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文檔簡介
1、1 PCRPCR技術(shù)詳解技術(shù)詳解2一一二二三三四四五PCRPCR簡史簡史定義定義基本原理基本原理反應(yīng)要素反應(yīng)要素PCRPCR的類型的類型六六PCRPCR反應(yīng)流程反應(yīng)流程目錄八常見常見問題分析問題分析九PCRPCR技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域七PCRPCR產(chǎn)物檢測產(chǎn)物檢測3一、一、PCRPCR簡史簡史 1971年,Khorana提出:經(jīng)過DNA變性,與合適引物雜交,用DNA聚合酶延伸引物,并不斷重復(fù)該過程便可克隆tRNA基因。 但由于測序和引物合成的困難,以及70年代基因工程技術(shù)的發(fā)明使克隆基因成為可能,所以,Khorana的設(shè)想被人們遺忘了4 1985年,美國PE-Cetus公司的Mullis等人
2、發(fā)明了聚合酶鏈反應(yīng)(PCR) 最初采用E-coli DNA聚合酶進行PCR,由于該酶不耐熱,使這一過程耗時,費力,且易出錯,未能推廣 1988年,Saiki等人從嗜熱桿菌(thermus aquaticus)中提出TaqDNA聚合酶,使得PCR技術(shù)得以廣泛應(yīng)用 1993年,Mullis等因此項技術(shù)獲諾貝爾化學(xué)獎5二、定義二、定義 PCR(PCR(聚合酶鏈式反應(yīng))是利用聚合酶鏈式反應(yīng))是利用DNADNA在體外高在體外高溫(溫(9595左右)時左右)時變性變性成單鏈,低溫成單鏈,低溫退火退火(經(jīng)常是(經(jīng)常是6060左右)時引物與單鏈按堿基互補配對原則結(jié)合,左右)時引物與單鏈按堿基互補配對原則結(jié)合,
3、再調(diào)溫度至再調(diào)溫度至DNADNA聚合酶最適反應(yīng)溫度(聚合酶最適反應(yīng)溫度(7272左左右),右),DNADNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖聚合酶沿著磷酸到五碳糖(53)(53)的的方向方向延伸延伸合成互補鏈合成互補鏈6三、基本原理三、基本原理 PCR技術(shù)模擬DNA 的天然復(fù)制過程, 其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物, 該原理主要包括3個基本反應(yīng)過程:模板變性引物退火新鏈延伸71234522557294時間(min)溫度()適溫延伸3高溫變性1低溫退火2重復(fù)13步2530輪目的DNA片段擴增100萬倍以上DNA雙螺旋DNA單鏈與引物復(fù)性DNA變性形成2條單鏈子鏈延伸DNA加倍http:/ n
4、:循環(huán)次數(shù)實際拷貝數(shù)=(1+x)n X:平均效率,約為0.85 n:循環(huán)次數(shù) 11四、反應(yīng)要素四、反應(yīng)要素1.1.熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶2.2.引物引物3.3.模板模板4.4.dNTPdNTP5.5.二價陽離子二價陽離子6.6.維持維持pHpH的緩沖液的緩沖液121.1. 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶聚合酶目前有兩種Taq DNA 聚合酶供應(yīng):天然酶:從棲熱水生桿菌中提純基因工程酶:大腸桿菌合成一個典型的 PCR反應(yīng)約需酶量 2.5U(指總反應(yīng)體積為100l時);濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產(chǎn)物量減少。132. 2. 引物引物引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵, PCR
5、產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度;引物濃度引物長度: 15-30bp,常用為20bp左右;引物擴增跨度: 以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb;引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列;引物設(shè)計原則:14避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu):避免兩條引物間互補,特別是3端的互補,否則會形成引物二聚體,產(chǎn)生非特異的擴增條帶;引物3端的堿基應(yīng)嚴格要求配對:特別是最末及倒數(shù)第二個堿基,以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗; 引物的熔解溫度(Tm值),指把DNA的雙螺旋
6、結(jié)構(gòu)熱變性過程中紫外吸收值達到最大值的1/2時的溫度。DNA中GC含量越高,Tm值越高,引物對之間的Tm值相差不超過23,經(jīng)驗公式Tm=2(A+T)+4(G+C),引物的退火溫度通常低于Tm值510;引物的特異性:引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性;引物量:每條引物的濃度0.1 0.5M,以最低引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會153. 3. 模板模板模板即DNA片段, 其量的多少及其純度的高低, 是PCR成敗與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一u單、雙鏈DNA均可u不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑、DNA結(jié)合蛋白類u對于哺乳動物
7、基因組DNA開說,每個反應(yīng)需要的模板量是1g,對于酵母染色體、細菌染色體和質(zhì)粒等模板的通常用量分別是10ng、1ng、1pg164. dNTP4. dNTPudNTP在溫度較高時容易失活, 因此需要-20下冰凍保存,以保證dNTP的質(zhì)量。u在PCR反應(yīng)中, dNTP濃度應(yīng)為200 250mol/L, 尤其重要的是4種dNTP的體積濃度要相等, 否則就會引起錯配u過低濃度降低PCR產(chǎn)量,過高濃度的dNTP(大于4mmol)可能會淬滅Mg2+,從而抑制PCR反應(yīng)175. 5. 二價陽離子二價陽離子l 通常為Mg2+,Mg2+是DNA聚合酶的激活劑,當(dāng)dNTP濃度為200mol時, Mg2+濃度在1
8、.5mmol/L2.0mmol/L為宜l Mg2+濃度過低會使Taq酶活性喪失、PCR產(chǎn)量下降; Mg2+過高影響反應(yīng)特異性l Mg2+可與負離子結(jié)合,所以反應(yīng)體系中dNTP、EDTA等的濃度影響反應(yīng)中游離的Mg2+濃度186.6.維持維持pHpH的緩沖液的緩沖液室溫下pH調(diào)到8.38.8的Tris緩沖液常用于PCR反應(yīng),濃度在10mmol66mmol,當(dāng)72時(延伸溫度),反應(yīng)緩沖液的pH會降到約7.2,緩沖液中加入KCl,可以促進引物的退火19五、五、PCRPCR的類型的類型a. 標準PCRb. 熱啟動PCRc. 反向PCRd. 巢式PCRe. LA PCRf. 不對稱PCRg. RT P
9、CRh. 實時熒光定量PCRi. 多重PCRj. 差異顯示PCRk. 錨定PCRl. 原位PCRm.重組PCRn. 免疫PCR201)反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互補引物來擴增兩引物以外的DNA片段,對某個已知DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增。 可對未知序列擴增后進行分析,如探索鄰接已知DNA片段的序列;用于僅知部分序列的全長cDNA的克隆,擴增基因文庫的插入DNA;建立基因組文庫。已知序列21已知序列未知限制酶限制酶限制酶限制酶連接酶222)不對稱PCR 目的:擴增產(chǎn)生特異長度的單鏈DNA。 方法:采用兩種不同濃度的引物。分別稱為限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般
10、是0.010.5M,關(guān)鍵是限制性引物的絕對量。 用途:制備核酸序列測定的模板 制備雜交探針 基因組DNA結(jié)構(gòu)功能的研究23 243)多重PCR:在一個反應(yīng)體系中使用一對以上引物的PCR稱為多重PCR。其結(jié)果是產(chǎn)生多個PCR產(chǎn)物,用于檢測特定基因序列的存在或缺失。254)實時定量PCR(real-time PCR):該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針來實現(xiàn)其定量功能的,特定設(shè)計的PCR儀器來實時檢測PCR擴增過程每一輪循環(huán)產(chǎn)物的累積熒光值,可以很好的推算模板的起始濃度26探針設(shè)計一般應(yīng)符合以下條件: 探針長度應(yīng)在2040個堿基左右,保證結(jié)合特異性。 GC堿基含量在40%60%,避免單核苷
11、酸序列的重復(fù)。 避免與引物發(fā)生雜交或重疊。 探針與模板結(jié)合穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度,因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5。 另外,探針的濃度、探針與模板序列的同源性,探針與引物的距離都對實驗結(jié)果有影響。276 6、PCRPCR反應(yīng)流程反應(yīng)流程1 1、溫度與時間的設(shè)置、溫度與時間的設(shè)置 設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點 標準反應(yīng)中采用三溫度點法三溫度點法,雙鏈DNA在9095變性,再迅速冷卻至4060退火,然后快速升溫至7075延伸, 對于較短靶基因(長度100300bp)可采用二溫二溫度點法度點法, 將退火與延伸溫度合二為一,一般采用94變性,65左右退火與延伸。28 變性溫
12、度與時間:變性溫度與時間: 一般9394,1min足以使模板變性 若低于93則需延長時間 但溫度不能過高,因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。 退火退火( (復(fù)性復(fù)性) )溫度與時間:溫度與時間: 退火溫度是影響PCR特異性的重要因素 退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基因序列的長度 對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55作為選擇最適退火溫度的起點較為理想在Tm值允許范圍內(nèi),選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,提高PCR反應(yīng)的特異性29 延伸溫度與時間:延伸溫度與時間: 延伸溫度:一般選擇在7075之間 常用溫度為72 過高的延伸溫度不利于引物和
13、模板的結(jié)合。 延伸反應(yīng)時間:根據(jù)待擴增片段長度而定 1Kb以內(nèi)的DNA片段,延伸時間1min(足夠) 34kb的靶序列需34min 擴增10kb需延伸至15min 延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴增 對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些302 2、循環(huán)次數(shù)、循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù) 決定PCR擴增程度 循環(huán)次數(shù) 主要取決于模板DNA的濃度 循環(huán)次數(shù):選在30次左右 循環(huán)次數(shù)越多,非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多31七、七、PCRPCR產(chǎn)物檢測產(chǎn)物檢測1.瓊脂糖凝膠電泳最常用2.聚丙烯酰胺凝膠電泳3.層析技術(shù) 高效液相色譜(HPLC) 離子交換層析(IEC)4.分子雜交5.限制性內(nèi)切酶酶切分析6.PCR擴增產(chǎn)物的直接測序32八、常見問題分析八、常見問題分析1. 不出現(xiàn)擴增條帶 分析原因:模板、酶失活或污染、引物對的質(zhì)量和濃度、PCR產(chǎn)物電泳檢測時間一般為48h內(nèi)2. 假陽性 分析原因:模板或擴增產(chǎn)物的交叉污染3. 非特異性擴增帶 分析原因:引物與靶序列未完全互補或引物聚合形成二聚體、鎂離子濃度過高、退火溫度過低、酶不合格或酶量過多4. 出現(xiàn)片狀拖尾或涂
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