品參考標(biāo)準(zhǔn)品 定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有定量測(cè)定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測(cè)定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的圍的4-54-5個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的個(gè)濃度，一般均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑的緩沖液中緩沖液中. .陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。例如HBsAgHBsAg檢檢測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含

33、測(cè)的陰性對(duì)照品中不可含HBsAgHBsAg，最好抗，最好抗HBsHBs也是陰性。也是陰性。5 5 標(biāo)本的采取和保標(biāo)本的采取和保存存 體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測(cè)定其中某種抗體或抗原成份。體或抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原纖維蛋白原和和抗凝劑抗凝劑外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。外，其他成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧血清標(biāo)本應(yīng)避免溶血：紅細(xì)胞溶解時(shí)會(huì)釋放出具有過(guò)氧化物酶活性的物質(zhì)，以化物酶活性的物質(zhì)，以HRPHRP為標(biāo)記的為標(biāo)記的

34、ELISAELISA測(cè)定中，可能測(cè)定中，可能會(huì)增加非特異性顯色。會(huì)增加非特異性顯色。加樣加樣: : 在在ELISAELISA中一般有中一般有3 3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在結(jié)合物，加底物。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在LEISALEISA板孔板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。產(chǎn)生氣泡?；静僮髯⒁馐马?xiàng)基本操作注意事項(xiàng)保溫保溫抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱為溫育抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱為溫育(incubation)(incubation)。ELISAELISA屬固相免疫測(cè)

35、定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面屬固相免疫測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為什么上發(fā)生。為什么ELISAELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育？溫育常采用的溫度有溫育常采用的溫度有4343、3737、室溫和、室溫和44（冰箱溫度（冰箱溫度）等。）等。3737是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。原抗體結(jié)合的合適溫度。保溫方式：保溫方式：ELISAELISA儀器附有特制的電熱塊，水浴。儀器附有特制的電熱塊，水浴。若用保溫箱：若用保溫箱：ELISAELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕的紗布板放在濕盒內(nèi)，在

36、盒底墊濕的紗布，最后將，最后將ELISAELISA板放在濕紗布上。反應(yīng)板均不宜疊放，板放在濕紗布上。反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-2520-25，但具體操作時(shí)可根，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書的要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)據(jù)說(shuō)明書的要求控制溫育。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。不宜多于兩

37、塊板同時(shí)測(cè)定。洗滌洗滌洗滌在洗滌在ELISAELISA過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著過(guò)程中雖不是一個(gè)反應(yīng)步驟，但卻也決定著實(shí)驗(yàn)的成敗。實(shí)驗(yàn)的成敗。ELSIAELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。可以說(shuō)在可以說(shuō)在ELISAELISA操

38、作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。洗滌的方式除某些洗滌的方式除某些ELISAELISA儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外儀器配有特殊的自動(dòng)洗滌儀外，手工操作有，手工操作有流水沖洗式和流水沖洗式和浸泡式兩種：浸泡式兩種：（1 1）流水沖洗式）流水沖洗式 流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也，洗滌液為蒸餾水，自來(lái)水。洗滌效果更為徹底，且也簡(jiǎn)便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微簡(jiǎn)便、快速。已有實(shí)驗(yàn)表明，流水沖洗式同樣適用于微量滴定板的洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳量滴定板的洗滌。讓水流沖

39、擊板孔表面，洗滌效果更佳。 （2 2）浸泡式）浸泡式 微量滴定板多采用。洗滌液為微量滴定板多采用。洗滌液為非離子型洗非離子型洗滌劑滌劑的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是的中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏疏水性水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)的，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。顯色顯色顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一

40、定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。TMBTMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的應(yīng)觀察結(jié)果。但為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。適當(dāng)時(shí)間閱讀結(jié)果。TMBTMB經(jīng)經(jīng)HRPHRP作用后，約作用后，約4040分鐘顯色達(dá)分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐漸減弱，至頂峰，隨即逐漸減弱，至2 2小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。小時(shí)后即可完全消退至無(wú)色。比色比色

41、拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。 以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加以蒸餾水校零點(diǎn)，測(cè)讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可作全過(guò)程的孔），以記錄本次試驗(yàn)的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。白孔的吸光度，然后進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果以光密度（結(jié)果以光密度（oplicaloplical densi

42、ty density，ODOD），現(xiàn)按規(guī)定用），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（吸光度（absorbenceabsorbence，A A），兩者含義相同。通常的表），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫于示方法是，將吸收波長(zhǎng)寫于A A字母的右下角，如字母的右下角，如OPDOPD的吸的吸收波長(zhǎng)為收波長(zhǎng)為492nm492nm，表示方法為，表示方法為AA492492nmnm或或ODOD492492nmnm。酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀酶標(biāo)比色儀簡(jiǎn)稱酶標(biāo)儀，通常指測(cè)讀ELISAELISA光度計(jì)。針光度計(jì)。針對(duì)固相載體形式的不同，各有特制的適用于板、珠和小對(duì)固相載體形式的不同，各有特制

43、的適用于板、珠和小試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀試管的設(shè)計(jì)。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測(cè)讀速度、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性、精確度和可測(cè)范圍、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.0010.001，準(zhǔn)確性為，準(zhǔn)確性為1%1%，重復(fù)性達(dá)，重復(fù)性達(dá)0.5%0.5%。操作時(shí)室溫宜在操作時(shí)室溫宜在15-3015-30，使用前先預(yù)熱儀器，使用前先預(yù)熱儀器15-3015-30分鐘分鐘，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀，測(cè)讀結(jié)果更穩(wěn)定。測(cè)讀A A值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸值時(shí)，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰，如收峰，如OPDOPD用用492nm492nm波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)波長(zhǎng)。有的酶標(biāo)儀可用雙波長(zhǎng)式測(cè)讀。讀。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書。各種酶標(biāo)儀性能有所不同，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說(shuō)明書。6 6 結(jié)果判結(jié)果判斷斷 6.1 6.1 定性測(cè)定定性測(cè)定定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出定性測(cè)定的結(jié)果判斷作出“有有”或或“無(wú)無(wú)