第11章色譜分析法概論(新

1、第11章 色譜分析法概論11.1 概述11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.3 色譜分離的基本理論11.4 色譜法的發(fā)展趨勢11.1概述11.1.1色譜法的起源和發(fā)展 1906年俄國植物學(xué)家茨維特 (M.Tswett) 從分離植物色素實驗中發(fā)明了色譜分離方法。俄國植物學(xué)家茨維特色譜色譜法(Chromatography)石油醚(流動相)碳酸鈣(固定相)純組分色譜柱混合色素葉綠素葉黃素胡蘿卜素表11-1 色譜法的發(fā)展簡史年代發(fā)明者發(fā)明的色譜方法或重要應(yīng)用1906Tswett用碳酸鈣作吸附劑分離植物色素。最先提出色譜概念。1931Kuhn, Lederer用氧化鋁和碳酸鈣分離-,-,-胡蘿卜素。色譜法受重視

2、。1938Izmailov, Shraiber最先使用薄層色譜法。Taylor, Uray用離子交換色譜法分離了鋰和鉀的同位素。1941Martin, Synge提出色譜塔板理論；發(fā)明液-液分配色譜；預(yù)言了氣相色譜。1944Consden等等發(fā)明了紙色譜。1949Macllean在氧化鋁中加入淀粉黏合劑制作薄層板使薄層色譜進入實用階段1952Martin, James從理論和實踐方面完善了氣-液分配色譜法。(1952諾貝爾獎)1956Van Deemter等等提出色譜速率理論，并應(yīng)用于氣相色譜。1957基于離子交換色譜的氨基酸分析專用儀器問世。1958Golay發(fā)明毛細(xì)管柱氣相色譜。1959P

3、orath, Flodin發(fā)表凝膠過濾色譜的報告。1964Moore發(fā)明凝膠滲透色譜。1965Giddings發(fā)展了色譜理論，為色譜學(xué)的發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。1975Small發(fā)明了以離子交換劑為固定相、強電解質(zhì)為流動相，采用抑制型電導(dǎo)檢測的新型離子色譜法。1981Jorgenson等等創(chuàng)立了毛細(xì)管電泳法。表11-2 色譜法起過關(guān)鍵作用的諾貝爾獎研究工作年代獲獎學(xué)科獲獎研究工作1937化學(xué)胡蘿卜素化學(xué)，維生素A和B1938化學(xué)胡蘿卜素化學(xué)1939化學(xué)聚甲烯和高萜烯化學(xué)1950生理學(xué)醫(yī)學(xué)性激素化學(xué)及其分離、腎皮素化學(xué)及其分離1951化學(xué)超鈾元素的發(fā)現(xiàn)1955化學(xué)腦下腺激素的研究和第一次合成聚肽激素

4、1958化學(xué)胰島素的結(jié)構(gòu)1961化學(xué)光合作用時發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)的確認(rèn)1970生理學(xué)醫(yī)學(xué)關(guān)于神經(jīng)元觸處遷移物質(zhì)的研究化學(xué)發(fā)現(xiàn)糖核苷酸及其在生物合成碳水化合物中的作用1972化學(xué)核糖核酸化學(xué)酶結(jié)構(gòu)的研究生理學(xué)醫(yī)學(xué)抗體結(jié)構(gòu)的研究11.1概述11.1.1色譜法的起源和發(fā)展1. 1906，俄國植物學(xué)家 M.Tswett 發(fā)明色譜法，是色譜之父。2. 1931，對液固吸附色譜的杰出貢獻者庫恩，分離出60多種胡蘿卜素，核黃素、維生素，獲1938年諾貝爾化學(xué)獎。3. 蒂塞利烏斯(Tiselius)因電泳分析方法的研究，發(fā)現(xiàn)血清蛋白組分，獲1948年諾貝爾化學(xué)獎。4. 1941，馬丁(Martin)和辛格(Syn

5、ge)創(chuàng)始分配色譜特別是紙色譜而共獲1952年諾貝爾化學(xué)獎。5. 氨基酸自動分析儀發(fā)明人S穆爾(Stanford Moore)和W.H.斯坦(William Howard Stein),定量分析方法解決了有關(guān)氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)等復(fù)雜的生物化學(xué)問題，獲1972年諾貝爾化學(xué)獎。 色譜法又稱層析法，是一種物理化學(xué)分析方法，它利用不同溶質(zhì)(樣品)與固定相和流動相之間的弱作用力(靜電力、誘導(dǎo)力、色散力和氫鍵)的差別，當(dāng)兩相做相對移動時，各溶質(zhì)在兩相間進行多次“平衡”，實現(xiàn)差速移行，使各溶質(zhì)達到相互分離。 固定相：在色譜分離中固定不動，對組分產(chǎn)生保留的作用一相。 流動相：帶動組分向前移動的另一相，與固定

6、相處于平衡狀態(tài)。 分離對象：各組分分子之間的結(jié)構(gòu)相似、性質(zhì)相近的混合樣品。11.1概述 11.1.2色譜法的定義與分類1. 定義2. 分類 根據(jù)流動相的狀態(tài)將色譜法分成四大類。表表11-3 色譜法以流動相種類的分類色譜法以流動相種類的分類色譜類型色譜類型流動相流動相主要分析對象主要分析對象氣相色譜法氣體揮發(fā)性有機化合物液相色譜法液體溶于水或有機溶劑的各種物質(zhì)超臨界色譜法超臨界流體各種有機化合物電色譜法緩沖溶液、電場離子和各種有機化合物11.1概述 11.1.2色譜法的定義與分類1. 定義2. 分類11.1概述 11.1.2色譜法的定義與分類1.按兩相分子的聚集狀態(tài)分類2. 按固定相的固定方式分

7、類柱色譜：填充柱、毛細(xì)管柱色譜平面色譜：紙色譜、薄層色譜 分配色譜：利用分配系數(shù)的不同吸附色譜：利用吸附性能的差異離子交換色譜：利用離子交換能力不同空間排阻色譜：利用排阻作用力的不同3.按分離的機制分類液相色譜：液-固色譜、液-液色譜氣相色譜：氣-固色譜、氣-液色譜色譜分類1. 定義2. 分類11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.1 色譜過程11.2.2 色譜法基本術(shù)語11.2.3 色譜法分類11.3.4 色譜基本類型的分離機理11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.1色譜過程 吸附色譜過程的實質(zhì)：色譜過程是吸附與解析的過程；不同組分極性的差異導(dǎo)致吸附與解析的差異；不同組分向前移動的過程是差異不斷累積過

8、程，是在動態(tài)中由量變到質(zhì)變的過程。BAABBABBABABct流動相樣品液色譜柱固定相檢測器11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.3 基本術(shù)語 測定流出組分的濃度對時間或流動相流出體積的曲線，稱為色譜流出曲線、色譜圖。圖11-2 色譜流出曲線AOAEGFH進樣 空氣峰C I DJtBh21h.6670h221/WW0tRRtt信號O01. 色譜流出曲線2. 保留值/相對保留值3. 相平衡參數(shù)4. 分離參數(shù)11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.3 基本術(shù)語 基線、峰高、峰寬、峰面積 峰寬：標(biāo)準(zhǔn)差、峰寬W、半峰寬W1/2圖11-2 色譜流出曲線AOAEGFH進樣 空氣峰C I DJtBh21h.6670h

9、221/WW0tRRtt信號O02/12/1699. 1354. 24WWWW1. 色譜流出曲線2. 保留值/相對保留值3. 相平衡參數(shù)4. 分離參數(shù)11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.3 基本術(shù)語 保留時間 、死時間 、調(diào)整保留時間 ： 保留體積 、死體積 、調(diào)整保留體積 ： 相對保留值(r),也稱分離因子 保留指數(shù)(I)Rt0RR0ttt uLt，RVcR0Rc00FtVVVFtV，12RR1 ,212kkttr)(R)(R)(R)(Rlglglglg100ZnZZxxttttnZI1. 色譜流出曲線2. 保留值/相對保留值3. 相平衡參數(shù)4. 分離參數(shù)0tRt0VRV11.2 色譜法基礎(chǔ)知

10、識11.2.3 基本術(shù)語 分配系數(shù)分配系數(shù)：色譜過程中，在流動相和固定相中的溶質(zhì)分子處于動態(tài)平衡。平衡時組分在固定相(s)與流動相(m)中的濃度(c)之比，稱為分配系數(shù)(K)。msccK K取決于溫度、化合物的組成和性質(zhì)、流動相和固定相的性質(zhì)；K越大表示組分與固定相作用越強、在色譜柱中移行越慢、保留時間越長；色譜分離的前提條件是組分在兩相中的K不同。1. 色譜流出曲線2. 保留值/相對保留值3. 相平衡參數(shù)4. 分離參數(shù)11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.3 基本術(shù)語 容量因子：在平衡狀態(tài)下，組分在固定相(s)與流動相(m)中的質(zhì)量之比： )1 (-0000msmmssktttttttkVVKV

11、cVckRRR， k大的組分在柱中滯留的時間長，較遲流出色譜柱；反之則較早流出色譜柱。若兩組分能被分離，則它們的遷移速度不同、形成差速遷移，即保留時間不等、保留因子也不等。不同組分實現(xiàn)色譜分離的先決條件是組分的保留因子存在差異。 k與組分、固定相和流動相的性質(zhì)及溫度、壓力等有關(guān)，反映組分與固定相和流動相之間作用力的大小。1. 色譜流出曲線2. 保留值/相對保留值3. 相平衡參數(shù)4. 分離參數(shù)11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.3 基本術(shù)語 分離因子：又稱為分配系數(shù)比或選擇性系數(shù)。 分離度：相鄰兩個組分的色譜峰，其保留時間差與兩峰峰底寬平均值之比。;1212RRRR121212KKkkVVtt，。

12、12RRs2112WWttR 1. 色譜流出曲線2. 保留值/相對保留值3. 相平衡參數(shù)4. 分離參數(shù)11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.3 基本術(shù)語設(shè)色譜峰為正常峰，且W1W2，(W1+W2)/2=4。若Rs=1，峰尖距為4，兩峰略有重疊；若Rs=1.5，峰尖距為6，兩峰完全分開。一般規(guī)定兩相鄰峰的Rs1.5作為色譜峰達到分離的指標(biāo)。分離因子僅僅反映兩個組分的熱力學(xué)參數(shù)相比較的關(guān)系，與色譜動力學(xué)參數(shù)(如峰寬)無關(guān)，不能作為完全分離的指標(biāo)；分離度是兩組分的熱力學(xué)參數(shù)保留時間(差值)與動力學(xué)參數(shù)峰寬(平均值)的比值，可作為完全分離的指標(biāo)。1. 色譜流出曲線2. 保留值/相對保留值3. 相平衡參數(shù)4

13、. 分離參數(shù)11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.4 色譜基本類型的分離機理 以固體吸附劑為固定相，利用被分離組分對固定相表面吸附活性中心吸附能力的差別為實現(xiàn)分離。mXmYmaaX圖11-4 吸附色譜示意圖X.溶質(zhì)分子；Y.流動相分子；a. 吸附劑；m.流動相。maamYX YXmmaamaaammaa/ )X(/ )X(XXYXYXVnSnKKnn：，簡化1. 吸附色譜法2. 分配色譜法3. 離子交換色譜法4. 空間排阻色譜法11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.4 色譜基本類型的分離機理 利用被分離組分在固定相或流動相中的溶解度差別而實現(xiàn)分離。固定相為涂漬在多孔惰性載體上的固定液，流動相可為氣體或

14、液體。圖11-5分配色譜示意圖Xm流動相中游離的組分分子Xs固定相中溶解的組分分子mmssmsms/ )X(/ )X(XXVnVnccKmXsXms 根據(jù)固定相和流動相的極性相對強度，分為正相分配色譜和反相分配色譜，流動相的極性比固定相弱的稱為正相分配色譜，流動相的極性比固定相強的，稱為反相分配色譜。1. 吸附色譜法2. 分配色譜法3. 離子交換色譜法4. 空間排阻色譜法11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.4 色譜基本類型的分離機理 以離子交換作用分離離子型化合物的液相色譜法。利用被分離組分的離子交換能力的差別而實現(xiàn)分離。固定相為離子交換劑，流動相為一定pH和離子強度的緩沖溶液。圖7-6離子交換

15、色譜示意圖1.固定離子；2.可交換離子R.樹脂骨架；m.流動相XRX XRXssKK或m21RRXY RYXRXY RYX：陰離子交換反應(yīng)陽離子交換反應(yīng)1. 吸附色譜法2. 分配色譜法3. 離子交換色譜法4. 空間排阻色譜法 陽樹脂和陰樹脂的失活與再生。11.2 色譜法基礎(chǔ)知識11.2.4 色譜基本類型的分離機理 空間/分子排阻色譜法(SEC)：以凝膠為固定相。有機溶劑流動相凝膠滲透色譜法；水溶液為流動相凝膠過濾色譜法。 利用被分離組分分子大小的不同，在固定相上選擇性滲透實現(xiàn)分離。s0RmspVVVccK分子排阻色譜示意圖Ge.凝膠；m.流動相Gem大分子大分子 應(yīng)用：藥物大分子、生物大分子、

16、合成高分子等。流動相凝膠孔隙1. 吸附色譜法2. 分配色譜法3. 離子交換色譜法4. 空間排阻色譜法11.3 色譜分離的基本理論11.3.1 影響保留行為的因素11.3.2 等溫線11.3.3 塔板理論11.3.4 速率理論11.3.5 影響分離度的因素11.3 色譜分離的基本理論11.3.1 影響保留行為的因素 推導(dǎo)色譜過程方程： 在實驗條件一定時，固定相和流動相的選擇和體積都是確定的，故tR取決于K，也就是取決于組分的性質(zhì)，所以保留時間是對組分進行色譜定性的指標(biāo)。ms0R0Rmsmmss11VVKttkttVVKVcVck：，色譜過程方程保留時間：保留因子：Vs固定相的體積Vm流動相的體積

17、K,tR,組分后出柱K0， 組分不保留K,組分完全保留11.3 色譜分離的基本理論11.3.2 等溫線 在一定溫度條件下，組分在固定相和流動相的分配達到平衡時，在兩相中的濃度之比值K為常數(shù)，由此繪制出的cs與cm的關(guān)系曲線，稱為等溫線。aK=cs/cmbccscmtRcb前延峰a正常峰c拖尾峰11.3 色譜分離的基本理論11.3.2 等溫線 對稱因子/拖尾因子u 完全對：fs=1.00u 對稱峰：fs=0.951.05u 前延峰：fs0.95 (AB)u 拖尾峰：fs1.05 (AB)圖11-5 對稱因子的計算ABAAWfhs2205. 0Wh/2h0.05hW0.05hAB11.3 色譜分離

18、的基本理論11.3.3 塔板理論1.色譜柱是由一系列連續(xù)、等距的水平塔組成，在柱內(nèi)每層塔板內(nèi)部，組分能夠在流動相和固定相兩相中達到平衡。2.流動相通過色譜柱呈間歇式前進運動，每次前進為一個塔板體積。3.樣品和流動相同時加在第一個塔板上，且樣品垂直于前進方向的擴散(即縱向擴散)可以忽略。4.分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)。1. 基本假設(shè)2. 計算公式3. 優(yōu)點和局限11.3 色譜分離的基本理論11.3.3 塔板理論 塔板理論的這些假設(shè)，實際上是把組分在兩相間的連續(xù)轉(zhuǎn)移過程，分解為間歇地在單個塔板中的分配平衡過程，經(jīng)過多次分配平衡后，分配系數(shù)小的組分先達到塔頂(即揮發(fā)性大的組分先流出色譜柱)。色譜柱的塔

19、板數(shù)可高達幾千甚至幾萬，使被測組分在分配系數(shù)間有微小的差別時就可以得到分離。1. 基本假設(shè)2. 計算公式3. 優(yōu)點和局限11.3 色譜分離的基本理論11.3.3 塔板理論1. 基本假設(shè)2. 計算公式3. 優(yōu)點和局限1.000 1.000流動相固定相0.333 0.6670.667 0.333 0.333 0.6670.667 0.333 0.222 0.2220.111 0.4450.445 0.1110.222 0.222 0.222 0.2220.111 0.4450.445 0.1110.222 0.222 0.148 0.0740.148 0.2960.037 0.2970.297 0

20、.0370.296 0.1480.074 0.148N=0N=1N=2N=3 0.148 0.0740.148 0.2960.037 0.2970.297 0.0370.296 0.1480.074 0.148 0.099 0.0250.148 0.1480.074 0.2960.012 0.1980.198 0.0120.296 0.0740.148 0.1480.025 0.099 0.099 0.0250.148 0.1480.074 0.2960.012 0.1960.198 0.0120.296 0.0740.148 0.1480.025 0.099 0.066 0.0080.132

21、 0.0660.099 0.1970.033 0.2630.004 0.1320.132 0.0040.263 0.0330.197 0.0990.066 0.1320.008 0.066N=4進樣分配平衡進氣分配平衡KA=2KB=0.511.3 色譜分離的基本理論11.3.3 塔板理論 理解：在tR一定時，W(W1/2) 越小，N越大，H越小，色譜柱的分離效率越高。因此，理論塔板數(shù)是評價柱效能的指標(biāo)。；22/1R2R2Reff22/1R2R2Reffeff254. 51654. 516WtWttNWtWttNNLHHLNLH有效理論塔板數(shù)：理論塔板數(shù)：有效板高理論塔板數(shù)理論板高1. 基本假設(shè)

22、2. 計算公式3. 優(yōu)點和局限11.3 色譜分離的基本理論11.3.3 塔板理論 優(yōu)點：塔板理論是半經(jīng)驗性理論，在解釋流出曲線的形狀、濃度極大點的位置、評價柱效高低等方面是成功的。 局限：塔板理論的基本假設(shè)與事實不完全相符，它無法解釋譜帶擴展的原因，也無法解釋色譜過程與流動相流速、柱內(nèi)分子擴散傳質(zhì)過程以及色譜操作參數(shù)等動力學(xué)因素的關(guān)系。 這些問題，在速率理論中得到了圓滿的解決。1. 基本假設(shè)2. 計算公式3. 優(yōu)點和局限 為了克服塔板理論的缺陷，Van Deemter等在Martin等人的工作基礎(chǔ)上，比較完整地解釋了速率理論。Giddings等又作了進一步的完善。速率理論充分考慮了溶質(zhì)在兩相間

23、的擴散和傳質(zhì)過程，更接近溶質(zhì)在兩相間的實際分配過程。 當(dāng)溶質(zhì)譜帶向柱出口遷移時，必然會發(fā)生譜帶展寬。譜帶的遷移速率的大小決定于流動相線速度和溶質(zhì)在固定相中的保留值。同一溶質(zhì)的不同分子在經(jīng)過固定相時，它們的遷移速率是不同的，正是這種差異造成了譜帶的展寬。譜帶展寬的直接后果是影響分離效率、降低檢測靈敏度，所以，抑制譜帶展寬就成了高效分離追求的目標(biāo)。 影響塔板高度的動力學(xué)因素：渦流擴散、縱向擴散、傳質(zhì)阻力，這些因素都統(tǒng)一于van Deemter方程中。11.3 色譜分離的基本理論11.3.4 速率理論11.3 色譜分離的基本理論11.3.4 速率理論BCAHCuuBAH2最小符號名 稱單位H塔板高度

24、塔板高度cmA渦流擴散項渦流擴散項cmB縱向擴散系數(shù)縱向擴散系數(shù)cm2s-1C傳質(zhì)阻力系數(shù)傳質(zhì)阻力系數(shù) s u載氣線流速載氣線流速cms-1圖11-6 范氏方程中各項對板高的貢獻0tLu 1. van Deemter方程2. 影響H的動力學(xué)因素11.3 色譜分離的基本理論11.3.4 速率理論Van Deemter方程方程中各項的意義符號名稱關(guān)系式備 注A渦流擴散項(多路徑項)A=2dpdp固定相顆粒平均直徑；渦流擴散因子，與填充的均勻性有關(guān)B/u縱向擴散項(分子擴散項)B=2rDgr 曲折因子，反映固定相顆粒的空間結(jié)構(gòu)。填充柱r0.5-0.7,空心柱r1；Dg 組分分子在載氣中的擴散系數(shù)Cg

25、u氣 相傳質(zhì)阻力項k：容量因子Clu液 相傳質(zhì)阻力項df ：固定液液膜厚度，Cl： 組分在固定液中的擴散系數(shù)gpgDkdkC222101. 0()lflDdkkC222+18=1. van Deemter方程2. 影響H的動力學(xué)因素11.3 色譜分離的基本理論11.3.4 速率理論 渦流擴散：引起渦流擴散的原因是色譜柱內(nèi)的多路徑。溶質(zhì)分子在前進過程中形成的這種紊亂類似于渦流的流動，所以稱之為渦流擴散。A=2dp 。 空心毛細(xì)管柱無多徑相：A=0 ABC柱管壁 固定相 組分移行軌跡初始帶寬譜帶展寬流動相方向1. van Deemter方程2. 影響H的動力學(xué)因素11.3 色譜分離的基本理論11.

26、3.4 速率理論 分子擴散(縱向擴散)：是溶質(zhì)分子在移動方向上向前和向后的擴散，引起譜帶展寬，原因是濃度梯度。分子擴散引起的峰展寬由下式?jīng)Q定：uDuB/2/go式中B為縱向擴散系數(shù)；為彎曲因子，填充柱=0.5-0.7，毛細(xì)管=1；Dg為溶質(zhì)在流動相中的擴散系數(shù)；u 為流動相線速度。1. van Deemter方程2. 影響H的動力學(xué)因素分子擴散引起的色譜峰展寬示意圖11.3 色譜分離的基本理論11.3.4 速率理論 傳質(zhì)阻力(C) ，是溶質(zhì)在固定相中傳質(zhì)阻力系數(shù)與流動相(氣相)傳質(zhì)阻力系數(shù)之和：CClCg流動相傳質(zhì)阻力引起的擴散(Cl)溶質(zhì)分子要從流動相轉(zhuǎn)移到固定相中，就要從流動相主體擴散到氣-液、氣-固、液-液或液-固界面，阻礙這