第二章 蛋白質的共價結構

1、第二章第二章 蛋白質的共價結構蛋白質的共價結構蛋白質的化學組成和分類蛋白質的化學組成和分類凱氏定氮法凱氏定氮法蛋白質含量的測定蛋白質含量的測定凱氏定氮法凱氏定氮法 氮占生物組織中所有含氮物質的絕大部分。因此，可以將生氮占生物組織中所有含氮物質的絕大部分。因此，可以將生物組織的含氮量近似地看作蛋白質的含氮量。由于大多數(shù)蛋白質物組織的含氮量近似地看作蛋白質的含氮量。由于大多數(shù)蛋白質的含氮量接近于的含氮量接近于16%16%，所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計，所以，可以根據(jù)生物樣品中的含氮量來計算蛋白質的大概含量。算蛋白質的大概含量。 一般，樣品含氮量平均在一般，樣品含氮量平均在16%，取其倒數(shù)，

2、取其倒數(shù)100/16=6.25，即為，即為蛋白質換算系數(shù)，其含義是樣品中每存在蛋白質換算系數(shù)，其含義是樣品中每存在1g元素氮，就說明含有元素氮，就說明含有6.25g 蛋白質；蛋白質； 蛋白質含量蛋白質含量=氮的量氮的量6.25 優(yōu)點：對原料無選擇性，儀器簡單，方法簡單；優(yōu)點：對原料無選擇性，儀器簡單，方法簡單； 缺點：易將無機氮缺點：易將無機氮(如核酸中的氮如核酸中的氮)，都歸入蛋白質中，不精確。，都歸入蛋白質中，不精確。 n這類蛋白質只含由這類蛋白質只含由 - -氨基酸組成的肽鏈氨基酸組成的肽鏈，不含其它成，不含其它成分。分。n清蛋白和球蛋白：清蛋白和球蛋白：( (albumin and g

3、lobulin)廣泛存在于廣泛存在于動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易動物組織中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。溶于稀酸中。n谷蛋白谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可不溶于水，易溶于稀酸、稀堿中，后者可溶于溶于70708080乙醇中。乙醇中。n精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質，存在與細胞核中。精蛋白和組蛋白：堿性蛋白質，存在與細胞核中。n硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，硬蛋白：存在于各種軟骨、腱、毛、發(fā)、絲等組織中，分為角蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。分為角

4、蛋白、膠原蛋白、彈性蛋白和絲蛋白。n糖蛋白：由簡單蛋白與糖類物質組成糖蛋白：由簡單蛋白與糖類物質組成。如細胞膜中的糖蛋白等。n脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結合而成脂蛋白：由簡單蛋白與脂類結合而成。含三酰甘油、膽固醇、磷脂。如血清-，-脂蛋白等。n核蛋白：由簡單蛋白與核酸結合而成。核蛋白：由簡單蛋白與核酸結合而成。如細胞核中的核糖核蛋白等。n色蛋白：由簡單蛋白與色素物質結合而成色蛋白：由簡單蛋白與色素物質結合而成。如血紅蛋白、葉綠蛋白和細胞色素等 磷蛋白：由簡單蛋白質和磷酸組成。磷蛋白：由簡單蛋白質和磷酸組成。如胃蛋白酶、酪蛋白、角蛋白、彈性蛋白、絲心蛋白等。蛋白質分子的形狀和大小蛋白質分子的形狀和

5、大小根據(jù)形狀和溶解度分為三大類：根據(jù)形狀和溶解度分為三大類：(globular protein)(membrane protein)(Fibrous protein)12 600估算氨基酸殘基數(shù)目估算氨基酸殘基數(shù)目 對于不含輔基的簡單蛋白質，用對于不含輔基的簡單蛋白質，用110除它除它的相對分子質量，即可約略估算出其殘基數(shù)。的相對分子質量，即可約略估算出其殘基數(shù)。n蛋白質中20種氨基酸的平均相對分子質量約為138，但在多數(shù)蛋白質中較小的氨基酸占優(yōu)勢，因此平均相對分子質量約128n每形成一個肽鍵失去一分子水（相對分子質量18），氨基酸殘基的平均相對分子質量約為110。 1.酶酶：作為酶的化學本質

6、，溫和、快速、專一，任何：作為酶的化學本質，溫和、快速、專一，任何生命活動之必須，酶的另一化學本質是生命活動之必須，酶的另一化學本質是RNA，不過它，不過它比蛋白質差遠了，種類、速度、數(shù)量。比蛋白質差遠了，種類、速度、數(shù)量。2.免疫系統(tǒng)免疫系統(tǒng)：防御系統(tǒng)，抗原（進入：防御系統(tǒng)，抗原（進入“體內體內”的生物的生物大分子和有機體），發(fā)炎。大分子和有機體），發(fā)炎。細胞免疫：細胞免疫：T細胞本身，分化，膿細胞。細胞本身，分化，膿細胞。體液免疫：體液免疫：B細胞，釋放抗體，免疫球蛋白（細胞，釋放抗體，免疫球蛋白（Ig）。）。3.肌肉肌肉：肌肉的伸張和收縮靠的是肌動蛋白和肌球蛋：肌肉的伸張和收縮靠的是肌動

7、蛋白和肌球蛋白互動的結果，體育生化。白互動的結果，體育生化。4.運輸和儲存氧氣運輸和儲存氧氣：Hb和和Mb。 5.激素激素：含氮類激素，固醇類激素。：含氮類激素，固醇類激素。6.基因表達調節(jié)基因表達調節(jié)：操縱子學說，阻遏蛋白。：操縱子學說，阻遏蛋白。 7.生長因子生長因子：EGF（表皮生長因子），（表皮生長因子），NGF（神經(jīng)生（神經(jīng)生長因子），促使細胞分裂。長因子），促使細胞分裂。8.信息接收信息接收：激素的受體，糖蛋白，：激素的受體，糖蛋白，G蛋白。蛋白。9.結構成分結構成分：膠原蛋白（肌腱、筋），角蛋白（頭發(fā)、：膠原蛋白（肌腱、筋），角蛋白（頭發(fā)、指甲），膜蛋白等。生物體就是蛋白質堆積而

8、成，人指甲），膜蛋白等。生物體就是蛋白質堆積而成，人的長相也是由蛋白質決定的。的長相也是由蛋白質決定的。10.精神、意識方面精神、意識方面：記憶、痛苦、感情靠的是蛋白質：記憶、痛苦、感情靠的是蛋白質的構象變化，蛋白質的構象分類是目前熱門課題。的構象變化，蛋白質的構象分類是目前熱門課題。11.蛋白質是遺傳物質？蛋白質是遺傳物質？只有不確切的少量證據(jù)。如庫只有不確切的少量證據(jù)。如庫魯病毒，怕蛋白酶而不怕核酸酶。魯病毒，怕蛋白酶而不怕核酸酶。 一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵一個氨基酸的氨基與另一個氨基酸的羧基之間失水形成的酰胺鍵稱為肽鍵，所形成的化合物稱為肽。稱為肽鍵，所形

9、成的化合物稱為肽。由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸組成的肽則稱為由兩個氨基酸組成的肽稱為二肽，由多個氨基酸組成的肽則稱為多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。多肽。組成多肽的氨基酸單元稱為氨基酸殘基。 n在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸在多肽鏈中，氨基酸殘基按一定的順序排列，這種排列順序稱為氨基酸順序。順序。n通常在多肽鏈的一端含有一個游離的通常在多肽鏈的一端含有一個游離的 - -氨基，稱為氨基端或氨基，稱為氨基端或N-N-端；在另端；在另一端含有一個游離的一端含有一個游離的 - -羧基，稱為羧基端或羧基，稱為羧基端或C-C-端。端。n氨基酸的順序是

10、從氨基酸的順序是從N-N-端的氨基酸殘基開始，以端的氨基酸殘基開始，以C-C-端氨基酸殘基為終點的端氨基酸殘基為終點的排列順序。如上述五肽可表示為：排列順序。如上述五肽可表示為： Ser-Val-Tyr-Asp-GlnCCNCCNCCNCCNCC H2C HC H2C H2C H2C O O-O HC O2HC H2C O N H2O HC H3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnC H3N-端C-端肽鍵 肽和肽鍵的結構肽和肽鍵的結構肽與肽鍵肽與肽鍵肽與肽鍵肽與肽鍵 肽鍵的特點是氮原肽鍵的特點是氮原子上的孤對電子與子上的孤對電子與羰基具有明顯的共羰基具有明顯的共軛作

11、用。軛作用。組成肽鍵的原子處組成肽鍵的原子處于同一平面。于同一平面。肽鍵中的肽鍵中的C-N鍵具鍵具有部分雙鍵性質，有部分雙鍵性質，不能自由旋轉。不能自由旋轉。在大多數(shù)情況下，在大多數(shù)情況下，以反式結構存在。以反式結構存在。 在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質的亞單位。在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。如：腦啡肽；激素

12、類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。NHCOC H2N HCOC HN HCOC H3C HC HO HC H2O HC HH NCN HC HCN HC H2CCOC HNHH OC H2N HN HC HC HC H3C H2C H3COOOOC H2C H2SOO H鵝 膏 覃 堿 的 化 學 結 構天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽 +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-腦啡肽 Leu-腦啡肽C y sT y rI L eG l nA s nC y sP r oL e uG l yN H

13、2SS牛催產素C y sT y rG l nA s nC y sP r oSSP h eA r gG l yN H2牛加壓素n谷胱甘肽谷胱甘肽二硫鍵二硫鍵 1. 蛋白質的一級結構蛋白質的一級結構(Primary structure)包括：包括： (1)組成蛋白質的多肽鏈數(shù)目組成蛋白質的多肽鏈數(shù)目. (2)多肽鏈的氨基酸順序，多肽鏈的氨基酸順序， (3)多肽鏈內或鏈間二硫鍵的數(shù)目和多肽鏈內或鏈間二硫鍵的數(shù)目和位置。位置。 其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎序，它是蛋白質生物功能的基礎。2.蛋白質的一級結構的測定蛋白質的一級結構的測定 蛋白質氨

14、基酸順序的測定是蛋白質化學研究的基礎。自從蛋白質氨基酸順序的測定是蛋白質化學研究的基礎。自從1953年年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質測定了胰島素的一級結構以來，現(xiàn)在已經(jīng)有上千種不同蛋白質的一級結構被測定的一級結構被測定。(1) 測定蛋白質一級結構的要求測定蛋白質一級結構的要求 三三.蛋白質一級結構的測定蛋白質一級結構的測定A.樣品必需純（樣品必需純（97%以上）；以上）；B.知道蛋白質的分子量；知道蛋白質的分子量；C.知道蛋白質由幾個亞基組成；知道蛋白質由幾個亞基組成；D.測定蛋白質的氨基酸組成；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)。測定蛋白質的氨基酸組成

15、；并根據(jù)分子量計算每種氨基酸的個數(shù)。E.測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。測定水解液中的氨量，計算酰胺的含量。(2)1.1. 測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目測定蛋白質分子中多肽鏈的數(shù)目 通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數(shù)與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數(shù)目。 多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分：由多條多肽鏈組成的蛋白質分子，必須先進行拆分。幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，如，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體；可用8mol/L尿素或6mol/L鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈(亞基).3.3.二硫鍵的斷裂二硫鍵的斷裂：幾條多肽鏈通過二硫鍵交聯(lián)在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L鹽

16、酸胍存在下，用過量的-巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，以防止它重新被氧化?？梢酝ㄟ^加入鹽酸胍方法解離多肽鏈之間的非共價力；應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。 巰基的保護-OOCCHCH2SHNH3+ICH2CNH2OCH2OCClOCH2Cl-OOCCHCH2SNH3+OCCH2OCH2-OOCCHCH2SNH3+CH2CNH2O-OOCCHCH2SNH3+4.4.測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；測定每條多肽鏈的氨基酸組成，并計算出氨基酸成分的分子比；5.5.分析多肽鏈的分析多肽鏈的N-N-末端和末端和C-C-末端末端

17、末端氨基酸的測定：末端氨基酸的測定：多肽鏈端基氨基酸分為兩類，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸測定的主要方法有： 在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰在堿性條件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以與氯）可以與N-N-端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰端氨基酸的游離氨基作用，得到丹磺酰- -氨基酸。氨基酸。此法的優(yōu)點是丹磺酰此法的優(yōu)點是丹磺酰- -氨基酸有很強的熒光性質，檢測靈敏度氨基酸有很強的熒光性質，檢測靈敏度可以達到可以達到1 1 1010-9-9molmol。N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH

18、3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸此法是多肽鏈此法是多肽鏈C-C-端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條端氨基酸分析法。多肽與肼在無水條件下加熱，件下加熱，C-C-端氨基酸即從肽鏈上解離出來，端氨基酸即從肽鏈上解離出來，其余的氨基酸則其余的氨基酸則變成肼化物變成肼化物, ,即即( (n-1)n-1)個氨基酸酰肼個氨基酸酰肼。肼化物能夠與苯甲醛縮合。肼化物能夠與苯甲醛縮合成不溶于水的物質而與成不溶于水的物質而與C-C-端氨基酸分離端氨基酸分離。H2NCHCROHNCHCROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORn

19、CCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈氨肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的的N-N-端逐個的向里水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶端逐個的向里水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，按反應時間和氨基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質的基酸殘基釋放量作動力學曲線，從而知道蛋白質的N-N-末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水末端殘基順序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸殘基為解以亮氨酸殘基為N-N-末端的肽鍵速度最大。末端的肽鍵

20、速度最大。 E.E.羧肽酶法羧肽酶法：羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈：羧肽酶是一種肽鏈外切酶，它能從多肽鏈的的C-C-端逐個的水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放端逐個的水解。根據(jù)不同的反應時間測出酶水解所釋放出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質的出的氨基酸種類和數(shù)量，從而知道蛋白質的C-C-末端殘基順序。末端殘基順序。目前常用的羧肽酶有四種：目前常用的羧肽酶有四種：A,B,C和和Y；A和和B來自胰臟；來自胰臟；C來來自柑桔葉；自柑桔葉；Y來自面包酵母。羧肽酶來自面包酵母。羧肽酶A能水解除能水解除Pro,Arg和和Lys以外的所有以外的所有C-末端氨基酸殘基；末端氨基酸殘基；B只能水

21、解只能水解Arg和和Lys為為C-末末端殘基的肽鍵。端殘基的肽鍵。6.6.多肽鏈斷裂成多個肽段多肽鏈斷裂成多個肽段，可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品可采用兩種或多種不同的斷裂方法將多肽樣品斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。斷裂成兩套或多套肽段或肽碎片，并將其分離開來。氨基酸順序自動分析氨基酸順序自動分析儀只能準確測定儀只能準確測定50aa以下的肽鏈，而一般的蛋白質都含有以下的肽鏈，而一般的蛋白質都含有100以上的以上的aa殘基，所以，事先要將蛋白質打斷成多肽甚至寡肽，再上機分析，而且要殘基，所以，事先要將蛋白質打斷成多肽甚至寡肽，再上機分析，而且要2套以上，便于以后拼接。套

22、以上，便于以后拼接。A.A.酶解法酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜熱菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶氨肽酶B.B.化學法化學法：溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成溴化氰水解法，它能選擇性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽鍵的肽鍵。CH3S：CH2CH2CHN HCN HCHCOOR+B rC+NB r-CH3S+CH2CH2CHN HCN HCHCOORCNCH3SCN CH2CHN HCN HCHCOORCH2+H2O+CH2CHN HCOCH2OH3N+CHCOR高絲氨酸內酯多肽的選擇性降解的方法多肽的選擇性降解的方法7.

23、7.測定每個肽段的氨基酸順序。測定每個肽段的氨基酸順序。8.8.確定肽段在多肽鏈中的次序確定肽段在多肽鏈中的次序：利用兩套或多套肽段的氨基酸順序彼此間的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的氨基酸順序。9.9.確定原多肽鏈中二硫鍵的位置確定原多肽鏈中二硫鍵的位置：一般采用胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈，再利用雙向電泳技術分離出各個肽段，用過甲酸處理后，將每個肽段進行組成及順序分析，然后同其它方法分析的肽段進行比較，確定二硫鍵的位置。蛋白質一級結構測定的步驟蛋白質一級結構測定的步驟1 、蛋白質的分離純化蛋白質的分離純化 Purification2、二硫鍵的拆分與保護、二硫鍵的拆分與保護 S-S cle

24、avage & blocking3、(亞基分離）亞基分離） Subunit separation4、多種方法的部分水解、多種方法的部分水解 Partial h.5、分離水解后得到的多肽、分離水解后得到的多肽 Peptide s.6、測序、測序 Sequencing7、重疊、重疊 Overlapping 、蛋白質序列數(shù)據(jù)庫蛋白質序列數(shù)據(jù)庫n蛋白質信息庫蛋白質信息庫（Protein Information Resource, PIR ）n基因序列數(shù)據(jù)庫基因序列數(shù)據(jù)庫（Gen Bank, Gen Sequence Data Bank）n歐洲分子生物學實驗室數(shù)據(jù)庫歐洲分子生物學實驗室數(shù)據(jù)庫(E

25、uropean Molecular Biology Laboratory Data Bank, EMBL)四四.蛋白質的氨基酸序列蛋白質的氨基酸序列 與生物功能與生物功能n同源蛋白質的物種差異與生物進化同源蛋白質的物種差異與生物進化1 同源蛋白質同源蛋白質 在不同生物體中行使相同或相似功能的蛋白質 不變殘基（invariant residue） 可變殘基（variable residue）2 細胞色素細胞色素C (cytochrome c) 來自任兩個物種的同源蛋白質，其序列間的氨基酸差異數(shù)目與這些物種間的系統(tǒng)發(fā)生差異是成比例的，即在進化位置上相差愈遠，其氨基酸序列之間的差別愈大。l 60 個物種中，有 28個位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基。l 可變殘基可能隨著進化而變異，而且不同種屬的細胞色素 C氨基酸差異數(shù)與種屬之間的親緣關系相關。親緣關系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進化樹）。細胞色素細胞色素C黃色：黃色： 不變殘基不變殘基（invariable residues）藍色藍色 ： 保守氨基酸（保守氨基酸（conservative