蛋白質(zhì)和多肽的氨基酸序列分析

1、 氨基酸是一種小分子的兩性化合物，分子量在75200Da之間，其化學(xué)通式為： 在生物體內(nèi)出現(xiàn)的氨基酸都是L型，僅在少數(shù)微生物來(lái)源的多肽中出現(xiàn)D型氨基酸。 蛋白質(zhì)和多肽是由蛋白質(zhì)和多肽是由2020種氨基酸按照一定的順序通過(guò)肽種氨基酸按照一定的順序通過(guò)肽鍵連接成一長(zhǎng)鏈，然后通過(guò)鏈內(nèi)、鏈間的離子鍵、疏鍵連接成一長(zhǎng)鏈，然后通過(guò)鏈內(nèi)、鏈間的離子鍵、疏水作用等多種作用力進(jìn)行折疊卷曲形成一定的構(gòu)象并水作用等多種作用力進(jìn)行折疊卷曲形成一定的構(gòu)象并發(fā)揮其獨(dú)特作用。氨基酸的排列順序即發(fā)揮其獨(dú)特作用。氨基酸的排列順序即蛋白質(zhì)的一級(jí)蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能結(jié)構(gòu)決定了蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)及功能。 因此，

2、分析蛋白質(zhì)的氨基酸序列是進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究中不可缺少的部分。采用部分水解的方法試圖測(cè)定采用部分水解的方法試圖測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸序列蛋白質(zhì)的氨基酸序列Consden等利用色譜技術(shù)成功測(cè)等利用色譜技術(shù)成功測(cè)定了短桿菌肽定了短桿菌肽S6的氨基酸序列的氨基酸序列Sanger首次測(cè)定了牛胰島素的一級(jí)首次測(cè)定了牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)（由結(jié)構(gòu)（由51個(gè)氨基酸殘基組成）個(gè)氨基酸殘基組成）Spackman、Stein、Moore制造了自制造了自動(dòng)化的氨基酸分析儀，使氨基酸定動(dòng)化的氨基酸分析儀，使氨基酸定量分析進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段量分析進(jìn)入了一個(gè)嶄新的階段Edman 推出第一臺(tái)自動(dòng)測(cè)序儀推出第一臺(tái)自動(dòng)測(cè)序儀牛胰島

3、素的一級(jí)結(jié)構(gòu)牛胰島素的一級(jí)結(jié)構(gòu)一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的基本流程一級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定的基本流程1. 拆分拆分蛋白質(zhì)分子的多肽鏈蛋白質(zhì)分子的多肽鏈; 2. 鑒定多肽鏈的鑒定多肽鏈的N-末端和末端和C-末端殘基末端殘基;3. 用兩種或幾種不同的斷裂方法將用兩種或幾種不同的斷裂方法將多肽鏈裂解多肽鏈裂解成較成較小的片段小的片段;4. 對(duì)各肽段的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)各肽段的氨基酸序列進(jìn)行測(cè)序測(cè)序; 5. 重建重建完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)完整多肽鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu);6. 確定半胱氨酸殘基間形成的確定半胱氨酸殘基間形成的二硫鍵的位置二硫鍵的位置；7. 酰胺基酰胺基位置的確定。位置的確定。測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)前的準(zhǔn)備工作測(cè)定蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)

4、前的準(zhǔn)備工作1. 1. 樣品樣品純度純度必須必須97%97%以上；以上； 聚丙烯酰胺凝膠電泳要求一條帶聚丙烯酰胺凝膠電泳要求一條帶2. 2. 測(cè)定蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量相對(duì)分子質(zhì)量； SDS-PAGE SDS-PAGE，凝膠過(guò)濾法，沉降系數(shù)法，凝膠過(guò)濾法，沉降系數(shù)法3. 3. 測(cè)定蛋白質(zhì)測(cè)定蛋白質(zhì)多肽鏈種類和數(shù)目多肽鏈種類和數(shù)目； 種類：種類： SDS-PAGESDS-PAGE 數(shù)目：數(shù)目：N N末端氨基酸殘基摩爾數(shù)末端氨基酸殘基摩爾數(shù)/ /蛋白質(zhì)摩爾數(shù)蛋白質(zhì)摩爾數(shù)4. 4. 測(cè)定蛋白質(zhì)的測(cè)定蛋白質(zhì)的氨基酸組成氨基酸組成；并根據(jù)分子量計(jì)算；并根據(jù)分子量計(jì)算每種氨基酸的個(gè)數(shù)；每種氨基酸

5、的個(gè)數(shù)；第一節(jié)第一節(jié) 氨基酸組成分析氨基酸組成分析第二節(jié)第二節(jié) 蛋白質(zhì)的末端測(cè)定蛋白質(zhì)的末端測(cè)定第三節(jié)第三節(jié) 亞基拆離、肽鏈降解和肽段的分離亞基拆離、肽鏈降解和肽段的分離第四節(jié)第四節(jié) 肽段的肽段的氨基酸順序測(cè)定氨基酸順序測(cè)定第五節(jié)第五節(jié) 蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的重建蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的重建二、特殊氨基酸的保護(hù)二、特殊氨基酸的保護(hù)三、衍生方法及原理三、衍生方法及原理四、氨基酸定性和定量分析四、氨基酸定性和定量分析一、蛋白質(zhì)或多肽的水解方法一、蛋白質(zhì)或多肽的水解方法五、測(cè)定氨基酸組成的實(shí)驗(yàn)步驟五、測(cè)定氨基酸組成的實(shí)驗(yàn)步驟 現(xiàn)代分離提純技術(shù)的發(fā)展使蛋白質(zhì)操現(xiàn)代分離提純技術(shù)的發(fā)展使蛋白質(zhì)操作微量化，但也給作微量化

6、，但也給定量定量帶來(lái)了困難，一般帶來(lái)了困難，一般很難通過(guò)常規(guī)的稱量或測(cè)蛋白溶液在很難通過(guò)常規(guī)的稱量或測(cè)蛋白溶液在280nm的光吸收值來(lái)準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)，所的光吸收值來(lái)準(zhǔn)確定量蛋白質(zhì)，所以如果在蛋白質(zhì)酶解或測(cè)序前，取蛋白質(zhì)以如果在蛋白質(zhì)酶解或測(cè)序前，取蛋白質(zhì)樣品的一部分進(jìn)行氨基酸組成分析，根據(jù)樣品的一部分進(jìn)行氨基酸組成分析，根據(jù)結(jié)果便可以推算出蛋白量的可靠值。結(jié)果便可以推算出蛋白量的可靠值。 另外，在蛋白質(zhì)測(cè)序中有時(shí)遇到測(cè)不出結(jié)另外，在蛋白質(zhì)測(cè)序中有時(shí)遇到測(cè)不出結(jié)果的情況，一種可能是蛋白質(zhì)的果的情況，一種可能是蛋白質(zhì)的N端封閉端封閉，另，另一種可能則是樣品本身不是蛋白質(zhì)或絕大部分一種可能則是樣品本

7、身不是蛋白質(zhì)或絕大部分是非蛋白質(zhì)物質(zhì)是非蛋白質(zhì)物質(zhì)，解決這個(gè)問(wèn)題的很好途徑便，解決這個(gè)問(wèn)題的很好途徑便是做一個(gè)氨基酸組成分析以確定樣品的成分。是做一個(gè)氨基酸組成分析以確定樣品的成分。 除了蛋白質(zhì)研究和重組蛋白需要測(cè)定氨基除了蛋白質(zhì)研究和重組蛋白需要測(cè)定氨基酸組成外，醫(yī)學(xué)上也需要測(cè)定血液或各種體液酸組成外，醫(yī)學(xué)上也需要測(cè)定血液或各種體液中的游離氨基酸。中的游離氨基酸。1水解水解在一定溫度、酸在一定溫度、酸度等條件下，蛋度等條件下，蛋白質(zhì)或多肽的肽白質(zhì)或多肽的肽鍵斷裂，水解成鍵斷裂，水解成游離氨基酸。游離氨基酸。3色譜色譜利用高效液相色利用高效液相色譜對(duì)這些氨基酸譜對(duì)這些氨基酸進(jìn)行定性和定量進(jìn)行定

8、性和定量色譜分析。色譜分析。2衍生衍生在游離氨基酸殘?jiān)谟坞x氨基酸殘基上衍生一個(gè)生基上衍生一個(gè)生色基團(tuán)色基團(tuán) 目前蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸組成分析主要包括目前蛋白質(zhì)或多肽的氨基酸組成分析主要包括3個(gè)步驟，即：個(gè)步驟，即： 最終獲得蛋白質(zhì)或多肽中各氨基酸所占摩爾百分?jǐn)?shù)或最終獲得蛋白質(zhì)或多肽中各氨基酸所占摩爾百分?jǐn)?shù)或摩爾比。摩爾比。分析的步驟分析的步驟 雖然多肽的氨基酸組成分析已向更靈雖然多肽的氨基酸組成分析已向更靈敏、更精確、更快速以及自動(dòng)化方向發(fā)展敏、更精確、更快速以及自動(dòng)化方向發(fā)展和改進(jìn)，但還和改進(jìn)，但還沒(méi)有一種單獨(dú)適用于所有殘沒(méi)有一種單獨(dú)適用于所有殘基基的，并且能在水解液中定量回收的水解的，并且

9、能在水解液中定量回收的水解方法出現(xiàn)，很多因素如溫度、時(shí)間、水解方法出現(xiàn)，很多因素如溫度、時(shí)間、水解試劑、添加劑、水解方法等對(duì)水解的完全試劑、添加劑、水解方法等對(duì)水解的完全程度均有影響。程度均有影響。 下面主要對(duì)一些常用的水解方法作簡(jiǎn)要介下面主要對(duì)一些常用的水解方法作簡(jiǎn)要介紹。紹。 1 1、酸性水解、酸性水解 酸性水解是采用較多的一種水解方法，其中酸性水解是采用較多的一種水解方法，其中HCl是最是最通用的水解劑。通用的水解劑。 條件條件：6 mol/L HCI、真空、真空、110，水解時(shí)間為，水解時(shí)間為2024h。即可用于液相水解模式也可用于氣相水解模式。即可用于液相水解模式也可用于氣相水解模式

10、。 損失損失：在該條件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰：在該條件下，得到的氨基酸不消旋，但天冬酰胺和谷氨酰胺分別被完全水解為天冬氨酸和谷氨酸，胺和谷氨酰胺分別被完全水解為天冬氨酸和谷氨酸，色氨酸則被完全破壞色氨酸則被完全破壞，半胱氨酸不能從樣品中直接測(cè)，半胱氨酸不能從樣品中直接測(cè)定，酪氨酸部分被水解液中痕量雜質(zhì)所破壞，絲氨酸定，酪氨酸部分被水解液中痕量雜質(zhì)所破壞，絲氨酸和蘇氨酸被部分水解，損失分別為和蘇氨酸被部分水解，損失分別為10%和和5%。 相關(guān)措施相關(guān)措施： 對(duì)某些對(duì)某些氨基酸的破壞率氨基酸的破壞率，需要用不同水解時(shí)間測(cè)，需要用不同水解時(shí)間測(cè)定這些氨基酸的含量，然后外推到水解時(shí)間為定這些

11、氨基酸的含量，然后外推到水解時(shí)間為0時(shí)，時(shí)，算得的氨基酸含量，即代表了真正數(shù)值。算得的氨基酸含量，即代表了真正數(shù)值。 有些有些脂肪族氨基酸殘基間的肽鍵脂肪族氨基酸殘基間的肽鍵，如，如Ile-Ile、Val-Val、Ile-Val等之間的肽鍵難于裂解，可以通過(guò)延等之間的肽鍵難于裂解，可以通過(guò)延長(zhǎng)水解時(shí)間如水解長(zhǎng)水解時(shí)間如水解92h甚至甚至120h來(lái)解決。但是長(zhǎng)時(shí)來(lái)解決。但是長(zhǎng)時(shí)間的水解，會(huì)使較敏感的氨基酸殘基的損失更大。間的水解，會(huì)使較敏感的氨基酸殘基的損失更大。 半胱氨酸和甲硫氨酸半胱氨酸和甲硫氨酸往往先將蛋白質(zhì)用過(guò)甲酸氧往往先將蛋白質(zhì)用過(guò)甲酸氧化后再水解，相應(yīng)得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。化后再

12、水解，相應(yīng)得到磺基丙氨酸和甲硫氨酸。 2、堿性水解、堿性水解 堿性水解一般選用堿性水解一般選用NaOH和和KOH作為水解劑。作為水解劑。例如將水解樣品加入例如將水解樣品加入5mol/L NaOH中，充氮中，充氮?dú)夂筇畛涔?，氣后填充管?10 水解水解22h。 該水解方法是該水解方法是HCl水解的互補(bǔ)法。因?yàn)閴A水水解的互補(bǔ)法。因?yàn)閴A水解時(shí)，多數(shù)氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、精氨解時(shí)，多數(shù)氨基酸如絲氨酸、蘇氨酸、精氨酸以及半胱氨酸遭到破壞，其它的氨基酸外酸以及半胱氨酸遭到破壞，其它的氨基酸外消旋化，消旋化，僅色氨酸是穩(wěn)定的僅色氨酸是穩(wěn)定的。所以此法僅限。所以此法僅限于測(cè)定色氨酸的含量。于測(cè)定色氨酸的含量

13、。 3 3、酶水解、酶水解 用用一組蛋白酶一組蛋白酶水解肽鏈，特別適用于對(duì)化學(xué)水解敏水解肽鏈，特別適用于對(duì)化學(xué)水解敏感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的測(cè)定。感的氨基酸如天冬酰胺和谷氨酰胺的測(cè)定。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)是水解過(guò)程中氨基酸不發(fā)生消旋化，幾乎可是水解過(guò)程中氨基酸不發(fā)生消旋化，幾乎可以保持所有的組成氨基酸不被破壞。因?yàn)槊杆鈼l以保持所有的組成氨基酸不被破壞。因?yàn)槊杆鈼l件溫和，對(duì)天冬酰胺、谷氨酰胺等皆無(wú)破壞作用。件溫和，對(duì)天冬酰胺、谷氨酰胺等皆無(wú)破壞作用。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)是反應(yīng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間，水解的產(chǎn)物為較小是反應(yīng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間，水解的產(chǎn)物為較小的肽段，水解不完全。另外，因?yàn)槊副旧硪彩堑鞍椎碾亩?，水解不?/p>

14、全。另外，因?yàn)槊副旧硪彩堑鞍踪|(zhì)，對(duì)樣品的測(cè)定結(jié)果可能會(huì)有干擾。質(zhì)，對(duì)樣品的測(cè)定結(jié)果可能會(huì)有干擾。 常見(jiàn)蛋白水解酶及其作用位點(diǎn)常見(jiàn)蛋白水解酶及其作用位點(diǎn) 4、微波輻射能水解、微波輻射能水解 微波是一種高頻電磁波，其能量傳遞是微波是一種高頻電磁波，其能量傳遞是通過(guò)分子的極化，而水分子的極化作用是非通過(guò)分子的極化，而水分子的極化作用是非常高的，微波能量的快速吸收能導(dǎo)致完全常高的，微波能量的快速吸收能導(dǎo)致完全水水解的時(shí)間大大縮短解的時(shí)間大大縮短。在微波輔助酸水解和微。在微波輔助酸水解和微波輔助酶水解中，水解時(shí)間可從過(guò)去的幾十波輔助酶水解中，水解時(shí)間可從過(guò)去的幾十小時(shí)縮短到幾十分鐘。小時(shí)縮短到幾十分鐘。

15、 因此，微波輔助蛋白質(zhì)水解技術(shù)的出現(xiàn)因此，微波輔助蛋白質(zhì)水解技術(shù)的出現(xiàn)大大提高了氨基酸組成分析的效率。大大提高了氨基酸組成分析的效率。 5、膜上蛋白質(zhì)印跡樣品的水解（原位分析）、膜上蛋白質(zhì)印跡樣品的水解（原位分析） 如果蛋白質(zhì)樣品采用電泳法如果蛋白質(zhì)樣品采用電泳法(如如SDS-PAGE)分離，分離，很難從凝膠中洗脫下來(lái)，可采用電印跡法把樣品轉(zhuǎn)移很難從凝膠中洗脫下來(lái)，可采用電印跡法把樣品轉(zhuǎn)移到到PVDF (聚偏氟乙烯聚偏氟乙烯)膜上，然后在膜上，然后在PVDF膜上直接進(jìn)膜上直接進(jìn)行鹽酸水解和氨基酸分析，稱之為行鹽酸水解和氨基酸分析，稱之為原位原位(in situ)分析。分析。 可將水解指管放入水

16、解反應(yīng)器中，在反應(yīng)器底部可將水解指管放入水解反應(yīng)器中，在反應(yīng)器底部加入加入200ul含含7巰基乙酸的巰基乙酸的6mol/L鹽酸，鹽酸，110 真空水真空水解解24 h，水解結(jié)束后用，水解結(jié)束后用200 ul 含含30甲醇的甲醇的0.1 mol/L鹽酸反復(fù)三次將氨基酸從鹽酸反復(fù)三次將氨基酸從PVDF膜中抽提出來(lái)，以便膜中抽提出來(lái)，以便進(jìn)行下一步的分析。進(jìn)行下一步的分析。 總之，蛋白質(zhì)水解階段所采用的方法總之，蛋白質(zhì)水解階段所采用的方法不同，會(huì)對(duì)氨基酸組成分析產(chǎn)生重要影響。不同，會(huì)對(duì)氨基酸組成分析產(chǎn)生重要影響。對(duì)于不同的蛋白質(zhì)、不同的研究目的、以及對(duì)于不同的蛋白質(zhì)、不同的研究目的、以及樣品量的多少

17、，應(yīng)采取不同的水解方法。樣品量的多少，應(yīng)采取不同的水解方法。二、特殊氨基酸的保護(hù)二、特殊氨基酸的保護(hù) 不同水解條件下，各種氨基酸的回收不同水解條件下，各種氨基酸的回收有所不同。一些敏感氨基酸如有所不同。一些敏感氨基酸如色氨酸和半色氨酸和半胱氨酸胱氨酸可能遭水解破壞，導(dǎo)致無(wú)法正確測(cè)可能遭水解破壞，導(dǎo)致無(wú)法正確測(cè)定其含量。定其含量。 因此水解過(guò)程中，需要考慮對(duì)特殊氨因此水解過(guò)程中，需要考慮對(duì)特殊氨基酸的保護(hù)?；岬谋Ｗo(hù)。 色氨酸的保護(hù)色氨酸的保護(hù) 水解酸中加添加劑水解酸中加添加劑：例如加入巰基乙酸和-巰基乙醇，可使色氨酸的回收可達(dá)80。 有機(jī)酸有機(jī)酸：3molL疏基乙磺酸或4mol/L甲磺酸在水解

18、時(shí)對(duì)色氨酸有一定的保護(hù)作用。 酶酶：利用蛋白酶作為水解劑，條件溫和，對(duì)天冬酰胺和谷氨酰胺及色氨酸均無(wú)破壞作用。 堿堿：用氫氧化鈉和氫氧化鋇代替酸水解，可保護(hù)色氨酸不被破壞。 光譜法：光譜法： 分光光度法分光光度法：應(yīng)用較早，在蛋白質(zhì)分子中，如不：應(yīng)用較早，在蛋白質(zhì)分子中，如不含胱氨酸和其他有干擾的發(fā)色基團(tuán)的氨基酸，根含胱氨酸和其他有干擾的發(fā)色基團(tuán)的氨基酸，根據(jù)其在據(jù)其在6mol/L鹽酸胍的中性溶液中的紫外吸收，鹽酸胍的中性溶液中的紫外吸收，測(cè)定色氨酸和酪氨酸的含量，此經(jīng)驗(yàn)公式只適用測(cè)定色氨酸和酪氨酸的含量，此經(jīng)驗(yàn)公式只適用于色氨酸對(duì)酪氨酸的比值為于色氨酸對(duì)酪氨酸的比值為0.21時(shí)的情況。時(shí)的情

19、況。 二階微分光譜法二階微分光譜法：常被用來(lái)確定蛋白質(zhì)中芳香族：常被用來(lái)確定蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的含量，計(jì)算公式復(fù)雜，氨基酸的含量，計(jì)算公式復(fù)雜，Hewlett Packard公司推出的公司推出的DAD檢測(cè)器配合其化學(xué)工作站軟件，檢測(cè)器配合其化學(xué)工作站軟件，能較方便地在線檢測(cè)并定量肽段中的色氨酸。能較方便地在線檢測(cè)并定量肽段中的色氨酸。 半胱氨酸的保護(hù)半胱氨酸的保護(hù)： 還原烷化法：還原烷化法：產(chǎn)生能抗水解的半胱氨酸衍生物。產(chǎn)生能抗水解的半胱氨酸衍生物。烷化試劑包括烷化試劑包括4-乙烯吡啶和碘代乙酸。乙烯吡啶和碘代乙酸。 缺點(diǎn)：為了確保試劑接近巰基，還原和氧化通常在變?nèi)秉c(diǎn)：為了確保試劑接近巰基，

20、還原和氧化通常在變性劑存在下進(jìn)行，多余試劑和變性劑要用性劑存在下進(jìn)行，多余試劑和變性劑要用HPLC、沉、沉淀法或透析去除，每一步都可能造成樣品的損失。淀法或透析去除，每一步都可能造成樣品的損失。 氧化反應(yīng)氧化反應(yīng)：過(guò)甲酸氧化反應(yīng)被用來(lái)轉(zhuǎn)化半胱氨酸和：過(guò)甲酸氧化反應(yīng)被用來(lái)轉(zhuǎn)化半胱氨酸和胱氨酸成為半胱磺酸再進(jìn)行測(cè)定。胱氨酸成為半胱磺酸再進(jìn)行測(cè)定。 缺點(diǎn)：會(huì)影響其他氨基酸特別是甲硫氨酸會(huì)轉(zhuǎn)變成甲缺點(diǎn)：會(huì)影響其他氨基酸特別是甲硫氨酸會(huì)轉(zhuǎn)變成甲硫氨酸砜，酪氨酸會(huì)降解。必須準(zhǔn)備能分析兩次的樣硫氨酸砜，酪氨酸會(huì)降解。必須準(zhǔn)備能分析兩次的樣品量一次提供半胱氨酸數(shù)據(jù)，另一次則提供其他氨品量一次提供半胱氨酸數(shù)據(jù)，

21、另一次則提供其他氨基酸的組成數(shù)據(jù)?；岬慕M成數(shù)據(jù)。三、衍生方法及原理三、衍生方法及原理 衍生是將氨基酸衍生為有利于測(cè)定或分離的衍生是將氨基酸衍生為有利于測(cè)定或分離的化合物?；衔?。 大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)，無(wú)法大多數(shù)氨基酸不含有芳香環(huán)等生色團(tuán)，無(wú)法直接用紫外法檢測(cè)，需要先將氨基酸直接用紫外法檢測(cè)，需要先將氨基酸衍生為衍生為具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物。具有較強(qiáng)紫外或熒光吸收的衍生物。 從衍生角度看，氨基酸分析可以分為柱后反從衍生角度看，氨基酸分析可以分為柱后反應(yīng)法和柱前衍生法兩大類。應(yīng)法和柱前衍生法兩大類。 柱后反應(yīng)法柱后反應(yīng)法 將游離氨基酸經(jīng)過(guò)色譜柱分離后，各種氨基酸再與將游離氨

22、基酸經(jīng)過(guò)色譜柱分離后，各種氨基酸再與顯色劑顯色劑( (茚三酮、熒光胺、鄰苯二甲醛茚三酮、熒光胺、鄰苯二甲醛) )作用。作用。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：比較穩(wěn)定，對(duì)樣品預(yù)處理要求低，容易定：比較穩(wěn)定，對(duì)樣品預(yù)處理要求低，容易定量和自動(dòng)化操作。量和自動(dòng)化操作。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：檢測(cè)靈敏度不高，分析時(shí)間長(zhǎng)：檢測(cè)靈敏度不高，分析時(shí)間長(zhǎng)( (蛋白質(zhì)水解蛋白質(zhì)水解液需液需1 h1 h而某些生理樣品則需而某些生理樣品則需4 h4 h以上以上) )。 柱前衍生法柱前衍生法 將氨基酸和化學(xué)偶聯(lián)試劑先反應(yīng)生成氨基酸的衍將氨基酸和化學(xué)偶聯(lián)試劑先反應(yīng)生成氨基酸的衍生物，然后再用色譜柱將各種衍生物分離，直接生物，然后再用色譜柱將各種衍生物

23、分離，直接檢測(cè)衍生物的光吸收或熒光發(fā)射。檢測(cè)衍生物的光吸收或熒光發(fā)射。 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：此法可檢測(cè)：此法可檢測(cè)OPA-（鄰苯二甲醛），（鄰苯二甲醛），PTC-，PTH-，DABS-，Dansyl-和和DABTH-氨基酸，分析氨基酸，分析靈敏度高，可利用靈敏度高，可利用HPLC進(jìn)行氨基酸分析。進(jìn)行氨基酸分析。 缺點(diǎn)缺點(diǎn)：有的衍生物不穩(wěn)定，衍生試劑可能干擾氨：有的衍生物不穩(wěn)定，衍生試劑可能干擾氨基酸檢測(cè)?；釞z測(cè)。 柱后反應(yīng)法柱后反應(yīng)法 VS 柱前衍生法柱前衍生法 幾種常見(jiàn)的氨基酸分析方法幾種常見(jiàn)的氨基酸分析方法： 1、茚三酮反應(yīng)、茚三酮反應(yīng) 2、熒光胺法、熒光胺法 3、鄰苯二甲醛、鄰苯二甲醛(OPA)

24、法法 4、PTC-AA分析法分析法 5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法）法 6、磺酰氯二甲胺偶氮苯磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法）法 1 1、茚三酮反應(yīng)、茚三酮反應(yīng) -氨基酸與水合茚三酮一起在水溶液中加熱，除脯氨氨基酸與水合茚三酮一起在水溶液中加熱，除脯氨酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色物質(zhì)，其它氨基酸都產(chǎn)生酸和羥脯氨酸產(chǎn)生黃色物質(zhì)，其它氨基酸都產(chǎn)生藍(lán)紫藍(lán)紫色物質(zhì)。色物質(zhì)。 此反應(yīng)十分靈敏，根據(jù)反應(yīng)所生成的藍(lán)紫色的深淺，此反應(yīng)十分靈敏，根據(jù)反應(yīng)所生成的藍(lán)紫色的深淺，在在570nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色就可測(cè)定樣品中氨基酸的含波長(zhǎng)下進(jìn)行比色就可測(cè)定樣品中氨基酸的含量量。 2、柱后熒光胺法、柱后熒光

25、胺法 熒光胺能在室溫下迅速和一級(jí)胺發(fā)生反應(yīng)，其熒光胺能在室溫下迅速和一級(jí)胺發(fā)生反應(yīng)，其熒光產(chǎn)物熒光產(chǎn)物的激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，發(fā)射波長(zhǎng)，發(fā)射波長(zhǎng)475 nm。 熒光胺與氨反應(yīng)的靈敏度比茚三酮與氨反應(yīng)熒光胺與氨反應(yīng)的靈敏度比茚三酮與氨反應(yīng)的靈敏度大約提高了的靈敏度大約提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。個(gè)數(shù)量級(jí)。 3 3、鄰苯二甲醛、鄰苯二甲醛(OPA)(OPA)法法 OPA最早是被作為柱后衍生試劑而引進(jìn)的，后來(lái)也逐漸應(yīng)用于柱前反應(yīng)中。 OPA能在還原劑巰基乙醇存在下和一級(jí)胺產(chǎn)生具有很強(qiáng)熒光強(qiáng)熒光的異吲哚衍生物，該反應(yīng)在室溫下1 min即可完成。 4、PTC-AA分析法分析法 屬柱前衍生法，源于Edma

26、n降解法測(cè)定蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)。 異硫氰酸苯酯(PITC)能在堿性條件下和氨基酸反應(yīng)，生成苯氨基硫甲酰（PTC）-AA，能在254nm檢出。此法分析靈敏度和熒光胺、OPA的熒光法相同。 5、Dansyl-Cl（DNS-Cl）法）法 熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯（熒光試劑二甲氨基萘磺酰氯（DNS-Cl）能與所有）能與所有氨基酸柱前反應(yīng)形成高穩(wěn)定性的帶有氨基酸柱前反應(yīng)形成高穩(wěn)定性的帶有熒光熒光的的DNS-氨基酸。但反應(yīng)耗時(shí)。氨基酸。但反應(yīng)耗時(shí)。6、磺酰氯二甲胺偶氮苯磺酰氯二甲胺偶氮苯（Dabsyl-Cl）法）法 靈敏度是靈敏度是Dansyl-Cl法的法的1/5，反應(yīng)產(chǎn)生，反應(yīng)產(chǎn)生有色衍生物，能方便地在有色

27、衍生物，能方便地在254 nm和和425 nm處處用紫外檢測(cè)。用紫外檢測(cè)。 有報(bào)道用有報(bào)道用DABITC代替代替Dabsyl-Cl，反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)生產(chǎn)生DABTH-AA，在酸性環(huán)境中顯紅色，易，在酸性環(huán)境中顯紅色，易在在254 nm，269 nm，436 nm 檢測(cè)檢測(cè)。四、氨基酸定性和定量分析四、氨基酸定性和定量分析 氨基酸的定性和定量分析一般采用紙層氨基酸的定性和定量分析一般采用紙層析、薄層層析、離子交換柱層析等方法。采析、薄層層析、離子交換柱層析等方法。采用用HPLC儀和氨基酸自動(dòng)分析儀更好。隨著儀和氨基酸自動(dòng)分析儀更好。隨著儀器的不斷改進(jìn)，一個(gè)樣品的測(cè)定僅需儀器的不斷改進(jìn)，一個(gè)樣品的測(cè)定

28、僅需20min即可完成。即可完成。單向紙層析單向紙層析 雙向紙層析雙向紙層析 薄層層析薄層層析 離子交換層析離子交換層析 高效液相色譜高效液相色譜（high performance liquid high performance liquid chromatographychromatography，HPLCHPLC） 蛋白質(zhì)中氨基酸的組成一般用每摩每摩爾蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的摩爾數(shù)爾蛋白質(zhì)中氨基酸殘基的摩爾數(shù)表示，或每每100g100g蛋白質(zhì)中含氨基酸的克數(shù)蛋白質(zhì)中含氨基酸的克數(shù)表示。 所以只有知道蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，才能推出它的氨基酸組成。 例：血小板衍生生長(zhǎng)因子的氨基酸組成五、測(cè)定氨基酸

29、組成的實(shí)驗(yàn)步驟五、測(cè)定氨基酸組成的實(shí)驗(yàn)步驟 目前各大公司如目前各大公司如Beckman，Hewlett Packard，Perkin E1mer，Waters等都等都有各自的自動(dòng)進(jìn)樣、氨基酸分析和定量有各自的自動(dòng)進(jìn)樣、氨基酸分析和定量報(bào)告聯(lián)為一體的商品化氨基酸自動(dòng)分析報(bào)告聯(lián)為一體的商品化氨基酸自動(dòng)分析儀出售，下面介紹幾種常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定儀出售，下面介紹幾種常規(guī)實(shí)驗(yàn)室測(cè)定氨基酸組成的方法。氨基酸組成的方法。 1、鄰苯二甲醛、鄰苯二甲醛(OPA)法法 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作：稱取稱取5mg OPA5mg OPA溶于溶于0.1m10.1m1甲醇中，加甲醇中，加入入50 50 ul ul巰基乙醇，用巰基乙醇，

30、用0.2 mol0.2 molL pH9.5L pH9.5的硼酸緩沖的硼酸緩沖液稀釋至液稀釋至1 ml1 ml。通氮?dú)獠⒈芄獗４妫扛魞商旒?。通氮?dú)獠⒈芄獗４?，每隔兩天加入?ul5ul巰基乙醇以維持其強(qiáng)度，此巰基乙醇以維持其強(qiáng)度，此OPAOPA反應(yīng)試劑反應(yīng)試劑能用能用2323周。取周。取10 u110 u1標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液標(biāo)準(zhǔn)氨基酸混合液(50100 (50100 pmolpmol) )或樣品水解液，加或樣品水解液，加10 10 ul ul pH9.5 pH9.5的硼酸緩沖液的硼酸緩沖液( (內(nèi)含內(nèi)含2 2SDSSDS和和100 100 pmolpmol - -氨基丁酸氨基丁酸) )，然后加

31、入，然后加入10 u1 OPA10 u1 OPA試劑，混合均勻，反應(yīng)試劑，混合均勻，反應(yīng)1 min1 min后再加入后再加入20 20 ul ul 0.1 mol/L 0.1 mol/L的的KH 2PO4KH 2PO4中止反應(yīng)，并立即取中止反應(yīng)，并立即取20 20 ul ul注入注入RP-HPLCRP-HPLC柱進(jìn)行分析。柱進(jìn)行分析。 儀器儀器為Beckman 344HPLC儀，反相柱RP-18 (250mm 4.6mm)，熒光檢測(cè)器。 流動(dòng)相：流動(dòng)相：A 50mmol/L 乙酸緩沖液pH6.8:甲醇:THF=80:19:1 B 50mmol/L 乙酸緩沖液pH6.8:甲醇80: 20梯度條件

32、梯度條件是：5min，10B; 10min，15B, 20min，10B； 25min，15B； 35min，50B； 50min，90B; 55min，100B。 用乙醇代替劇毒的乙腈或甲醇作為有機(jī)用乙醇代替劇毒的乙腈或甲醇作為有機(jī)相來(lái)定量分析氨基酸，靈敏度可達(dá)相來(lái)定量分析氨基酸，靈敏度可達(dá)10 pmol。 2 2、PTC-AAPTC-AA 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作：氨基酸或樣品在Eppendorf管中真空干燥后溶解在50 ul偶聯(lián)試劑(乙醇:三乙胺:水7:1:1)中。此溶液在旋轉(zhuǎn)真空干燥后再次溶解于50ul偶聯(lián)試劑中，然后加入2ul PITC(異硫氰酸苯酯)，反應(yīng)混合物在250C下保溫15 min

33、，再次旋轉(zhuǎn)真空干燥，真空度(1.313 Pa)。如此生成的PTC-AA溶解在適量流動(dòng)相A中，取一部分上柱定量分析。 儀器儀器為Beckman Gold System HPLC儀，反相柱RP-18 (250mm4.6mm)或PTH-柱，254 nm 檢測(cè)。 流動(dòng)相流動(dòng)相： A 50mmol/L 乙酸鈉，pH6.8 B 50mmo1L乙酸鈉，pH6.8:乙腈50 : 50 HPLC柱采用水浴夾套40恒溫，并用5流動(dòng)相B平衡。 梯度條件梯度條件是：0 min ,5%B, 5 min, 5-15B, 10 min,15B；30 min, 1560B, 40 min, 60 5B 流速流速是1mlmin

34、。 3 3、茚三酮法、茚三酮法 實(shí)驗(yàn)操作實(shí)驗(yàn)操作：水解后氨基酸樣品溶解于Na-S樣品稀釋液中100 u1上樣分析，實(shí)際進(jìn)樣量50 ul(100 pmol5nmol，均呈線性)。 儀器儀器：Beckman 6300氨基酸分析儀。 流動(dòng)相流動(dòng)相： Na-E 0.0 min 溫度溫度： 0.0 min 48 Na-D 27.80 min 11.8min 65 Na-F 39 min 32.5min 77 Na-R 76.00 min 50min 48 Na-E 77.00-90 min 流速流速： 緩沖液14 ml/ h 茚三酮7 ml/ h 蛋白質(zhì)的末端分析的目的: 確定其氨基末端殘基及羧基末端殘

35、基氨基末端殘基及羧基末端殘基 了解蛋白質(zhì)分子中肽鏈的組成情況肽鏈的組成情況。例如，牛胰島素單體有2個(gè)N-末端和2個(gè)C-末端，是由2條肽鏈通過(guò)二硫鍵相連而成；血紅蛋白分子有4個(gè)N-末端和4個(gè)C-末端，為4個(gè)亞基通過(guò)次級(jí)鍵組成的分子。 末端分析通常采用專一性化學(xué)試劑與末端氨基末端分析通常采用專一性化學(xué)試劑與末端氨基或羧基反應(yīng)，然后分解出被作用的末端氨基酸加或羧基反應(yīng)，然后分解出被作用的末端氨基酸加以測(cè)定。由于與羧基反應(yīng)的活化能相當(dāng)高，所以以測(cè)定。由于與羧基反應(yīng)的活化能相當(dāng)高，所以用于與羧基反應(yīng)的專一性試劑比較少，而用于與羧基反應(yīng)的專一性試劑比較少，而N端測(cè)定端測(cè)定的方法較多。氨肽酶及羧肽酶等外切酶

36、也常有應(yīng)的方法較多。氨肽酶及羧肽酶等外切酶也常有應(yīng)用。用。 下面介紹常用的下面介紹常用的N-末端和末端和C-末端測(cè)定的方法，末端測(cè)定的方法，以及封閉以及封閉N-末端的測(cè)定。末端的測(cè)定。二、二、C-C-末端的測(cè)定末端的測(cè)定三、三、封閉封閉N-N-末端的測(cè)定末端的測(cè)定一、一、N-N-末端的測(cè)定末端的測(cè)定一、一、N-N-末端的測(cè)定末端的測(cè)定 N末端測(cè)定方法比末端測(cè)定方法比C末端更加成熟、可靠和末端更加成熟、可靠和準(zhǔn)確，主要的方法有：準(zhǔn)確，主要的方法有：1、二硝基氟苯法（、二硝基氟苯法（DNFB法、法、Sanger法）法）2、二甲氨基萘磺酰氯法（、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）法）3、異硫氰酸苯

37、酯法（、異硫氰酸苯酯法（PITC法）法）4、DABITC法法5、氨肽酶法、氨肽酶法 1 1、二硝基氟苯法（、二硝基氟苯法（DNFBDNFB法、法、SangerSanger法）法） 二硝基氟苯在弱堿性條件下，與肽鏈的N端氨基作用，形成二硝基苯基肽鏈（DNP-肽），經(jīng)酸水解后，N端殘基成為二硝基苯基（二硝基苯基（DNP）-氨基酸氨基酸，可用有機(jī)溶劑（如乙醚）抽提，再進(jìn)行紙層析或薄層層析后，根據(jù)層析斑點(diǎn)的位置作定性鑒定。 FDNB不僅與N-末端的-氨基起反應(yīng)，也與側(cè)側(cè)鏈鏈上的-氨基、巰基、酚羥基和咪唑基反應(yīng)，但水解產(chǎn)物極性較強(qiáng)，不被乙醚抽提，而不干擾末端的測(cè)定。 當(dāng)N-端殘基為脯氨酸脯氨酸或羥脯氨酸

38、羥脯氨酸時(shí)，因DNP-脯氨酸或DNP-羥脯氨酸在鹽酸水解條件下極不穩(wěn)定，如DNP-脯氨酸易分解成脯氨酸以及-氯-DNP-氨基戊酸和-氯-DNP氨基戊酸，所以回收率甚低，不能進(jìn)行測(cè)定。 2、二甲氨基萘磺酰氯法（、二甲氨基萘磺酰氯法（DNS-Cl法）法） 熒光劑DNS-Cl可與肽鏈N端氨基反應(yīng)生成DNS-肽，經(jīng)酸水解，N-末端殘基形成DNS-氨基酸氨基酸，用乙酸乙酯抽提，然后用層析法鑒定。DNS-氨基酸于360nm或280nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈熒光，根據(jù)熒光點(diǎn)位置確定N端氨基酸。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹

39、磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸 DNS-脯氨酸脯氨酸經(jīng)6 M HCl于110水解過(guò)夜有70%被破壞。 色氨酸色氨酸及其DNS衍生物在鹽酸水解時(shí)完全被破壞，可改用巰基乙烷磺酸在真空下水解，并用乙酸乙酯抽提非極性得DNS-氨基酸加以鑒定。 賴氨酸的賴氨酸的-氨基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的氨基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基以及酪氨酸的羥基也能與咪唑基以及酪氨酸的羥基也能與DNS-Cl進(jìn)行反進(jìn)行反應(yīng)。但半胱氨酸和組氨酸側(cè)鏈衍生物在酸水解應(yīng)。但半胱氨酸和組氨酸側(cè)鏈衍生物在酸水解時(shí)并不穩(wěn)定。時(shí)并不穩(wěn)定。 當(dāng)當(dāng)N-末端為末端為組氨酸組氨酸、精氨酸精氨酸或或半胱氨酸半胱氨酸（S-羧羧甲基半胱

40、氨酸形式或磺酸形式）時(shí)，對(duì)其測(cè)定甲基半胱氨酸形式或磺酸形式）時(shí)，對(duì)其測(cè)定也受到一定限制。也受到一定限制。 當(dāng)當(dāng)N-末端氨基酸為末端氨基酸為谷氨酸谷氨酸或或谷氨酰胺谷氨酰胺、天冬氨天冬氨酸或天冬酰胺酸或天冬酰胺時(shí)，因有高溫水解過(guò)程，對(duì)它們時(shí)，因有高溫水解過(guò)程，對(duì)它們不能區(qū)別。不能區(qū)別。 3、異硫氰酸苯酯法、異硫氰酸苯酯法 在弱堿中，異硫氰酸苯酯（PITC）與N端氨基偶聯(lián)生成苯基硫甲酰衍生物（PTC-肽）。在酸性溶液中，PTC-肽經(jīng)環(huán)化裂解生成PTC-氨基酸和N端少個(gè)氨基酸的剩余多肽。由于PTC-氨基酸不穩(wěn)定，很快轉(zhuǎn)化成苯基乙內(nèi)酰硫脲氨基酸（PTH-氨基酸氨基酸）。 生成PTH-氨基酸非常穩(wěn)定，在

41、268nm處有強(qiáng)吸收峰。 噻咪啉酮衍生物經(jīng)氯乙烯抽提后，留下的肽噻咪啉酮衍生物經(jīng)氯乙烯抽提后，留下的肽鏈再可作下一次的循環(huán)，分析次一個(gè)氨基酸殘基。鏈再可作下一次的循環(huán)，分析次一個(gè)氨基酸殘基。因而此法也稱為因而此法也稱為Edman順序降解，可用于蛋白質(zhì)順序降解，可用于蛋白質(zhì)或多肽的或多肽的N端順序測(cè)定，一般可測(cè)定末端端順序測(cè)定，一般可測(cè)定末端30個(gè)左右個(gè)左右的殘基，是制造氨基酸順序分析儀的理論基礎(chǔ)。的殘基，是制造氨基酸順序分析儀的理論基礎(chǔ)。 4 4、DABITCDABITC法法 DABITC（4-N,N-對(duì)甲氨基偶氮苯-4-異硫氰酸酯）能與N端氨基反應(yīng)生成DABTH-氨基酸氨基酸，經(jīng)層析分離后，

42、用鹽酸氣熏即可出現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，很容易鑒定。 5、氨肽酶法、氨肽酶法 氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的N-端逐個(gè)的向里水解。 根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應(yīng)時(shí)間和氨基酸殘基釋放量作動(dòng)力學(xué)曲線，從而知道蛋白質(zhì)的 N-末端殘基順序。 但由于酶的特異性和對(duì)各種 氨基酸水解速度不用，結(jié)果 往往不易判斷，在實(shí)際應(yīng)用 中容易導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論。二、二、C末端的測(cè)定末端的測(cè)定 C末端測(cè)定方法較少，而且較N末端分析誤差大?？刹捎玫姆椒ㄓ校?、羧肽酶法、羧肽酶法2、硼氫化鋰法（、硼氫化鋰法（LiBH4法，還原法）法，還原法）3、肼解法、肼解法 1、羧肽酶法、羧肽酶法 羧肽酶是一種肽鏈

43、外切酶，能從多肽鏈的C端逐個(gè)的水解氨基酸。根據(jù)不同的反應(yīng)時(shí)間測(cè)出酶水解所釋放的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質(zhì)的C末端殘基順序。 實(shí)際應(yīng)用時(shí)，由于羧肽酶對(duì)不同的C末端氨基酸作用的速度不同，而且反應(yīng)是連續(xù)的，不能停在某一步上，因此給正確判斷氨基酸的順序造成了一定的困難。 4種常用羧肽酶：羧肽酶來(lái)源專一性CpA胰臟能釋放除pro、Arg和Lys以外的所有C端氨基酸CpB胰臟主要水解C端為Arg或Lys的肽鍵CpC植物或微生物相當(dāng)廣泛，幾乎能釋放C端的所有氨基酸CpY面包酵母可釋放C端所有氨基酸 2、硼氫化鋰法（、硼氫化鋰法（LiBH4法，還原法）法，還原法） 硼氫化鋰可與硼氫化鋰可與C末末端氨基反

44、應(yīng)生成相應(yīng)的端氨基反應(yīng)生成相應(yīng)的-氨基醇，水解后抽提氨基醇，水解后抽提氨基醇，可用層析法分氨基醇，可用層析法分離、鑒定。離、鑒定。 3、肼解法、肼解法 當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和無(wú)水肼在100反應(yīng)510 h，肼可斷裂所有的肽鍵，使所有氨基酸殘基形成肼的衍生物氨基酸酰肼，可與苯甲醛作用形成不溶的二亞芐基衍生物而除去，唯有C末端氨基酸以游離的形式存在于上清液中。 肼解法不適宜于C端為胱氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺的測(cè)定。 肽鏈中的丙氨酸、絲氨酸以及甘氨酸殘基形成的酰肼化合物不穩(wěn)定，在水溶液中容易轉(zhuǎn)化為原來(lái)的氨基酸而干擾結(jié)果。三、封閉三、封閉N-末端的測(cè)定末端的測(cè)定 有些蛋白質(zhì)的肽鏈沒(méi)有游離的氨基端沒(méi)有游離的

45、氨基端，較多的情況是氨基端因受到乙?；蚬劝彼釟埢陨憝h(huán)化為焦谷氨酸殘基而被封閉。此時(shí)我們可采用相應(yīng)方法對(duì)封閉N-末端進(jìn)行測(cè)定。 1乙酰化乙?；疦-末端末端 肼解條件下，N端的乙?；纬梢阴ｋ?。然后，使其與DNS-Cl作用，形成N-乙酰-N-丹磺酰肼，經(jīng)乙醚抽提出來(lái)后，可應(yīng)用薄層層析等方法鑒定。 由于乙?；c氨基形成的酰胺鍵比較穩(wěn)定，在部分酸水解條件（如pH 2，105 90min）下有可能產(chǎn)生乙?；被?，與已知標(biāo)準(zhǔn)化合物對(duì)照，也可以應(yīng)用層析等方法對(duì)其加以鑒定。 2吡咯烷酮羧酸末端吡咯烷酮羧酸末端 牛肝焦谷氨酸氨肽酶能水解出末端的吡咯烷酮羧酸，從而使剩下的有自由氨基端的肽鏈可以用Edman方

46、法遞減分析。 3 3甲?；┒思柞；┒?甲?；Ｒ约柞＜琢虬彼岬男问酱嬖谟谠梭w系的初生肽鏈的端部。 甲酰氨鍵比起一般肽鍵要不穩(wěn)定得多，所以弱酸條件（如0.5 M HCl的甲醇溶液）下在室溫處理48小時(shí)，可以使甲?；庀聛?lái)。然后再可仿照乙?；臏y(cè)定方法加以鑒定。 從蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定和從蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定和SDS聚聚丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，可以知道蛋白質(zhì)丙烯酰胺凝膠電泳的結(jié)果，可以知道蛋白質(zhì)是否由多亞基組成。若末端分析只有單一的是否由多亞基組成。若末端分析只有單一的結(jié)果，說(shuō)明分子由相同亞基組成，無(wú)需將亞結(jié)果，說(shuō)明分子由相同亞基組成，無(wú)需將亞基拆開(kāi)、分離?；痖_(kāi)、分離。 反之，分

47、子若有兩種以上不同亞基組成，反之，分子若有兩種以上不同亞基組成，首先要將不同亞基之間的連接拆開(kāi)，并進(jìn)行首先要將不同亞基之間的連接拆開(kāi)，并進(jìn)行分離提純。提純后的亞基肽鏈一般都是相對(duì)分離提純。提純后的亞基肽鏈一般都是相對(duì)分子質(zhì)量也比較大，需要將大的肽鏈降解成分子質(zhì)量也比較大，需要將大的肽鏈降解成小的肽段，并將肽段提純，然后才能正式開(kāi)小的肽段，并將肽段提純，然后才能正式開(kāi)始順序測(cè)定工作。始順序測(cè)定工作。 二、肽鏈的部分降解二、肽鏈的部分降解三、肽段的分離提純?nèi)?、肽段的分離提純一、亞基拆離和二硫鍵的斷裂一、亞基拆離和二硫鍵的斷裂一、亞基拆離和二硫鍵斷裂一、亞基拆離和二硫鍵斷裂 蛋白質(zhì)由一條以上的肽鏈組

48、成時(shí)，肽鏈間的結(jié)合可能是靠非共價(jià)鍵結(jié)合，也可能是靠共價(jià)鍵結(jié)合。在進(jìn)行肽鏈順序分析時(shí)，首先要將它們分離開(kāi)來(lái)。 若多亞基間以非共價(jià)鍵連接非共價(jià)鍵連接，在溫和條件下即可以拆離亞基，如改變?nèi)芤簆H，將pH降低到34或升高到910；或者加入變性劑，如8 mol/L 尿素或6 mol/L 鹽酸胍等。 例如，血紅蛋白經(jīng)8 mol/L 脲處理后，及鏈可以得到分離；核酮糖二磷酸羧化酶在0.2 mol/L 巰基乙醇及1% SDS溶液中保溫1小時(shí)，大小亞基便相互分開(kāi)。 拆離后的亞基可以用凝膠過(guò)濾方法進(jìn)行分離。拆拆分分 靠共價(jià)鍵結(jié)合的因比較牢固須用特殊的化學(xué)作用使其破壞。 最常見(jiàn)的是半胱氨酸殘基經(jīng)氧化作用而形成胱氨酸

49、殘基，即二硫鍵結(jié)構(gòu)二硫鍵結(jié)構(gòu)。 1過(guò)甲酸氧化法過(guò)甲酸氧化法 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：能將巰基（-SH）和二硫鍵（-S-S-同時(shí)氧化成磺基，生成的磺酸基很穩(wěn)定，肽鏈不再重新形成二硫鍵，便于肽鏈分離。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：氧化過(guò)程中，同時(shí)將蛋磺酸的側(cè)鏈氧化成亞砜，色氨酸的側(cè)鏈也遭破壞。 2還原法還原法 一般可使用過(guò)量巰基化合物，如-巰基乙醇巰基乙醇。在室溫或pH 89條件下放置數(shù)小時(shí)，即可使二硫鍵還原成巰基。 加入8 mol/L尿素或6 mol/L鹽酸胍使蛋白質(zhì)變性。在這種情況下，還原劑才能有效地作用于暴露的二硫鍵。 二硫鍵還原后，需要用巰基保護(hù)試劑巰基保護(hù)試劑，如碘乙酸，以防其重新被氧化。二、肽鏈的部分降解二、肽鏈

50、的部分降解 由于氨基酸順序測(cè)定多數(shù)采用Edman降解法，它一次能分析肽鏈長(zhǎng)度約10余個(gè)氨基酸殘基，所以分離得到的單鏈如果太長(zhǎng)，須將長(zhǎng)的肽鏈斷裂成易將長(zhǎng)的肽鏈斷裂成易分析的較短肽鏈分析的較短肽鏈。 肽鏈部分降解的方法要求選擇性強(qiáng)、裂解點(diǎn)少、反應(yīng)率高，一般采用化學(xué)裂解和酶解法兩種。 1 1化學(xué)裂解法化學(xué)裂解法 溴化氰（溴化氰（CNBr）與肽鏈中蛋氨酸側(cè)鏈的硫醚基發(fā)生反應(yīng)，生成環(huán)化的溴化亞氨內(nèi)酯，此產(chǎn)物水解后，產(chǎn)生高絲氨酸內(nèi)酯，使蛋氨酸羧基端的肽鍵斷裂。 這一方法的優(yōu)點(diǎn)是產(chǎn)率高（可達(dá)85%）、專一性強(qiáng)，故實(shí)際應(yīng)用較多。 2 2酶解法酶解法 酶解法相對(duì)化學(xué)裂解法而言，有許多優(yōu)點(diǎn)，如專一性強(qiáng)、裂解條件溫

51、和、副反應(yīng)少等，再則蛋白水解酶對(duì)肽鏈的水解率也比較高，而且不同的蛋白水解酶對(duì)不同氨基酸形成的肽鍵水解專一性不同。 因此，酶解法被廣泛使用。 幾種常用蛋白水解酶的作用位點(diǎn)幾種常用蛋白水解酶的作用位點(diǎn) 3羥胺裂解法羥胺裂解法 羥胺（羥胺（NH2OH）在堿性條件下（pH 9.0）能專一性裂解-Asn-Gly-間的肽鍵，也能部分裂解-Asn-Leu-或-Asn-Ala-間的肽鍵；在酸性條件可以斷裂-Asp-Pro-間的肽鍵，產(chǎn)率可達(dá)80%。 4部分酸水解部分酸水解 一般認(rèn)為酸水解沒(méi)有什么專一性而被忽視，后來(lái)發(fā)現(xiàn)部分酸水解還是有一定的專一性。 在稀酸稀酸的條件下，也即在高濃度胍的甲酸中（pH 2.5），

52、可裂解-Asp-Pro-間的肽鍵，產(chǎn)率高達(dá)80%90%。 在濃酸濃酸條件下，含羥基氨基酸氨基端肽鍵容易斷裂。 但是終究部分酸水解的專一性差，副反應(yīng)多，此法比較難掌握。三、肽段的分離提純?nèi)?、肽段的分離提純 肽鏈經(jīng)部分裂解得到肽片段必須分離提純，才能進(jìn)一步測(cè)定其氨基酸順序。 先采用凝膠過(guò)濾，得到不同相對(duì)分子質(zhì)量的肽片段組分，同時(shí)也脫去了樣品中的鹽類。然后，肽片段組分可用離子交換層析進(jìn)一步提純，也可應(yīng)用雙相高壓紙電泳和層析相結(jié)合的方法，HPLC或FPLC具有更高的分辨率。 目前，進(jìn)行蛋白質(zhì)序列測(cè)定有二個(gè)關(guān)鍵步驟，目前，進(jìn)行蛋白質(zhì)序列測(cè)定有二個(gè)關(guān)鍵步驟，即：即： 氨基酸殘基一個(gè)一個(gè)氨基酸殘基一個(gè)一個(gè)依

53、次依次從蛋白質(zhì)和多肽的末端從蛋白質(zhì)和多肽的末端切割下來(lái)?？刹捎没瘜W(xué)法或酶法進(jìn)行裂解?？汕懈钕聛?lái)。可采用化學(xué)法或酶法進(jìn)行裂解?？梢詮牡鞍踪|(zhì)和多肽的以從蛋白質(zhì)和多肽的N端進(jìn)行裂解，也可以從端進(jìn)行裂解，也可以從C端進(jìn)行分析。端進(jìn)行分析。正確鑒定每次切割下來(lái)的氨基酸殘基。利用高效正確鑒定每次切割下來(lái)的氨基酸殘基。利用高效液相色譜，對(duì)帶有生色基團(tuán)的氨基酸殘基進(jìn)行液相色譜，對(duì)帶有生色基團(tuán)的氨基酸殘基進(jìn)行分離分析。分離分析。二、二、 N端蛋白質(zhì)序列儀端蛋白質(zhì)序列儀三、影響三、影響N端端Edman反應(yīng)裂解率的因素反應(yīng)裂解率的因素四、四、N N端測(cè)序前樣品處理端測(cè)序前樣品處理一、一、N端測(cè)序原理端測(cè)序原理五、五

54、、C C端測(cè)序原理端測(cè)序原理六、六、C C端蛋白質(zhì)序列儀端蛋白質(zhì)序列儀七七、C C端測(cè)序樣品前處理端測(cè)序樣品前處理八、影響八、影響C C端測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)率的因素端測(cè)序反應(yīng)產(chǎn)率的因素一、一、N N端測(cè)序原理端測(cè)序原理 至今應(yīng)用最廣的N端順序測(cè)定法大多仍以Edman降解原理為基礎(chǔ)。 偶聯(lián)偶聯(lián)：蛋白質(zhì)和多肽的自由-氨基經(jīng)與異硫氰酸苯酯(PITC)試劑偶聯(lián)，與其緊挨的第二個(gè)殘基的鍵合力大大減弱，很容易斷裂。 裂解裂解：在無(wú)水條件下酸裂解，僅僅切下反應(yīng)的那個(gè)殘基，得到ATZ-氨基酸。緊挨的第二個(gè)氨基酸殘基暴露出自由的-氨基，又可與PITC進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng)。 轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化：ATZ-氨基酸不穩(wěn)定，三氟乙酸水溶液（25%

55、）條件下可轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的PTH-氨基酸。 PTH-氨基酸的鑒定氨基酸的鑒定：可以通過(guò)薄層層析、氣相色譜、高效液相色譜及質(zhì)譜等各種手段進(jìn)行分析。二、二、N N端蛋白質(zhì)序列儀端蛋白質(zhì)序列儀 自70年代初自動(dòng)序列儀誕生以來(lái)，經(jīng)過(guò)了一系列更新?lián)Q代，儀器日趨靈敏、快速，下面就其中幾種代表性的儀器作一簡(jiǎn)單介紹。 1 1液相旋轉(zhuǎn)杯序列儀液相旋轉(zhuǎn)杯序列儀 這是最初的自動(dòng)化儀器。整個(gè)儀器的“核心”部分是一個(gè)反應(yīng)杯，它由一個(gè)馬達(dá)帶動(dòng)并有調(diào)速控制。 蛋白質(zhì)或多肽樣品經(jīng)溶解后，通過(guò)一根導(dǎo)管注入反應(yīng)杯反應(yīng)杯中，樣品隨著旋轉(zhuǎn)的離心力被均勻地涂在杯壁上，形成一層薄膜薄膜，其厚薄可由轉(zhuǎn)速控制。反應(yīng)的試劑和溶劑分別通過(guò)導(dǎo)管進(jìn)入反

56、應(yīng)杯，與杯內(nèi)薄層上的樣品的N端自由氨基進(jìn)行Edman反應(yīng)；降解下來(lái)的ATZ氨基酸衍生物通過(guò)另一導(dǎo)管引出并收集，再將ATZ氨基酸轉(zhuǎn)換成PTH氨基酸后進(jìn)行鑒定，依次循環(huán)分析。此儀器由于消耗的樣品量多，目前在蛋白質(zhì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)室已很少作用。 2固相序列分析儀固相序列分析儀 由于一些小肽或疏水性多肽，不易吸附在一般支持物上(如旋轉(zhuǎn)杯)，只得將它們共價(jià)固定在惰性共價(jià)固定在惰性載體載體后進(jìn)行Edman化學(xué)降解反應(yīng)。 固相測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)是樣品共價(jià)結(jié)合后，不會(huì)在有機(jī)溶劑洗滌，抽提等過(guò)程中丟失，因而可以增加循環(huán)次數(shù)。其缺點(diǎn)是共價(jià)結(jié)合不外乎通過(guò)氨基或羧基與載體上的活性基團(tuán)作用，蛋白質(zhì)和多肽中的谷氨酸、天冬氨酸、賴氨酸等含

57、有除-氨基或-羧基以外氨基或羧基的氨基酸殘基將結(jié)合在載體上，不能正確確定。 3 3氣相序列儀氣相序列儀 用用彈筒型玻璃反應(yīng)室彈筒型玻璃反應(yīng)室(內(nèi)部體積約內(nèi)部體積約0.05ml）代替）代替了液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用一種了液相序列儀中的旋轉(zhuǎn)玻璃杯，用一種四級(jí)銨鹽聚四級(jí)銨鹽聚合物合物“polybrene”固定樣品，固定樣品，Edamn降解反應(yīng)中有的降解反應(yīng)中有的試劑如三甲胺以試劑如三甲胺以氣體方式輸送氣體方式輸送，其它試劑以流動(dòng)或，其它試劑以流動(dòng)或液相脈沖方式輸送。液相脈沖方式輸送。 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高，耗費(fèi)樣品量少，通常僅需靈敏度高，耗費(fèi)樣品量少，通常僅需10100 pmol；試劑和溶劑消耗

58、少，大約是液相序列；試劑和溶劑消耗少，大約是液相序列儀的儀的110，降低了費(fèi)用；，降低了費(fèi)用； 縮短了每步降解循環(huán)時(shí)間，縮短了每步降解循環(huán)時(shí)間，提高了分析效率。提高了分析效率。三、影響三、影響N端端Edman反應(yīng)裂解率的因素反應(yīng)裂解率的因素 在測(cè)序中往往可以發(fā)現(xiàn)，即使N端很均一的蛋白質(zhì)(第一個(gè)循環(huán)出現(xiàn)單個(gè)氨基酸殘基)，經(jīng)過(guò)十幾個(gè)循環(huán)后背景明顯不及第背景明顯不及第一個(gè)殘基清晰一個(gè)殘基清晰。這是由于Edman反應(yīng)是一個(gè)化學(xué)過(guò)程，在其偶聯(lián)、裂解、轉(zhuǎn)化等步驟都有可能發(fā)生一些副反應(yīng)，從而影響最終裂解效率。 例如 三氟乙酸除起裂解作用外，可能與絲氨酸Ser和蘇氨酸Thr上的羥基反應(yīng)，繼而部分封閉Ser和T

59、hr的N端-氨基，導(dǎo)致Ser和Thr時(shí)產(chǎn)率突然降低。 絲氨酸和蘇氨酸的PTH-衍生物也會(huì)部分轉(zhuǎn)化成其他產(chǎn)物，造成產(chǎn)率的降低。 偶聯(lián)試劑PITC本身也將發(fā)生副反應(yīng)，形成一些“雜質(zhì)”。四、四、N N端測(cè)序前樣品處理端測(cè)序前樣品處理 1 . 純度鑒定純度鑒定 宜采用多種互補(bǔ)有效的手段鑒定樣品的純度，如SDS-PAGE、反相HPLC、毛細(xì)管電泳、陰離子或陽(yáng)離子的FPLC等。 2 . 脫鹽脫鹽 可采用多種有效的脫鹽方法如反相HPLC、凝膠過(guò)濾、透析、超濾等，但需注意在進(jìn)行脫鹽過(guò)程中除需考慮是否除鹽完全外，所用試劑、儀器乃至操作規(guī)范也必須是測(cè)序級(jí)的，應(yīng)盡量避免引入新的雜質(zhì)。 3. 疏基修飾疏基修飾 4.

60、去除去除N端封閉的基團(tuán)端封閉的基團(tuán)五、五、C C端測(cè)序原理端測(cè)序原理 雖然建立在Edman化學(xué)法上的自動(dòng)化N端測(cè)序技術(shù)日趨成熟，但仍有不少問(wèn)題需借助C端序列分析來(lái)解決。C端測(cè)序尤其適合于基因重組蛋白是否正確表達(dá)的鑒定和大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)的質(zhì)量控制、N端封閉蛋白的分析以及DNA探針的設(shè)計(jì)。 原理原理 基于與基于與N端端Edman降解類似的原理，降解類似的原理， C端分端分析采用化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)和多肽的析采用化學(xué)試劑與蛋白質(zhì)和多肽的-羧基反應(yīng)羧基反應(yīng)，反應(yīng)后的反應(yīng)后的C末端衍生物末端衍生物被切割下來(lái)，通過(guò)被切割下來(lái)，通過(guò)HPLC系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)行分離分析分離分析。一個(gè)完整的。一個(gè)完整的C端序列分析包端序列