實(shí)驗(yàn)一附錄_植物轉(zhuǎn)基因載體的介紹

1、植物轉(zhuǎn)基因載體的介紹植物轉(zhuǎn)基因載體的介紹根癌農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌細(xì)胞呈桿狀，0.81.5-3.0mM，以1-4根周生鞭毛運(yùn)動(dòng)。常有纖毛，不形成芽孢，革蘭氏染色呈陰性。菌落無色素，隨著菌齡的增加，光滑的菌落逐漸變成有條紋，但也有許多菌株生成的菌落呈粗糙型。根癌農(nóng)桿菌廣泛存在于雙子葉植物中。一般認(rèn)為單子葉植物對(duì)農(nóng)桿菌不敏感，但是近年來的研究表明，農(nóng)桿菌對(duì)單子葉植物也有浸染能力。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)Ti質(zhì)粒大約在160240kB之間。其中T-DNA大約在15kb-30kb。Vir基因區(qū)在36kb左右。除此之外，Ti質(zhì)粒上還存在Con區(qū)（region encoding conjugation)和Ori區(qū)（

2、origin of replication)。 T-DNA的組成結(jié)構(gòu)的組成結(jié)構(gòu)T-DNA上共有三套基因和左右兩個(gè)邊界，LB和RB是長(zhǎng)為25bp的末端反復(fù)重復(fù)順序，在切除及整合過程具有重要意義。tms由兩個(gè)基因組成：tms1（iaaM）和tms2（iaaH）生長(zhǎng)素tmr由一個(gè)基因組成iptz：分裂素tmt由若干基因構(gòu)成，合成稀有氨基酸衍生物（opines），即冠癭堿。opines有三個(gè)成員： octopine精氨酸與丙酮酸的縮合物 章魚堿 Napaline精氨酸與酮戊二酸的縮合物 胭脂堿 Agropine谷氨酸與二環(huán)糖的縮合物 農(nóng)桿堿 據(jù)此可將Ti質(zhì)粒分為三大類，感染的植物誘導(dǎo)合成這些有機(jī)堿，但

3、不能利用它們，其分解酶基因在Ti質(zhì)粒上，分解產(chǎn)物為氨基酸和糖類，供根癌農(nóng)桿菌使用作為氮源及碳源。Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)質(zhì)粒的結(jié)構(gòu) T-DNAtransferred-DNA regions:是農(nóng)桿菌浸染植物細(xì)胞時(shí)，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞的一段DNA，故稱之為轉(zhuǎn)移DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關(guān)。 Vir區(qū)virulence region：該區(qū)段的基因能夠激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)和Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，合起來約占Ti質(zhì)粒的三分之一。 Con區(qū)regions encoding conjugations：該區(qū)段上存在著與細(xì)菌間結(jié)合轉(zhuǎn)

4、移的有關(guān)基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭瘤堿能激活tra基因，誘導(dǎo)Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為結(jié)合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。 Ori區(qū)origin of replication：該區(qū)段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復(fù)制，故稱之為復(fù)制起始區(qū)。Ti質(zhì)粒的功能為農(nóng)桿菌提供附著于植物細(xì)胞壁的能力；參與寄主細(xì)胞合成植物激素IAA和一些細(xì)胞分裂素的活動(dòng)；誘發(fā)植物產(chǎn)生冠癭瘤并決定所誘導(dǎo)的腫瘤的形態(tài)學(xué)特征和冠癭瘤充分；賦予寄主菌株具有分解代謝各種冠癭堿化合物的能力；賦予寄主菌株對(duì)土壤桿菌所產(chǎn)生的細(xì)菌素的反應(yīng)性；決定寄主菌株的植物寄主范圍；有的Ti質(zhì)粒能夠抑制某些根瘤土壤桿菌噬菌體的生長(zhǎng)和發(fā)育，即具有對(duì)噬菌體的“排外

5、性”。農(nóng)桿菌感染植物的原理農(nóng)桿菌感染植物的原理農(nóng)桿根瘤菌之所以會(huì)感染植物根部是因?yàn)橹参锔繐p傷部位分泌出酚類物質(zhì)乙酰丁香酮和羥基乙酰丁香酮，這些酚類物質(zhì)可以誘導(dǎo)Vir（Virulence region)基因的啟動(dòng)表達(dá)，Vir基因的產(chǎn)物將Ti質(zhì)粒上的一段T-DNA單鏈切下，而位于根瘤染色體上的操縱子基因產(chǎn)物則與單鏈TDNA結(jié)合，形成復(fù)合物，轉(zhuǎn)化植物根部細(xì)胞。Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的戰(zhàn)略質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的戰(zhàn)略 天然的Ti質(zhì)粒不能作為表達(dá)載體使用的理由：生長(zhǎng)在培養(yǎng)基上的植物轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生大量的生長(zhǎng)素和分裂素阻止了細(xì)胞再生長(zhǎng)為整株植物，因此，必須除去生長(zhǎng)素和分裂素基因。有機(jī)堿的合成與T-DNA的轉(zhuǎn)化無關(guān)，

6、而且可能會(huì)影響植物細(xì)胞生長(zhǎng)，因?yàn)橛袡C(jī)堿合成大量消耗精氨酸和谷氨酸，因此必須去除有機(jī)堿合成基因（tmt）。 Ti質(zhì)粒約為200kb，重組操作非常困難，也很難找到單一的酶切位點(diǎn)。1. Ti質(zhì)粒不能在大腸桿菌中復(fù)制，為了使重組質(zhì)粒DNA的大量擴(kuò)增，須添加入大腸桿菌復(fù)制子。 加入植物細(xì)胞的篩選標(biāo)記，使用植物細(xì)胞啟動(dòng)子及末端polyA信號(hào)，加入多聚人工接頭（多克隆位點(diǎn)）以利于外源基因的克隆。植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的共整合系統(tǒng)植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的共整合系統(tǒng)（一元載體系統(tǒng)）（一元載體系統(tǒng)） T-DNA克隆在大腸桿菌質(zhì)粒上，含有E.coli的選擇標(biāo)記和植物選擇標(biāo)記Kmr。首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到

7、農(nóng)桿菌中，質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質(zhì)粒上，用于侵染植物細(xì)胞。T-DNA重組分子整合到植物細(xì)胞染色體DNA上，Km篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。 植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的雙元系統(tǒng)植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的雙元系統(tǒng) 目前T-DNA轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)方法是雙元系統(tǒng)，即穿梭質(zhì)粒。插入外源基因的重組穿梭質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化含有Ti質(zhì)粒的根瘤農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后直接感染植物細(xì)胞。與共整合系統(tǒng)所不同的是，含外源基因的質(zhì)粒可在農(nóng)桿菌內(nèi)自主復(fù)制并保留下來。農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，植物的創(chuàng)傷信號(hào)啟動(dòng)Ti質(zhì)粒上的Vir基因（在Helper質(zhì)粒） ，隨后將穿梭質(zhì)粒的T-DNA切割下來，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。雙元載體主要包括兩個(gè)Ti質(zhì)粒，

8、即微型Ti質(zhì)粒和輔助Ti質(zhì)粒。 微型Ti質(zhì)粒：含有T-DNA邊界，缺失vir基因的Ti質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化的植物不會(huì)產(chǎn)生腫瘤。除含有T-DNA的左右邊界外，還具有廣譜的質(zhì)粒復(fù)制位點(diǎn)及選擇標(biāo)記基因。輔助Ti質(zhì)粒：含有Vir區(qū)的Ti質(zhì)粒。實(shí)際上輔助Ti質(zhì)粒是T-DNA缺失的突變型Ti質(zhì)粒，完全喪失了致瘤功能，因此是相當(dāng)于在共整合載體系統(tǒng)中的卸甲Ti質(zhì)粒。主要作用是提供vir基因功能，激活T-DNA轉(zhuǎn)移。最常用的輔助質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌所含有的Ti質(zhì)粒。雙元載體系統(tǒng)雙元載體系統(tǒng)一元載體和雙元載體系統(tǒng)的比較雙元載體系統(tǒng)不需要共整合過程；微型質(zhì)粒具有大腸桿菌的復(fù)制位點(diǎn)，可以在大腸桿菌中自主復(fù)制，拷貝數(shù)增加倍，而且分子

9、質(zhì)量小，可以直接在體外進(jìn)行遺傳操作；雙元載體系統(tǒng)的構(gòu)建簡(jiǎn)單；微型質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌更容易，構(gòu)建頻率高；雙元載體中不需要共整合過程，所以基因變異的可能性降低；雙元載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌后，微型質(zhì)粒的穩(wěn)定性要差些，容易丟失。常用載體的構(gòu)造花椰菜花葉病毒Cauliflower mosaic virus 35S啟動(dòng)子(CaMV 35S)胭脂堿合成酶Nopaline syntheses terminator 3轉(zhuǎn)錄終止子(NOS) 標(biāo)記基因新霉素-3-磷酸轉(zhuǎn)移酶Neomycin phosphotransferase-(NPT)，抗卡那霉素 水稻轉(zhuǎn)基因載體水稻轉(zhuǎn)基因載體RNAi載體 pZY載體載體植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用

10、植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用1.轉(zhuǎn)報(bào)告基因研究植物基因的表達(dá)與調(diào)控 2.研究基因的功能3.利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)4.改良植物品種 1.報(bào)告基因研究植物基因的表達(dá)與調(diào)控報(bào)告基因研究植物基因的表達(dá)與調(diào)控植物對(duì)環(huán)境中的光、重力等因素尤為敏感。這些因素均可誘導(dǎo)基因的表達(dá)。利用報(bào)告基因環(huán)境因素的變化對(duì)基因表達(dá)的影響，是植物分子生物學(xué)的重要內(nèi)容。在植物中常用的報(bào)告基因有： 1.大腸桿菌的葡萄糖苷酸酶（GUS）：當(dāng)于在微生物及動(dòng)物系統(tǒng)中使用的半乳糖苷酶，只是其作用底物為葡萄糖苷酸。該酶在脊椎動(dòng)物和微生物中表達(dá)，植物細(xì)胞中幾乎不表達(dá)。當(dāng)gus基因轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時(shí)，若與X葡萄糖苷酸酶（X-gluc，與X-ga

11、l相似），保溫后，就會(huì)產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，借此可以預(yù)測(cè)報(bào)告基因的表達(dá)程度，但是該酶不能分泌在細(xì)胞外，因此在測(cè)定酶活時(shí)，須將細(xì)胞殺死，破碎。 2.昆蟲的熒光素酶基因：熒光酶基因(luc)是1985年從北美熒火蟲和叩頭蟲cDNA文庫中克隆出來的，該酶在有ATP、Mg2、O2和熒光素存在下發(fā)出熒光，這樣就可用轉(zhuǎn)基因植物整株或部分直接用X-光片或?qū)ｉT儀器進(jìn)行檢測(cè)。 2.研究基因的功能研究基因的功能（1）基因的過量表達(dá)（2）RNAi載體：基因的抑制表達(dá)3.利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)外源蛋白質(zhì)（1）異源蛋白藥物：利用哺乳類動(dòng)物細(xì)胞產(chǎn)生蛋白藥物是極其昂貴的，而植物生長(zhǎng)成本較低，農(nóng)田里可換得大量

12、蛋白質(zhì)藥物。目前這方面的項(xiàng)目仍在實(shí)驗(yàn)室里進(jìn)行：如人的腦腓肽、人血清蛋白、及小鼠的單克隆抗體等。舉例說明：小鼠的抗體輕鏈和重鏈基因分別在兩種煙草植物中表達(dá)。然后兩種植物品系雜交，產(chǎn)生的子代植物表達(dá)小鼠的重鏈輕鏈兩種蛋白。從煙草的葉子里可檢測(cè)到完整的抗體分子，含量為葉細(xì)胞蛋白總量的1.5%。實(shí)驗(yàn)還表明，植物的蛋白分泌系統(tǒng)能夠識(shí)別小鼠抗體前體的信號(hào)肽順序。 （2）食用或工業(yè)用油：首批大規(guī)模生產(chǎn)并取得商業(yè)效益的非食用性轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品是工業(yè)用油，其中包括制造肥皂和去垢劑的月桂酸（12個(gè)碳原子）?？茖W(xué)家們僅表達(dá)一個(gè)特殊的基因就使油菜生產(chǎn)月桂酸而不是通常的18個(gè)碳原子的不飽和脂肪酸。這個(gè)實(shí)驗(yàn)田試驗(yàn)結(jié)果極其成功，經(jīng)濟(jì)效益顯著。此外，利用油菜易于生長(zhǎng)及產(chǎn)量高的特點(diǎn)，人們還致力于用它生產(chǎn)其它工業(yè)用油。如，作用潤(rùn)滑油及尼龍生產(chǎn)的原料芥酸；用于麥淇淋生