湖南農(nóng)業(yè)大學生物化學-03-蛋白質(zhì)化學-01-氨基酸

1、 第二章蛋白質(zhì)化學 本章內(nèi)容第一節(jié) 蛋白質(zhì)的建筑構(gòu)件氨基酸第二節(jié) 蛋白質(zhì)的共價結(jié)構(gòu)第三節(jié) 蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)第四節(jié) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系第五節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)第六節(jié) 蛋白質(zhì)分離與純化技術(shù) 第一節(jié) 蛋白質(zhì)的建筑構(gòu)件氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)二、氨基酸的酸堿化學三、氨基酸的光學性質(zhì)四、氨基酸的重要化學反應 第一節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的元素組成n元素組成：均含C、H、O、N、S。少量含P、Se、Fe、Cu、Zn、Mn、Co 、Mo。個別含 In特點：含N元素。并且N元素的含量相對穩(wěn)定，約16%，每克氮相當6.25克蛋白質(zhì)。100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 = 每克樣品含氮克數(shù) 6.251

2、00 第一節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的水解生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的氨基酸有180多種，組成蛋白質(zhì)分子的氨基酸只有20種。人類是如何知道數(shù)以萬計的蛋白質(zhì)僅由20種常見氨基酸構(gòu)成的呢？蛋白質(zhì)水解后,可得到20種L型的氨基酸u根據(jù)水解程度可分為:(1)完全水解：徹底水解-得到的水解產(chǎn)物是各種AA的混合物。(2)部分水解（不完全水解）: 得到的產(chǎn)物是各種大小不等的肽段和氨基酸混合物。u有三種水解方法：酸，堿，酶 第一節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的水解1.酸水解n方法：6 mol/L HCl或 4 mol/L H2SO4回流煮沸20hr。n產(chǎn)物：L-氨基酸混合物，Trp完全被破壞，部分Ser和T

3、hr(含-OH)被分解，Gln和Asn的酰胺基被水解掉而分別成為Glu和Asp 。n優(yōu)點：不引起消旋。 第一節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的水解2. 堿水解n方法：用2 moL/L Ba(OH)2或5 mol/L NaOH,回流10-20hr。n產(chǎn)物：多數(shù)氨基酸遭到不同程度的破壞，且水解產(chǎn)物是D型和L型氨基酸的混合物（稱消旋物）, 要制備L-氨基酸一般不采用堿水解。n優(yōu)點：色氨酸是穩(wěn)定的，堿水解是酸水解的補充，由堿水解可知蛋白質(zhì)中Trp含量。 第一節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的水解3. 酶水解n常用酶：胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶。n產(chǎn)物：小的肽段，不消旋，不破壞氨基酸結(jié)構(gòu)，適用

4、于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)分析。n缺點：所需時間較長,部分水解。 第一節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)L型氨基酸共同特點：氨基（或脯氨酸的亞氨基）連接在與羧基相連的碳原子上，碳原子為不對稱碳原子（甘氨酸除外），不同的氨基酸其側(cè)鏈R各異。654321CH2 CH2 CH2 CH2COO-CH+NH3+NH3賴氨酸 一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)（一）、根據(jù)側(cè)鏈（R）基團極性分類（二）、根據(jù)側(cè)鏈（ R）基團化學結(jié)構(gòu)分類（三）、根據(jù)營養(yǎng)學分類（四）、稀有蛋白質(zhì)氨基酸與非蛋白質(zhì)氨基酸 第一節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)（一）、根據(jù)側(cè)鏈（R）基團極性分類1.非極性疏水性氨基酸（8種）2.極性中性氨基酸

5、（7種）3.酸性氨基酸（2種）4.堿性氨基酸（3種）極性氨基酸帶電氨基酸 等電點pI值1.非極性疏水性氨基酸 2.極性中性氨基酸等電點pI值 3.酸性氨基酸4.堿性氨基酸天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22賴氨酸lysineLys K 9.74Arg R 10.76精氨酸 arginine組氨酸 histidineHis H 7.59 第一節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)（二）、根據(jù)側(cè)鏈（ R）基團化學結(jié)構(gòu)分類1、脂肪族15 （中性5、含羥基或巰基4、酸性4、堿性2）2、雜環(huán)（His，Pro。Pro沒有-NH2，是-亞

6、氨基酸）3、芳香族（Phe，Tyr，Trp） 第一節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)（三）、根據(jù)營養(yǎng)學分類Lys Trp Phe ValMet Leu Ile Thr1、必需氨基酸Arg His2、非必需氨基酸 第一節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)（四）、稀有蛋白質(zhì)氨基酸與非蛋白質(zhì)氨基酸稀有的蛋白質(zhì)氨基酸：蛋白質(zhì)組成中，除上述20種常見氨基酸外，從少數(shù)蛋白質(zhì)中還分離出一些稀有氨基酸，它們都是相應常見氨基酸的衍生物。如 胱氨酸、4-羥脯氨酸、5-羥賴氨酸等。非蛋白質(zhì)氨基酸：1、不是蛋白質(zhì)的組成成分2、以游離或結(jié)合的形式存在于生物界3、大都是常見氨基酸的衍生物4、有些是-, - , -, 和D-型氨基酸

7、5、一些是代謝中間產(chǎn)物，如瓜氨酸、鳥氨酸； -氨基丁酸等 第一節(jié)氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)稀有的蛋白質(zhì)氨基酸 第一節(jié) 蛋白質(zhì)的建筑構(gòu)件氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)二、氨基酸的酸堿化學三、氨基酸的光學性質(zhì)四、氨基酸的重要化學反應 第一節(jié)氨基酸二、氨基酸的酸堿化學二、氨基酸的酸堿化學1、氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點（pI）2、不同類型氨基酸的滴定曲線及等電點計算 氨基酸中有多種可以接受或者釋放質(zhì)子的基團pKa值越小，質(zhì)子越容易釋放組氨酸是唯一具有近中性pka的基團（咪唑）的氨基酸a-羧基或者a-氨基的pKa都比側(cè)鏈基團上面者低（較容易離解）蛋白質(zhì)氨基酸基團pKa會受蛋白質(zhì)微環(huán)境的影響而改變 第一

8、節(jié)氨基酸二、氨基酸的酸堿化學1、氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點RRR H+- H+CH NH3COOH+CH NH3COO+CH NH2COO+ H+ H+Ka1Ka2兼性離子(A0)陰離子(A )-陽離子(A )+解離常數(shù) Ka1 = A0H +Ka2 = A-H +A0A+pH = pK + log質(zhì)子受體亨德森-哈塞爾巴爾赫方程 質(zhì)子供體a 第一節(jié)氨基酸二、氨基酸的酸堿化學1、氨基酸的兩性解離性質(zhì)及等電點RRR H+- H+CH NH3COOH+CH NH3COO+CH NH2COO+ H+ H+凈電荷為正凈電荷=0pH = pI凈電荷為負(pKa2)(p a1)pH pI當氨基酸溶液在某

9、一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此時溶液的pH值即為該氨基酸的 等電點（isoeletricpoint，pI）。 第一節(jié)氨基酸二、氨基酸的酸堿化學2、氨基酸的滴定曲線及等電點計算1） 中性氨基酸2） 酸性氨基酸3） 堿性氨基酸 第一節(jié)氨基酸二、氨基酸的酸堿化學1）中性氨基酸滴定曲線甘氨酸鹽酸鹽（A ） 等電甘氨酸（A ） 甘氨酸鈉（A）+ 0 -AA0 = A-pKa2=9.60pI = 5.97pHA+ = A0BpKa1=2.34H+ mol 數(shù)OH- mol 數(shù)中性氨基酸（一氨基一羧基）等電點的計算：pI = （pKa1

10、 + pKa2） 第一節(jié)氨基酸二、氨基酸的酸堿化學甘氨酸鹽酸鹽（A ） 等電甘氨酸（A ） 甘氨酸鈉（A）+ 0 -Ka1Ka2Ka1 = A0H += A-H +A0Ka2解離常數(shù)A+兩式相乘等電點時兩邊取對數(shù)A+ = A-所以pKa1 + pKa2 = 2pIpI = 1pKa1 + pKa2整理即pI是氨基酸 pKa1和pKa2的平均值。2pI = 1pKa1 + pKa2 = 1 (2.34 + 9.62) = 5.97Gly的等電點22 第一節(jié)氨基酸二、氨基酸的酸堿化學2）酸性氨基酸滴定曲線A+A0A-A2-pKa1pKa2pKa32.194.259.67ABCpKa3酸性氨基酸（一

11、氨基二羧基）等電點的計算：pHpKa2pI = （pKa1 + pKa2）pKa1pI加入的OH- mol 數(shù) 第一節(jié)氨基酸二、氨基酸的酸堿化學3）堿性氨基酸滴定曲線A2+A+A0A-pKa1pKa2pKa32.188.9510.53pKa3pKa2堿性氨基酸（二氨基一羧基）等電點的計算：pHpI = （pKa2 + pKa3）pKa1pI加入的OH- mol 數(shù) 第一節(jié)氨基酸三、氨基酸的光學性質(zhì)第一節(jié) 蛋白質(zhì)的建筑構(gòu)件氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)二、氨基酸的酸堿化學三、氨基酸的光學性質(zhì)四、氨基酸的重要化學反應 第一節(jié)氨基酸三、氨基酸的光學性質(zhì)三、氨基酸的光學性質(zhì)1、氨基酸的光學活性與立體化學

12、2、氨基酸的紫外吸收光譜 第一節(jié)氨基酸三、氨基酸的光學性質(zhì)1、氨基酸的光學活性與立體化學除甘氨酸外，所有天然-氨基酸都有不對稱碳原子，因此所有天然氨基酸都具有旋光性。L-甘油醛L-丙氨酸D-甘油醛D-丙氨酸蛋白質(zhì)經(jīng)酸水解或酶促水解得到的都是L-型氨基酸 ！ 第一節(jié)氨基酸三、氨基酸的光學性質(zhì)含有兩個不對稱碳原子的氨基酸蘇氨酸、異亮氨酸、羥脯氨酸和羥賴氨酸，除了a-碳原子是一個不對稱碳原子外，還有第二個不對稱碳原子。a*L-蘇氨酸D-蘇氨酸L-別蘇氨酸D-別蘇氨酸因此，在實驗室中可以存在4種光學異構(gòu)體，它們分別稱為L-，D-，L-別-（L-allo-）和D-別（D-allo-）氨基酸。在蛋白質(zhì)中只

13、發(fā)現(xiàn)了 L-蘇氨酸。 第一節(jié)氨基酸三、氨基酸的光學性質(zhì)2、氨基酸的紫外吸收光譜參與組成蛋白質(zhì)的 20多種氨基酸在可見光區(qū)都沒有光吸收，在紅外區(qū)和遠紫外區(qū)（l 200 nm）都有光吸收。在近紫外區(qū)（200 400 nm）只有芳香族氨基酸有吸收光的能力。4000020000100005000蛋白質(zhì)由于含有這些摩Trp：lmax = 280 nm爾吸收系數(shù)e芳香族氨基酸，所以在近紫外區(qū)也有光吸收，最大吸收波長一般為 280nm，該性質(zhì)可以用于蛋白質(zhì)的定量分析。2000Tyr：lmax= 275 nm100050020010050Phe：lmax= 257 nm2010200 220 240 260

14、280 300 320波長（nm）A=eclLambert-Beer定律 第一節(jié) 蛋白質(zhì)的建筑構(gòu)件氨基酸一、氨基酸的分類與結(jié)構(gòu)二、氨基酸的酸堿化學三、氨基酸的光學性質(zhì)四、氨基酸的重要化學反應 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應四、氨基酸的重要化學反應1、a -氨基參加的反應2、a -羧基參加的反應3、a -氨基與a -羧基共同參加的反應4、側(cè)鏈 R基參加的反應 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應1、a -氨基參加的反應1） 與亞硝酸的反應2） 與?；噭┑姆磻?） 烴基化反應 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應1 ）與亞硝酸的反應氨基酸的a-氨基能夠在室溫下與亞硝酸發(fā)生反應，釋放出氮氣。

15、通過測定標準條件下N2的體積，可以計算出氨基酸的量。用途：氨基酸的定量分析、蛋白質(zhì)水解程度的測定。注意事項：1、生成的N2中，只有一半是來自于氨基酸；2、賴氨酸的側(cè)鏈-NH2同樣可以發(fā)生該反應，但反應速度比a-氨基慢得多。 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應2 ）與?；噭┑姆磻被岬陌被c酰氯或酸酐在弱堿溶液中發(fā)生作用時，氨基被?；COOHOH O COOHHCOOHO在弱堿中H+ CH2 O C Cl CH2 H O N C CH ClN CH CH O C N CH2HClRRR芐氧（苯甲氧）甲酰氯其他重要的?；噭?第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應其他重要的?；噭┦宥⊙?/p>

16、甲酰氯對甲苯磺酰氯鄰苯二甲酸酐用途：多肽、蛋白質(zhì)的人工合成中用于保護氨基。DNS反應丹磺酰氯DansylChloride用途：多肽鏈N-末端氨基酸的標記、微量氨基酸的定量測定。5-二甲基氨基萘-1-磺酰氯 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應3 ）烴基化反應與2,4 二硝基氟苯（DNFB）的反應與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應與二硝基氟苯的反應（sanger反應）氨基酸氨基的一個 H原子可以被烴基（包括環(huán)烴及其衍生物）所取代。例如：與2,4 二硝基氟苯在弱堿性溶液中發(fā)生親核芳環(huán)取代反應，生成二硝基苯基氨基酸（簡稱 DNP 氨基酸）。HCOOHHCOOH在弱

17、堿中O2N FNO2H N CHRO2N N CHHFRNO22,4 二硝基氟苯（DNFB）DNP 氨基酸（黃色化合物）用途：英國的Sanger首先利用該反應鑒定多肽或蛋白質(zhì)的N末端氨基酸。 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應與異硫氰酸苯酯的反應（Edman反應）氨基酸的a-氨基與異硫氰酸苯酯（PITC）在弱堿性條件下反應，生成相應的苯氨基硫甲酰衍生物（PTC-氨基酸）；后者在硝基甲烷中與酸（如三氟乙酸）作用而環(huán)化，生成相應的苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTH-氨基酸）。HHOHCOOHNCONCCO在弱堿中H +NCSH N CHRSCCHSCHCH3NO2NHNHRR異硫氰酸苯酯苯氨基硫甲酰衍生

18、物苯乙內(nèi)酰硫脲衍生物（PTC-氨基酸）（PTH-氨基酸）用途：Edman將該反應用于鑒定多肽或蛋白質(zhì)的 N端氨基酸，是 N端蛋白質(zhì)序列分析的化學基礎(chǔ)。 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應2、a 羧基參加的反應1） 成鹽和成酯反應2） 成酰氯反應3） 疊氮反應 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應成鹽和成酯反應氨基酸與堿作用生成鹽，如與NaOH反應得到氨基酸鈉鹽。氨基酸的羧基被醇酯化后，形成相應的酯。NH2+ NH3 Cl干燥，HClR CH COOHC2H5OHR CH COOC2H5H2O回流當氨基酸的羧基變成甲酯、乙酯或者鈉鹽后，羧基的化學反應性能被掩蓋，或者說羧基被保護，而氨基的化學反

19、應性能得到加強，或者說氨基被活化，更容易和?；?、烴基結(jié)合。這就是為什么氨基酸的酰基化或烴基化需要在堿性溶液中進行的原因。 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應成酰氯反應用適當?shù)谋Ｗo基（如芐氧甲?；被岬陌被Ｗo后，其羧基可以與五氯化磷或二氯亞砜作用形成酰氯。NH 保護基NH 保護基R CH COOHPCl5R CH COOClPOCl3HCl該反應可以使氨基酸的羧基得到活化，使其更容易與另一氨基酸的氨基結(jié)合，因此，經(jīng)常用于多肽的人工合成。 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應疊氮反應氨基酸的氨基通過?；右员Ｗo，羧基經(jīng)過酯化轉(zhuǎn)變?yōu)榧柞ズ?，可以按順序與肼、亞硝酸反應，變?yōu)榀B氮化合物。YNH

20、OYNHOYNHO2NH NH2HNO2+R CH C OCH3R CH C NHNH2R CH C N N N?；被峒柞ヵ；被狨ｋ迈；被岑B氮2H2O該反應使得氨基酸的羧基得以活化，因此，常用于多肽的人工合成。 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應3、a -氨基與羧基共同參加的反應1） 與茚三酮的反應2） 成肽反應 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應與茚三酮的反應NH2R CH COOHRCHO CO2NH3水合茚三酮還原型茚三酮2NH32H2O還原型茚三酮茚三酮藍紫色復合物兩個亞氨基酸，脯氨酸和羥脯氨酸與茚三酮反應時，不產(chǎn)生氨，而是直接形成亮黃色（lmax = 440 nm）化合物。（多肽、蛋白質(zhì)也有此反應） 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應成肽反應乙二醇，D2H2O甘氨酸甘氨酸二酮吡嗪 氨基酸在蛋白質(zhì)分子中的連接肽鍵：-羧基-氨基脫水縮合肽：氨基酸通過肽鍵連接形成的化合物。四肽：AlaTyrAspGly 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應4、側(cè)鏈 R 基參加的反應能夠參與化學反應的氨基酸側(cè)鏈R基包括：1） 酪氨酸的側(cè)鏈酚基；2） 組氨酸的側(cè)鏈咪唑基；3） 精氨酸的側(cè)鏈胍基；4） 色氨酸的側(cè)鏈吲哚基；5） 甲硫氨酸的側(cè)鏈甲硫基；6） 半胱氨酸的側(cè)鏈巰基。 第一節(jié)氨基酸四、氨基酸的重要化學反應半胱氨酸側(cè)鏈巰基的反應1） 二硫鍵的形成2R SH + O2