PCR技術(shù)詳解課件

1、1 PCRPCR技術(shù)詳解技術(shù)詳解2一一二二三三四四五PCRPCR簡史簡史定義定義基本原理基本原理反應(yīng)要素反應(yīng)要素PCRPCR的類型的類型六六PCRPCR反應(yīng)流程反應(yīng)流程目錄八常見常見問題分析問題分析九PCRPCR技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域七PCRPCR產(chǎn)物檢測產(chǎn)物檢測3一、一、PCRPCR簡史簡史 1971年，Khorana提出：經(jīng)過DNA變性，與合適引物雜交，用DNA聚合酶延伸引物，并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。 但由于測序和引物合成的困難，以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能，所以，Khorana的設(shè)想被人們遺忘了4 1985年，美國PE-Cetus公司的Mullis等人

2、發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 最初采用E-coli DNA聚合酶進行PCR，由于該酶不耐熱，使這一過程耗時，費力，且易出錯，未能推廣 1988年，Saiki等人從嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提出TaqDNA聚合酶，使得PCR技術(shù)得以廣泛應(yīng)用 1993年，Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎5二、定義二、定義 PCR(PCR(聚合酶鏈式反應(yīng)）是利用聚合酶鏈式反應(yīng)）是利用DNADNA在體外高在體外高溫（溫（9595左右）時左右）時變性變性成單鏈，低溫成單鏈，低溫退火退火（經(jīng)常是（經(jīng)常是6060左右）時引物與單鏈按堿基互補配對原則結(jié)合，左右）時引物與單鏈按堿基互補配對原則結(jié)合，

3、再調(diào)溫度至再調(diào)溫度至DNADNA聚合酶最適反應(yīng)溫度（聚合酶最適反應(yīng)溫度（7272左左右），右），DNADNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖聚合酶沿著磷酸到五碳糖(53)(53)的的方向方向延伸延伸合成互補鏈合成互補鏈6三、基本原理三、基本原理 PCR技術(shù)模擬DNA 的天然復(fù)制過程, 其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物, 該原理主要包括3個基本反應(yīng)過程：模板變性引物退火新鏈延伸71234522557294時間（min）溫度（）適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍http:/ n

4、：循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)n X：平均效率,約為0.85 n：循環(huán)次數(shù) 11四、反應(yīng)要素四、反應(yīng)要素1.1.熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶2.2.引物引物3.3.模板模板4.4.dNTPdNTP5.5.二價陽離子二價陽離子6.6.維持維持pHpH的緩沖液的緩沖液121.1. 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶目前有兩種Taq DNA 聚合酶供應(yīng)：天然酶：從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶：大腸桿菌合成一個典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U（指總反應(yīng)體積為100l時）；濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。132. 2. 引物引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵, PCR

5、產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度；引物濃度引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右；引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb；引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；引物設(shè)計原則：14避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)：避免兩條引物間互補，特別是3端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶；引物3端的堿基應(yīng)嚴格要求配對：特別是最末及倒數(shù)第二個堿基，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗； 引物的熔解溫度（Tm值），指把DNA的雙螺旋

6、結(jié)構(gòu)熱變性過程中紫外吸收值達到最大值的1/2時的溫度。DNA中GC含量越高，Tm值越高，引物對之間的Tm值相差不超過23，經(jīng)驗公式Tm=2(A+T)+4(G+C)，引物的退火溫度通常低于Tm值510；引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性；引物量：每條引物的濃度0.1 0.5M，以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會153. 3. 模板模板模板即DNA片段, 其量的多少及其純度的高低, 是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一u單、雙鏈DNA均可u不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類u對于哺乳動物

7、基因組DNA開說，每個反應(yīng)需要的模板量是1g，對于酵母染色體、細菌染色體和質(zhì)粒等模板的通常用量分別是10ng、1ng、1pg164. dNTP4. dNTPudNTP在溫度較高時容易失活, 因此需要-20下冰凍保存,以保證dNTP的質(zhì)量。u在PCR反應(yīng)中, dNTP濃度應(yīng)為200 250mol/L, 尤其重要的是4種dNTP的體積濃度要相等, 否則就會引起錯配u過低濃度降低PCR產(chǎn)量，過高濃度的dNTP(大于4mmol)可能會淬滅Mg2+，從而抑制PCR反應(yīng)175. 5. 二價陽離子二價陽離子l 通常為Mg2+，Mg2+是DNA聚合酶的激活劑，當(dāng)dNTP濃度為200mol時， Mg2+濃度在1

8、.5mmol/L2.0mmol/L為宜l Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降； Mg2+過高影響反應(yīng)特異性l Mg2+可與負離子結(jié)合，所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度186.6.維持維持pHpH的緩沖液的緩沖液室溫下pH調(diào)到8.38.8的Tris緩沖液常用于PCR反應(yīng)，濃度在10mmol66mmol，當(dāng)72時（延伸溫度），反應(yīng)緩沖液的pH會降到約7.2，緩沖液中加入KCl，可以促進引物的退火19五、五、PCRPCR的類型的類型a. 標準PCRb. 熱啟動PCRc. 反向PCRd. 巢式PCRe. LA PCRf. 不對稱PCRg. RT P

9、CRh. 實時熒光定量PCRi. 多重PCRj. 差異顯示PCRk. 錨定PCRl. 原位PCRm.重組PCRn. 免疫PCR201)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段，對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。 可對未知序列擴增后進行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列；用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA；建立基因組文庫。已知序列21已知序列未知限制酶限制酶限制酶限制酶連接酶222）不對稱PCR 目的：擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法：采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物，其最佳比例一般

10、是0.010.5M，關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。 用途：制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究23 243）多重PCR：在一個反應(yīng)體系中使用一對以上引物的PCR稱為多重PCR。其結(jié)果是產(chǎn)生多個PCR產(chǎn)物，用于檢測特定基因序列的存在或缺失。254）實時定量PCR(real-time PCR):該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針來實現(xiàn)其定量功能的，特定設(shè)計的PCR儀器來實時檢測PCR擴增過程每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積熒光值，可以很好的推算模板的起始濃度26探針設(shè)計一般應(yīng)符合以下條件： 探針長度應(yīng)在2040個堿基左右，保證結(jié)合特異性。 GC堿基含量在40%60%，避免單核苷

11、酸序列的重復(fù)。 避免與引物發(fā)生雜交或重疊。 探針與模板結(jié)合穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5。 另外，探針的濃度、探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對實驗結(jié)果有影響。276 6、PCRPCR反應(yīng)流程反應(yīng)流程1 1、溫度與時間的設(shè)置、溫度與時間的設(shè)置 設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點 標準反應(yīng)中采用三溫度點法三溫度點法，雙鏈DNA在9095變性，再迅速冷卻至4060退火，然后快速升溫至7075延伸， 對于較短靶基因（長度100300bp）可采用二溫二溫度點法度點法， 將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94變性，65左右退火與延伸。28 變性溫

12、度與時間：變性溫度與時間： 一般9394，1min足以使模板變性 若低于93則需延長時間 但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。 退火退火( (復(fù)性復(fù)性) )溫度與時間：溫度與時間： 退火溫度是影響PCR特異性的重要因素 退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基因序列的長度 對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55作為選擇最適退火溫度的起點較為理想在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性29 延伸溫度與時間：延伸溫度與時間： 延伸溫度：一般選擇在7075之間 常用溫度為72 過高的延伸溫度不利于引物和

13、模板的結(jié)合。 延伸反應(yīng)時間：根據(jù)待擴增片段長度而定 1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min（足夠） 34kb的靶序列需34min 擴增10kb需延伸至15min 延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增 對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些302 2、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù) 決定PCR擴增程度 循環(huán)次數(shù) 主要取決于模板DNA的濃度 循環(huán)次數(shù)：選在30次左右 循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多31七、七、PCRPCR產(chǎn)物檢測產(chǎn)物檢測1.瓊脂糖凝膠電泳最常用2.聚丙烯酰胺凝膠電泳3.層析技術(shù) 高效液相色譜（HPLC） 離子交換層析（IEC）4.分子雜交5.限制性內(nèi)切酶酶切分析6.PCR擴增產(chǎn)物的直接測序32八、常見問題分析八、常見問題分析1. 不出現(xiàn)擴增條帶 分析原因：模板、酶失活或污染、引物對的質(zhì)量和濃度、PCR產(chǎn)物電泳檢測時間一般為48h內(nèi)2. 假陽性 分析原因：模板或擴增產(chǎn)物的交叉污染3. 非特異性擴增帶 分析原因：引物與靶序列未完全互補或引物聚合形成二聚體、鎂離子濃度過高、退火溫度過低、酶不合格或酶量過多4. 出現(xiàn)片狀拖尾或涂