常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用.

1、目錄目錄常用分子生物學(xué)技術(shù)的常用分子生物學(xué)技術(shù)的原理及應(yīng)用原理及應(yīng)用The Principle and Application of Common Used Techniques in Molecular Biology目錄目錄分子雜交與印跡技術(shù)分子雜交與印跡技術(shù)Molecular Hybridization and Blotting Technique目錄目錄n核酸分子雜交核酸分子雜交 (nucleic acid hybridization) 在在DNA復(fù)性復(fù)性過程中，如果把不同過程中，如果把不同DNA單鏈單鏈分子放在同一溶液中，或把分子放在同一溶液中，或把DNA與與RNA放在一放在一起，只

2、要在起，只要在DNA或或RNA的單鏈分子之間有一定的單鏈分子之間有一定的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形的堿基配對關(guān)系，就可以在不同的分子之間形成雜化雙鏈成雜化雙鏈(heteroduplex) 。一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理一、分子雜交與印跡技術(shù)的原理目錄目錄復(fù)性復(fù)性RNADNA目錄目錄（一）印跡技術(shù)（一）印跡技術(shù)利用各種利用各種物理物理方法使電泳膠中的生物方法使電泳膠中的生物大分子大分子轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)移到NC等各種等各種膜膜上，使之成為上，使之成為固相化分子固相化分子。這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因這一技術(shù)類似于用吸墨紙吸收紙張上的墨跡，因此稱之為此稱之為“blotting”，譯

3、為印跡技術(shù)。，譯為印跡技術(shù)。 目錄目錄用放射性核素、生物素或熒光染料用放射性核素、生物素或熒光染料標記標記其其末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為末端或全鏈的已知序列的多聚核苷酸鏈被稱為“探針探針”，探針可以與固定在，探針可以與固定在NC膜上的核苷膜上的核苷酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。酸結(jié)合，判斷是否有同源的核酸分子存在。 （二）探針技術(shù)（二）探針技術(shù)目錄目錄二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用二、印跡技術(shù)的類別及應(yīng)用（一）（一）DNA印跡印跡 (Southern blotting)（二）（二）RNA印跡印跡 (Northern blotting)（三）蛋白質(zhì)的印跡（三）蛋白質(zhì)的印跡 (We

4、stern blotting)用于基因組用于基因組DNA、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。、重組質(zhì)粒和噬菌體的分析。 用于用于RNA的定性定量分析。的定性定量分析。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。用于蛋白質(zhì)定性定量及相互作用研究。目錄目錄n其他：其他：斑點印跡斑點印跡 (dot blotting) 原位雜交原位雜交 (in situ hybridization)DNA點陣點陣 (DNA array) DNA芯片技術(shù)芯片技術(shù) (DNA chip)目錄目錄三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較分子雜交實驗分子雜交實驗?zāi)夸浤夸浄欧派渖渥宰燥@顯影影照照片片目錄目錄DNA芯片芯片技術(shù)技術(shù)目錄目錄PCR技術(shù)的原理

5、與應(yīng)用技術(shù)的原理與應(yīng)用The Principle and Application of PCR Technology目錄目錄5 Primer 15 Primer 2Cycle 2Cycle 15 5 5 5 5 5 Template DNA一、一、PCR技術(shù)的工作原理技術(shù)的工作原理5 5 5 5 5 5 5 5 目錄目錄Cycle 35 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 2530 次循環(huán)后，模板次循環(huán)后，模板DNA的含量的含量可以擴大可以擴大100萬倍以上。萬倍以上。目錄目錄PCR技術(shù)原理示意圖技術(shù)原理示意圖 目錄目錄n PCR的基本反應(yīng)步驟的基本反應(yīng)步驟變性變性95

6、C95C延伸延伸72C退火退火Tm-5C目錄目錄 模板模板DNA 特異性引物特異性引物 耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶 dNTPs Mg2+n PCR體系基本組成成分體系基本組成成分目錄目錄利用特異性引物以利用特異性引物以cDNA或基因組或基因組DNA為模板獲為模板獲得已知目的基因片段得已知目的基因片段, 或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直或與逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)相結(jié)合，直接以組織和細胞的接以組織和細胞的mRNA為模板獲得目的片段；為模板獲得目的片段；利用簡并引物從利用簡并引物從cDNA文庫或基因組文庫中獲得文庫或基因組文庫中獲得序列相似的基因片段；序列相似的基因片段；利用隨機引物從利用隨機引物從cDNA文庫或基因組

7、文庫中克隆文庫或基因組文庫中克隆基因。基因。 二、二、PCR技術(shù)技術(shù)的主要用途的主要用途（一）目的基因的克?。ㄒ唬┠康幕虻目寺∧夸浤夸浝美肞CR技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體技術(shù)可以隨意設(shè)計引物在體外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突外對目的基因片段進行嵌和、缺失、點突變等改造。變等改造。 PCR技術(shù)高度敏感，對模板技術(shù)高度敏感，對模板DNA的的量要求很低，是量要求很低，是DNA和和RNA微量分析的微量分析的最好方法。最好方法。 （三）（三）DNA和和RNA的微量分析的微量分析（二）基因突變（二）基因突變目錄目錄將將PCR技術(shù)引入技術(shù)引入DNA序列測定，使測序序列測定，使測序工作大為簡化，也提

8、高了測序的速度；工作大為簡化，也提高了測序的速度；待測待測DNA片段既可克隆到特定的載體后片段既可克隆到特定的載體后進行序列測定，也可直接測定。進行序列測定，也可直接測定。PCR與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基與其他技術(shù)的結(jié)合可以大大提高基因突變檢測的敏感性因突變檢測的敏感性 。（四）（四）DNA序列測定序列測定（五）基因突變分析（五）基因突變分析目錄目錄 逆轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription PCR，RT-PCR)是將是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和PCR反應(yīng)聯(lián)合反應(yīng)聯(lián)合應(yīng)用的一種技術(shù)。應(yīng)用的一種技術(shù)。 RT-PCR是目前從組織或細胞中獲得目的基因是目前從組織或

9、細胞中獲得目的基因以及對已知序列的以及對已知序列的RNA進行定性及半定量分進行定性及半定量分析的最有效方法。析的最有效方法。 （一）逆轉(zhuǎn)錄（一）逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)技術(shù)三、幾種重要的三、幾種重要的PCR衍生技術(shù)衍生技術(shù)目錄目錄 原位原位PCR(in situ PCR)是在組織切片或細胞涂片是在組織切片或細胞涂片上的單個細胞內(nèi)進行的上的單個細胞內(nèi)進行的PCR反應(yīng)，然后用特異反應(yīng)，然后用特異性探針進行原位雜交，即可檢出待測性探針進行原位雜交，即可檢出待測DNA或或RNA是否在該組織或細胞中存在。是否在該組織或細胞中存在。 原位原位PCR方法彌補了方法彌補了PCR技術(shù)和原位雜交技術(shù)技術(shù)和原位雜交技術(shù)的不

10、足，是將目的基因的擴增與定位相結(jié)合的的不足，是將目的基因的擴增與定位相結(jié)合的一種最佳方法。一種最佳方法。（二）原位（二）原位PCR技術(shù)技術(shù)目錄目錄（三）實時（三）實時PCR技術(shù)技術(shù)實時實時PCR(real-time PCR)技術(shù)通過動態(tài)技術(shù)通過動態(tài)監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積監(jiān)測反應(yīng)過程中的產(chǎn)物量，消除了產(chǎn)物堆積對定量分析的干擾，亦被稱為定量對定量分析的干擾，亦被稱為定量PCR。 目錄目錄n實時實時PCR技術(shù)原理技術(shù)原理QR3355上游上游引物引物下游下游引物引物熒光標記引物熒光標記引物RQ 3355目錄目錄n實時實時PCRPCR分類：分類：實時實時PRC非探針類非探針類探針類探針類

11、1. TaqMan1. TaqMan探針法探針法 2. 2. 分子信標探針法分子信標探針法 3. FRET3. FRET探針法探針法 目錄目錄圖圖20-3 TaqMan探針法實時探針法實時PCR原理示意圖原理示意圖目錄目錄基因文庫基因文庫Gene Library目錄目錄 基因組基因組DNA文庫文庫 (genomic DNA library) cDNA文庫文庫(cDNA library) n基因文庫基因文庫( (gene library)是指一個包含了某一生物體全部是指一個包含了某一生物體全部DNADNA序列序列的克隆群體。的克隆群體。目錄目錄一、基因組一、基因組DNA文庫文庫基因組基因組DNA

12、DNA文庫是指生物的文庫是指生物的基因組基因組DNA的的信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以信息（包括所有的編碼區(qū)和非編碼區(qū)）以DNA片段形式貯存的克隆群體。片段形式貯存的克隆群體。 用于構(gòu)建基因組文庫的載體有用于構(gòu)建基因組文庫的載體有 噬菌體、噬菌體、粘粒和酵母人工染色體等。粘粒和酵母人工染色體等。目錄目錄n基因組文庫和基因組文庫和cDNA文庫的構(gòu)建和篩選文庫的構(gòu)建和篩選目錄目錄第一輪篩選第一輪篩選第二輪篩選第二輪篩選第三輪篩選第三輪篩選n基因組文庫篩選結(jié)果舉例基因組文庫篩選結(jié)果舉例目錄目錄cDNA文庫是包含某一組織細胞在一定條文庫是包含某一組織細胞在一定條件下所表達的全部件下所表達的全部m

13、RNAmRNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄而合成的cDNA序列序列的克隆群體，它以的克隆群體，它以cDNA片段的形片段的形式貯存著該組織細胞的基因表達信息。式貯存著該組織細胞的基因表達信息。 二、二、cDNA文庫文庫目錄目錄生物芯片技術(shù)生物芯片技術(shù)Biological Chip Technique目錄目錄是指將許多特定的是指將許多特定的DNADNA片段有規(guī)律地緊密排片段有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒列固定于單位面積的支持物上，然后與待測的熒光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等光標記樣品進行雜交，雜交后用熒光檢測系統(tǒng)等對芯片進行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的對芯片進

14、行掃描，通過計算機系統(tǒng)對每一位點的熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出熒光信號做出檢測、比較和分析，從而迅速得出定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作定性和定量的結(jié)果。該技術(shù)亦被稱作DNA微陣列微陣列(DNA microarray)。 一、基因芯片一、基因芯片n基因芯片基因芯片(gene chip)目錄目錄n基因芯片工作流程示意圖基因芯片工作流程示意圖目錄目錄是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)應(yīng)時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經(jīng)檢測系統(tǒng)對靶蛋

15、白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。對靶蛋白進行定性和定量分析的一種技術(shù)。二、蛋白質(zhì)芯片二、蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)蛋白質(zhì)分子間的親和反應(yīng)n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片(protein chip)n蛋白質(zhì)芯片蛋白質(zhì)芯片作用原理作用原理目錄目錄生物大分子相互作用研究技術(shù)生物大分子相互作用研究技術(shù) The Method of Protein-protein and Protein-DNA Interaction Study目錄目錄一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù)一、蛋白質(zhì)相互作用研究技術(shù) 酵母雙雜交酵母雙雜交 各種親和分析（標簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等）各種親和分析（標簽蛋白沉淀、免疫共沉淀等） 熒光共振能量

16、轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析熒光共振能量轉(zhuǎn)換效應(yīng)分析 噬菌體顯示系統(tǒng)篩選噬菌體顯示系統(tǒng)篩選n常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)常用蛋白質(zhì)相互作用的研究技術(shù)目錄目錄標簽融合蛋白結(jié)合實驗是一個基于親和色譜標簽融合蛋白結(jié)合實驗是一個基于親和色譜原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。原理的、分析蛋白質(zhì)體外直接相互作用的方法。（一）標簽蛋白沉淀（一）標簽蛋白沉淀標簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋標簽融合蛋白結(jié)合實驗主要用于證明兩種蛋白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)白分子是否存在直接物理結(jié)合、分析兩種分子結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的具體結(jié)構(gòu)部位及篩選細胞內(nèi)與融合蛋白相結(jié)合的未知分子。合的未

17、知分子。 目錄目錄標簽融合標簽融合蛋白沉淀蛋白沉淀實驗流程實驗流程示意圖示意圖目錄目錄（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理（二）酵母雙雜交技術(shù)的基本原理和用途和用途目錄目錄n酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用證明兩種已知基因序列的蛋白質(zhì)可以相互作用的生物信息學(xué)推測。的生物信息學(xué)推測。 分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的分析已知存在相互作用的兩種蛋白質(zhì)分子的的相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。相互作用功能結(jié)構(gòu)域或關(guān)鍵的氨基酸殘基。 將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與將擬研究的蛋白質(zhì)的編碼基因與BD基因融合成基因融合成為為“誘餌誘餌”表達質(zhì)粒，可以篩選

18、表達質(zhì)粒，可以篩選AD基因融合的基因融合的“獵物獵物”基因表達文庫，篩選未知的相互作用基因表達文庫，篩選未知的相互作用蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)。目錄目錄（三）免疫共沉淀技術(shù)的基本原理（三）免疫共沉淀技術(shù)的基本原理和用途和用途 免疫沉淀（免疫沉淀（immunoprecipitation IP） 免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。利免疫沉淀是利用抗體特異性反應(yīng)純化富集目的蛋白的一種方法。利用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體用抗體可與抗原特異性結(jié)合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉淀下來。系沉淀下來。 免疫共沉淀（免疫共沉淀（Co-Immunoprecip

19、itation，CO-IP） 免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋免疫共沉淀是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法?；プ饔玫挠行Х椒?。 CO-IP與質(zhì)譜分析與質(zhì)譜分析 以細胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌以細胞內(nèi)源性靶蛋白為誘餌，用抗靶蛋白抗體與細胞總蛋白進行免用抗靶蛋白抗體與細胞總蛋白進行免疫共沉淀純化靶蛋白免疫復(fù)合物疫共沉淀純化靶蛋白免疫復(fù)合物，凝膠電泳分離后凝膠電泳分離后，質(zhì)譜鑒定靶蛋白質(zhì)譜鑒定靶蛋白的結(jié)合蛋白的結(jié)合蛋白目錄目錄n免疫

20、沉淀原理圖解免疫沉淀原理圖解目錄目錄n免疫共沉淀原理圖解免疫共沉淀原理圖解目錄目錄n免疫共沉淀原理圖解免疫共沉淀原理圖解蛋白蛋白A ， 蛋白蛋白B 抗抗A抗體抗體C進行洗脫進行洗脫抗抗B抗體抗體D進行驗證進行驗證IP C ACO-IP C A+B D目錄目錄nCO-IPCO-IP與質(zhì)譜分析流程與質(zhì)譜分析流程目錄目錄電泳遷移率變動測定電泳遷移率變動測定( (electrophoretic mobility shift assay，EMSA)或稱凝膠遷移變動實驗或稱凝膠遷移變動實驗( (gel shift assay)最初用于研究最初用于研究DNA結(jié)合蛋白與相應(yīng)結(jié)合蛋白與相應(yīng)DNA序列間的相互作用

21、，可用于定性和定量分析，序列間的相互作用，可用于定性和定量分析，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄因子研究的經(jīng)典方法。目前這一技術(shù)也被用于研究術(shù)也被用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定結(jié)合蛋白和特定RNA序列間序列間的相互作用。的相互作用。二、二、DNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)（一）電泳遷移率變動測定（一）電泳遷移率變動測定目錄目錄放放射射自自顯顯影影未結(jié)合探針未結(jié)合探針結(jié)合有蛋白的探針結(jié)合有蛋白的探針標記探針標記探針1X1X1X1X核蛋白提取物核蛋白提取物1X10X10X未標記探針未標記探針10Xn凝膠遷移實驗結(jié)果示意圖凝膠遷移實驗結(jié)果示意圖目錄目錄

22、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)是目前可是目前可以研究體內(nèi)以研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的與蛋白質(zhì)相互作用的主要方法。主要方法。（二）染色質(zhì)免疫沉淀法（二）染色質(zhì)免疫沉淀法目錄目錄n染色質(zhì)免疫沉淀實驗流程及結(jié)果示意圖染色質(zhì)免疫沉淀實驗流程及結(jié)果示意圖目錄目錄二、二、RNA-蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)蛋白質(zhì)相互作用分子分析技術(shù)RNARNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（結(jié)合蛋白免疫沉淀（RNA RNA Binding Protein ImmunoprecipitationBinding Protein Immunoprecipitation，RIPRIP），是研究細胞內(nèi)），是研究細胞內(nèi)RNARNA與蛋白結(jié)合與蛋白結(jié)合情況的技術(shù)。情況的技術(shù)。應(yīng)用范圍：應(yīng)用范圍：研究蛋白與研究蛋白與DNADNA動態(tài)作用動態(tài)作用研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達之間的關(guān)系研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達之間的關(guān)系研究蛋白與研究蛋白與RNARNA的相互作用的相互作用目