超順磁氧化鐵納米顆粒標(biāo)記人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞及體外MRI成像

1、www.CRTER.org竇文廣，等. 超順磁氧化鐵納米顆粒標(biāo)記人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞及體外MRI成像超順磁氧化鐵納米顆粒標(biāo)記人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞及體外MRI成像竇文廣，岳軍艷，胡 瑩，吳清武，陳 杰(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放射科，河南省新鄉(xiāng)市 453100)引用本文：竇文廣，岳軍艷，胡瑩，吳清武，陳杰. 超順磁氧化鐵納米顆粒標(biāo)記人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞及體外MRI成像J.中國(guó)組織工程研究，2016，20(45):6821-6826.DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.020 ORCID: 0000-0003-0465

2、-0900(竇文廣)文章快速閱讀：人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞的體外磁標(biāo)記及MRI成像竇文廣，男，1963年生，河南省輝縣市人，漢族，1985年新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院畢業(yè)，副主任醫(yī)師，主要從事消化系統(tǒng)病變研究。中圖分類號(hào):R394.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B文章編號(hào):2095-4344(2016)45-06821-06稿件接受：2016-08-10骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及向神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化 在體外超順磁性氧化鐵能夠高效標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞，經(jīng)hTERT基因修飾后能夠穩(wěn)定表達(dá)hTERT基因，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)(1)4.7T MR掃描(2)流式細(xì)胞儀、MTT法檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖能力(3)RT-PCR和Wes

3、tern blot檢測(cè)hTERT基因和蛋白的表達(dá)pcDNA3-hTERT 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞文題釋義：人端粒酶：是一種核糖核蛋白復(fù)合物，由人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶、人端粒酶RNA組分以及人端粒酶相關(guān)蛋白組成。端粒酶利用其自身人端粒酶RNA組分所攜帶的RNA為模板，在人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的反轉(zhuǎn)錄催化下，將端粒重復(fù)序列合成到染色體末端，延長(zhǎng)或穩(wěn)定了隨著細(xì)胞分裂而進(jìn)行性縮短的端粒，在細(xì)胞永生化及惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到了重要的作用。超順磁氧化鐵納米顆粒：是一種組織特異性MRI對(duì)比劑，多以葡聚糖等包裹氧化鐵顆粒而得到，直徑一般在納米級(jí)，理化性質(zhì)穩(wěn)定，超順磁氧化鐵納米顆粒分布于組織后，擾

4、亂了內(nèi)部磁場(chǎng)，引起質(zhì)子自旋快速失相位，從而縮短了組織的T2值和T1值(對(duì)T2更明顯)，在MRI上表現(xiàn)低信號(hào)影。摘要背景：細(xì)胞標(biāo)記與體外MRI成像聯(lián)合，可無創(chuàng)性活體標(biāo)記移植的神經(jīng)干細(xì)胞存在部位、存在方式及其一些生物學(xué)特性。目的：探討超順磁氧化鐵納米顆粒(SPIO)標(biāo)記對(duì)人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)基因修飾神經(jīng)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及標(biāo)記后MR成像效果。方法：體外培養(yǎng)大鼠骨髓來源的神經(jīng)干細(xì)胞，將其分為正常神經(jīng)干細(xì)胞組、SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組、SPIO標(biāo)記空載病毒組及SPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組。采用電穿孔法將pcDNA3-hTERT 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至神經(jīng)干細(xì)胞，并進(jìn)行SPIO標(biāo)記，當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)

5、記成功后即行4.7T MR掃描，流式細(xì)胞儀、MTT法檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖能力，RT-PCR和Western blot檢測(cè)hTERT基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果與結(jié)論：普魯士藍(lán)染色顯示SPIO對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記率為97%；MRI成像顯示，與正常神經(jīng)干細(xì)胞組相比，SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組的T2及T2*弛豫時(shí)間均顯著下降，相應(yīng)的弛豫率則顯著升高(P < 0.01)；與正常神經(jīng)干細(xì)胞比較，SPIO標(biāo)記的3組神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力相比明顯增強(qiáng)，處于G0-G1及S期的比例明顯增多；與SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組、SPIO標(biāo)記空載病毒組比較，SPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組hTERT mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯增強(qiáng)；

6、結(jié)果表明，在體外超順磁性氧化鐵能夠高效標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞，經(jīng)hTERT基因修飾后能夠穩(wěn)定表達(dá)hTERT基因，細(xì)胞增殖能力顯著增強(qiáng)，4.7T MR儀能夠?qū)?biāo)記后的細(xì)胞有效進(jìn)行體外成像。關(guān)鍵詞：干細(xì)胞；培養(yǎng)；神經(jīng)干細(xì)胞；氧化鐵標(biāo)記；超順磁性氧化鐵粒子；hTERT；基因修飾；磁共振成像主題詞：神經(jīng)干細(xì)胞；端粒，末端轉(zhuǎn)移酶；生物，基因修飾；組織工程3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083縮略語(yǔ)：超順磁氧化鐵納米顆粒：super paramagnetic iron oxide，SPIO；人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶：human telomerase reverse transc

7、riptase，hTERTNeural stem cells modified by human telomerase reverse transcriptase gene: superparamagnetic iron oxide labeling and in vitro MRI imagingDou Wen-guang, Yue Jun-yan, Hu Ying, Wu Qing-wu, Chen Jie (Department of Radiology, First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang

8、 453100, Henan Province, China)AbstractBACKGROUND: Cell labeling in combination with in vitro MRI imaging can be used to noninvasively label transplanted neural stem cells (NSCs), thereby exhibiting the existing site, existing way and some biological properties of the cells.OBJECTIVE: To investigate

9、 the effect of superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles on the biological characteristics of NSCs modified by human telomerase reverse transcriptase (hTERT) gene and explore the changes of MRI after labeling in vitro.METHODS: NSCs from rat bone marrow were cultured in vitro, and then were d

10、ivided into normal NSCs group, control group (SPIO-labeled NSCs), negative control group (SPIO group) and hTERT transfection group (SPIO-labeled NSCs transfection group). Using electropration method, pcDNA3-hTERT recombinant plasmids were transfected into NSCs, followed by SPIO labeling. Afterwards,

11、 4.7T MRI imaging was used to scan SPIO-labeled NSCs. Cell cycle and proliferation were detected using flow cytometry and MTT assay, respectively. Expression of hTERT at protein and gene levels was detected using RT-PCR and western blot.RESULTS AND CONCLUSION: Prussian blue staining showed 97% of NS

12、Cs were labeled by SPIO. MRI results showed that compared with the normal NSCs group, T2 and T2* relaxation time was significantly declined in the control group, and the corresponding relaxation rate was significantly increased (P < 0.01). Compared with the normal NSCs group, SPIO-labeled cells i

13、n the other three groups showed stronger proliferation ability, and exhibited a cell cycle rest in G0-G1 and S stages. RT-PCR and western blot results showed that mRNA and protein expressions of hTERT were significantly higher in the hTERT transfection group than the control and negative control gro

14、ups. These findings indicate that in vitro SPIO can efficiently label NSCs, and SPIO-labeled NSCs under hTERT modification can stably express hTERT gene and strengthen the proliferation ability. Additionally, 4.7T MR is effective for in vitro imaging of labeled cells.Subject headings: Neural Stem Ce

15、lls; Telomerase; Organisms, Genetically Modified; Tissue EngineeringCite this article: Dou WG, Yue JY, Hu Y, Wu QW, Chen J. Neural stem cells modified by human telomerase reverse transcriptase gene: superparamagnetic iron oxide labeling and in vitro MRI imaging. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016

16、;20(45):6821-6826.Dou Wen-guang, Associate chief physician, Department of Radiology, First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical University, Xinxiang 453100, Henan Province, China6823ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction一直以來神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞及骨骼肌細(xì)胞被稱為不可再生的細(xì)胞，一旦損傷不能通過細(xì)胞再生來達(dá)到修復(fù)目的。隨著干細(xì)胞研究

17、的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)神經(jīng)干細(xì)胞可以在特定條件下分化成為神經(jīng)元起到神經(jīng)修復(fù)作用，這為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療提供了新的思路1-3。目前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)研究中將其應(yīng)用于各種神經(jīng)退行性疾病的治療并且取得了令人矚目的成績(jī)4-5。隨著干細(xì)胞相關(guān)研究越來越多，細(xì)胞標(biāo)記及示蹤技術(shù)逐步走進(jìn)臨床研究，成為干細(xì)胞研究的熱點(diǎn)之一6。超順磁氧化鐵納米顆粒(super paramagnetic iron oxide，SPIO)是一種新型的MRI特異性示蹤劑，它理化性質(zhì)穩(wěn)定，相對(duì)分子質(zhì)量小，可標(biāo)記不同組織來源的干細(xì)胞，且對(duì)細(xì)胞本身的增殖、分化無明顯影響7-8，其在組織中分布后可以導(dǎo)致內(nèi)部磁場(chǎng)改變，在MRI上表現(xiàn)為低信號(hào)，因此可以通過M

18、RI監(jiān)測(cè)SPIO標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞的分布及生存情況9-10，其最大優(yōu)點(diǎn)為無創(chuàng)性。實(shí)驗(yàn)旨在應(yīng)用SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞，探討人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)的基因修飾效果及體外MRI成像改變。1 材料和方法 Materials and methods 1.1 設(shè)計(jì) 隨機(jī)分組對(duì)照觀察。1.2 時(shí)間及地點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)于2014年2月至2015年8月在河南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。1.3 材料1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，四五周齡，體質(zhì)量200-250 g，購(gòu)于河南醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2

19、005-0008。1.3.2 主要試劑 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Invitrogen公司)，LipofectamineTM 2000(Invitrogen公司)，SPIO (Magnetics公司)，陽(yáng)離子脂質(zhì)體LipofectamineTM Reagent(Invitrogen公司)，MTT溶液(森貝伽生物公司)，PCR試劑盒(森貝伽生物公司)。1.4 方法1.4.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及向神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化 大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉處死，皮膚消毒，無菌條件下取出雙側(cè)股骨及脛骨置于培養(yǎng)皿中，用剪刀將兩側(cè)骨骺端剪去，暴露出骨髓腔，用含無血清DMEM培養(yǎng)基注射器反復(fù)多次沖洗骨髓腔，收集沖洗

20、液，按21的比例加入淋巴細(xì)胞分離液，2 500 r/min離心15 min，吸取交界層的有核細(xì)胞，接種在培養(yǎng)瓶中，加入適量神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基，置于37 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每?jī)扇旄鼡Q1次培養(yǎng)液。通過與0.25% trypsin孵育使細(xì)胞脫落。細(xì)胞經(jīng)兩三次傳代后，收集細(xì)胞懸液備用11。1.4.2 pcDNA3-hTERT基因重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞 選擇第3代骨髓來源神經(jīng)干細(xì)胞，采用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染hTERT基因，整個(gè)操作過程嚴(yán)格按照LipofectamineTM 2000說明書進(jìn)行，轉(zhuǎn)染24 h后，接種到6孔板中，接加入新鮮的完全培養(yǎng)基，次日更換培養(yǎng)液，加入含400 mg/L G418的篩選培養(yǎng)基

21、培養(yǎng)6 d，再更換含200 mg/L G418培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，14 d后可觀察到陽(yáng)性克隆形成，從中挑選單個(gè)克隆繼續(xù)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)及傳代12。1.4.3 實(shí)驗(yàn)分組 將體外培養(yǎng)大鼠骨髓來源的神經(jīng)干細(xì)胞分為4組：正常神經(jīng)干細(xì)胞組、SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組、SPIO標(biāo)記空載病毒組及SPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組。1.4.4 SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞 將50 mg/L的SPIO加入到無血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液中，在振蕩器上進(jìn)行漩渦振蕩45 min，然后向其中加入陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine，配制成超順磁性氧化鐵轉(zhuǎn)染介質(zhì)復(fù)合物，加入神經(jīng)干細(xì)胞，輕輕吹打細(xì)胞呈懸浮狀態(tài)，置于37 培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h

22、后加入胰酶進(jìn)行消化，1 600 r/min離心5 min，棄上清液，加入PBS吹打細(xì)胞至懸浮狀態(tài)待用13。1.4.5 體外標(biāo)記后MRI成像 當(dāng)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)記成功后即行4.7T MR掃描，其掃描序列包括T1WI、T2 WI及T2* WI 3種。測(cè)量T2弛豫時(shí)間時(shí)采用多回波快速自旋回波序列成像，其TE依次為20，40，60，80，100，120 ms。測(cè)量T2*弛豫時(shí)間時(shí)采用多回波梯度回波序列成像，其TE依次為4，14，24，34，44，54 ms。通過MR成像來比較不同序列上標(biāo)記細(xì)胞與未標(biāo)記細(xì)胞的信號(hào)強(qiáng)度及其變化。1.4.6 普魯士藍(lán)染色 取適量標(biāo)記和未標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先用多聚賴氨

23、酸處理過的24孔培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后，用40 g/L多聚甲醛固定30 min，PBS洗滌3次，加入含2%亞鐵氰化鉀的6%鹽酸溶液孵育30 min，PBS洗滌3次，用中性紅溶液復(fù)染15-30 s，單蒸水沖洗，光鏡下觀察陽(yáng)性結(jié)果為：核呈紅色，F(xiàn)e3+呈藍(lán)色14。1.4.7 流式細(xì)胞儀及MTT法檢測(cè)細(xì)胞周期、增殖情況 取傳代后第1天及第6天的細(xì)胞，PBS沖洗2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清液，加入PBS吹打成細(xì)胞懸液，加入體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定30 min，PBS沖洗，再次離心，加入1 mL DNA染液染色30 min，過300目尼龍濾網(wǎng)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。 將生長(zhǎng)良好的

24、神經(jīng)干細(xì)胞懸液接種在96孔培養(yǎng)板上，從接種的第2天開始，每天隨機(jī)選取1塊培養(yǎng)板，加入20 L MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液，加入200 L二甲基亞砜，振蕩混勻，充分溶解結(jié)晶物，酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度值，連續(xù)檢測(cè)5 d，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線14。1.4.8 RT-PCR檢測(cè)hTERT mRNA表達(dá)15 收集各組神經(jīng)干細(xì)胞，利用Trizol提取細(xì)胞的總RNA，使用紫外分光光度儀測(cè)定RNA含量，RT-PCR反應(yīng)按照試劑盒說明書進(jìn)行。hTERT上游引物：5-GCA GCG CTG CGT CCT GCT GC

25、G CAC GT-3，下游引物：3-AGG ACC GGT GGG CCC GTA CCT-5；-actin上游引物：5-TAT CGG ACG CCT GGT TAC-3，下游引物：5-CTC AGC CTT GAC TGT GCC -3，用Gel-Doc1000凝膠成像系統(tǒng)掃描，Molecular Analyst圖像分析軟件檢測(cè)條帶吸光度，計(jì)算hTERT與-actin的相對(duì)吸光度值。1.4.9 Western blot 檢測(cè)hTERT蛋白的表達(dá) 收集各組神經(jīng)干細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS沖洗，加入蛋白裂解液進(jìn)行細(xì)胞裂解，提取出總蛋白50 g，常規(guī)行SDS-PAGE電脈及蛋白電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜

26、用5%脫脂奶粉溶液4 封閉過夜，TBST洗膜3次，滴加相應(yīng)的一抗稀釋液，37 溫育1 h，TBST漂洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗，37 溫育1 h，TBST漂洗3次，取等量的ECL發(fā)光試劑A，B混勻液均勻加到膜的表面，室溫孵育5 min，放到暗盒后顯影，以-actin為內(nèi)參照16。1.5 主要觀察指標(biāo) SPIO對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記率；MR成像檢測(cè)結(jié)果；神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞周期；神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力；hTERT mRNA及蛋白的表達(dá)。1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)用±s表示，應(yīng)用SPSS 10.0軟件對(duì)所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P < 0.05

27、為差異有顯著性意義。2 結(jié)果 Results 2.1 骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài) 接種24 h內(nèi)，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)呈圓形，懸浮生長(zhǎng)(圖1A)；4-6 d后可見貼壁細(xì)胞明顯增加，細(xì)胞形態(tài)由圓形逐漸變成梭形；兩三次傳代后，細(xì)胞形態(tài)趨向一致，大部分呈梭形，伴長(zhǎng)軸突樣纖維生長(zhǎng)，選取第3代神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(圖1B)。2.2 普魯士藍(lán)染色觀察神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記率 標(biāo)記后的細(xì)胞胞漿內(nèi)有藍(lán)染鐵顆粒(圖2)，未經(jīng)標(biāo)記的細(xì)胞胞漿內(nèi)無藍(lán)染顆粒存在，SPIO對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記率為97%。2.3 MR成像檢測(cè)結(jié)果 采用4.7 T磁共振成像，掃描序列包括T1WI、T2WI及T2* WI 3種，與未標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞相比，

28、標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞在T2WI序列的信號(hào)強(qiáng)度平均下降50.66%，而在T2* WI序列上二者的信號(hào)強(qiáng)度相比平均下降53.70%，T2WI序列與T2* WI序列相比后者的信號(hào)強(qiáng)度變化明顯。未標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞和標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞的T2弛豫時(shí)間分別為510 ms及76 ms，其弛豫率R2(1/T2)分別為1.94 s-1及12.98 s-1，T2*弛豫時(shí)間分別為109.0、22.9 ms，其弛豫率R2*(1/T2*)分別為9.17 s-1、43.67 s-1，由以上結(jié)果可見標(biāo)記細(xì)胞的T2及T2*弛豫時(shí)間均顯著下降，相應(yīng)的弛豫率則顯著升高。2.4 各組神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞周期 與普通神經(jīng)干細(xì)胞組相比較，SPIO標(biāo)記

29、3組神經(jīng)干細(xì)胞處于G0-G1及S期的比例明顯增多，處于G2-M期的比例明顯減少，SPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組更為顯著(P < 0.05)，見表1。表1 各組神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞周期分布 (±s，n=3，%)Table 1 Cell cycle distribution of neural stem cells in each group表注：與正常神經(jīng)干細(xì)胞組比較，aP < 0.05；與SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組、SPIO標(biāo)記空載病毒組比較，bP < 0.05。組別G1期S期G2/M期正常神經(jīng)干細(xì)胞組58.70±0.3618.81±0.183.98&#

30、177;0.13SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組63.35±0.57a21.32±0.54a8.36±0.45aSPIO標(biāo)記空載病毒組61.01±0.41a19.03±0.21a7.56±0.21aSPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組74.23±0.48b32.51±0.78b10.42±0.25b2.5 各組神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力 細(xì)胞于傳代后24 h內(nèi)緩慢生長(zhǎng)，48 h后生長(zhǎng)迅速，120 h時(shí)細(xì)胞密度最高，結(jié)果表明SPIO標(biāo)記的3組神經(jīng)干細(xì)胞與正常神經(jīng)干細(xì)胞相比較，增殖能力明顯增強(qiáng)，差異有顯著性意義(P < 0.

31、05)，見表2。6825ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH圖1 骨髓源神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)(×200)Figure 1 The morphology of bone marrow derived neural stem cells (×200)圖注：圖中A為接種24 h，倒置顯微鏡下可見細(xì)胞形態(tài)呈圓形，懸浮生長(zhǎng)；B為傳3代后的神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)趨向一致，大部分呈梭形，伴長(zhǎng)軸突樣纖維生長(zhǎng)。 A B表2 各組神經(jīng)干細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)的細(xì)胞活力 (±s，n=3，A值)Table 2 Cell viability of neural ste

32、m cells in different groups at the different time表注：與正常神經(jīng)干細(xì)胞組比較，aP < 0.05；與SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組、SPIO標(biāo)記空載病毒組比較，bP < 0.05。組別24 h48 h72 h96 h120 h正常神經(jīng)干細(xì)胞組0.20±0.090.34±0.110.62±0.090.93±0.101.31±0.19SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組0.37±0.10a0.58±0.13a1.43±0.11a1.82±0.15a2.74±

33、;0.15aSPIO標(biāo)記空載病毒組0.31±0.13a0.52±0.09a1.34±0.08a1.75±0.13a2.67±0.17aSPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組0.44±0.16b0.92±0.14b1.74±0.08b2.26±0.15b3.15±0.19b圖2 SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞普魯士藍(lán)染色呈陽(yáng)性(×200)Figure 2 SPIO-labeled neural stem cells were positive for Prussian blue staining (

34、15;200)SPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組 SPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組 SPIO標(biāo)記空載病毒組 hTERT-actinSPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組SPIO標(biāo)記空載病毒組 SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組hTERT-actin圖4 各組神經(jīng)干細(xì)胞hTERT蛋白的表達(dá)Figure 4 Expression of hTERT protein in neural stem cells in each group圖3 各組神經(jīng)干細(xì)胞hTERT mRNA表達(dá)Figure 3 hTERT mRNA expression in neural stem cells in each group2.6 各組神經(jīng)干細(xì)胞hTER

35、T mRNA表達(dá) SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組、SPIO標(biāo)記空載病毒組及SPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的hTERT mRNA相對(duì)吸光度值分別為0.31±0.02，0.37±0.03，0.39±0.08。SPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組hTERT mRNA的表達(dá)顯著增強(qiáng)，見圖3。2.7 各組神經(jīng)干細(xì)胞hTERT蛋白的表達(dá) SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞組、SPIO標(biāo)記空載病毒組及SPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組hTERT蛋白條帶灰度分別為23%，25%，78%，各組間差異有顯著性意義(P < 0.05)，見圖4。3 討論 Discussion神經(jīng)干細(xì)胞是一種原始的，尚未完全分化

36、的細(xì)胞，具有很強(qiáng)的自我分化能力，能夠誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞17-23。目前已有大量研究證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞可以在特定條件下分化成為神經(jīng)元修復(fù)神經(jīng)損傷，因此神經(jīng)干細(xì)胞為神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供新的治療方案24-26，目前研究仍處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。研究發(fā)現(xiàn)使用一種神經(jīng)干細(xì)胞特異性示蹤劑結(jié)合MRI可以無創(chuàng)監(jiān)測(cè)到其分布及存活情況。SPIO是一種陰性對(duì)比劑，超順磁性氧化鐵粒子即使在較弱的磁場(chǎng)中也可產(chǎn)生較大的磁性，而外磁場(chǎng)撤消后磁性也迅速消失，即具有所謂超順磁性。超順磁性氧化鐵顆粒分布于組織后，造成局部磁場(chǎng)的不均勻，從而加速了質(zhì)子去相位的T2弛豫，使組織信號(hào)降低，而對(duì)T1弛豫影響較小。用MRI可在活體上示蹤移植到宿主腦內(nèi)的磁

37、化標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞27-28。這種MRI成像顯示的神經(jīng)干細(xì)胞的分布及生存情況與組織切片染色后觀察到的結(jié)果是一致的。實(shí)驗(yàn)經(jīng)普魯士藍(lán)染色證實(shí)，用SPIO 和Lipofectamine體外磁化標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞是一種簡(jiǎn)便、行之有效的方法，這種磁化標(biāo)記細(xì)胞的方法不需要合成或修飾SPIO微顆粒表面的葡聚糖包被，也不需要形成新的氧化鐵合成物來標(biāo)記干細(xì)胞，更不需要通過結(jié)合外源性的蛋白。研究結(jié)果顯示：SPIO對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)記率可達(dá)97%，提示其具有高效性。MRI成像結(jié)果顯示，與正常神經(jīng)干細(xì)胞組相比SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞的T2及T2*弛豫時(shí)間均顯著下降，相應(yīng)的弛豫率則顯著升高(P < 0.01)。與正常神經(jīng)干

38、細(xì)胞比較，SPIO標(biāo)記的hTERT轉(zhuǎn)染組神經(jīng)干細(xì)胞增殖能力相比明顯增強(qiáng)，處于G0-G1及S期的比例明顯增多。SPIO標(biāo)記hTERT轉(zhuǎn)染組的hTERT mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，說明SPIO標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞體外hTERT基因修飾后能夠穩(wěn)定表達(dá)hTERT基因。致謝：感謝新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院放射科岳軍艷、胡瑩、吳清武、陳杰老師。作者貢獻(xiàn)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為竇文廣，實(shí)驗(yàn)實(shí)施為竇文廣、岳軍艷、胡瑩、吳清武、陳杰，實(shí)驗(yàn)評(píng)估為竇文廣、岳軍艷、胡瑩，資料收集為竇文廣、岳軍艷、胡瑩、吳清武、陳杰。利益沖突：所有作者共同認(rèn)可文章內(nèi)容不涉及相關(guān)利益沖突。倫理問題：實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合2009 年Ethical

39、issues in animal experimentation相關(guān)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的條例。文章查重：文章出版前已經(jīng)過CNKI反剽竊文獻(xiàn)檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行3次查重。文章外審：文章經(jīng)國(guó)內(nèi)小同行外審專家雙盲外審，符合本刊發(fā)稿宗旨。作者聲明：第一作者對(duì)研究和撰寫的論文中出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)責(zé)任。論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)(包括計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù))記錄及樣本已按照有關(guān)規(guī)定保存、分享和銷毀，可接受核查。文章版權(quán)：文章出版前雜志已與全體作者授權(quán)人簽署了版權(quán)相關(guān)協(xié)議。4 參考文獻(xiàn) References1 Kanaykina N, Abelson K, King D, et al. In vitro and in vivo

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