第八章 催化水解反應(yīng)的金屬酶.

1、第八章第八章第一節(jié)第一節(jié) 概概 述述第二節(jié)第二節(jié) 羧羧 肽肽 酶酶第三節(jié)第三節(jié) 碳碳 酸酸 酐酐 酶酶根據(jù)酶催化反應(yīng)的類型，把酶分為六類根據(jù)酶催化反應(yīng)的類型，把酶分為六類 ：氧化還原酶類氧化還原酶類 催化氧化還原反應(yīng)催化氧化還原反應(yīng)轉(zhuǎn)移酶類轉(zhuǎn)移酶類 催化功能基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)催化功能基團(tuán)轉(zhuǎn)移反應(yīng)裂解酶類裂解酶類 催化從底物移去一個(gè)基團(tuán)而留下催化從底物移去一個(gè)基團(tuán)而留下雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)雙鍵的反應(yīng)或其逆反應(yīng)異構(gòu)酶類異構(gòu)酶類 催化異構(gòu)體互相轉(zhuǎn)變催化異構(gòu)體互相轉(zhuǎn)變合成酶類合成酶類 催化雙分子合成一種新物質(zhì)同時(shí)催化雙分子合成一種新物質(zhì)同時(shí)使使ATP分解的反應(yīng)分解的反應(yīng)水解酶類水解酶類 催化水解反應(yīng)催化水解

2、反應(yīng)第一節(jié)第一節(jié) 概述概述 一、水解酶一、水解酶 六大酶類之中研究的最多并應(yīng)用最廣泛的六大酶類之中研究的最多并應(yīng)用最廣泛的一類，其中有不少水解酶的活性與金屬離子一類，其中有不少水解酶的活性與金屬離子有關(guān)。有關(guān)。 后頁(yè)表中列出若干水解金屬酶和金屬離子激后頁(yè)表中列出若干水解金屬酶和金屬離子激活酶。活酶。 金屬離子激活酶是指必須加入金屬離子才具金屬離子激活酶是指必須加入金屬離子才具有活性的酶。有活性的酶。水解酶根據(jù)水解酶根據(jù)水解鍵的類型水解鍵的類型不同分為六個(gè)亞類。不同分為六個(gè)亞類。 酯酶酯酶 作用于酯鍵，使其水解為酸和醇作用于酯鍵，使其水解為酸和醇 糖苷酶糖苷酶 作用于糖基化合物，使糖鍵水解作用于

3、糖基化合物，使糖鍵水解 醚酶醚酶 作用于醚鍵，使其水解作用于醚鍵，使其水解 肽酶肽酶 作用于肽鍵，使其水解作用于肽鍵，使其水解 C-NC-N酶酶 作用于其它作用于其它C-NC-N鍵鍵 酸酐酶酸酐酶 作用于酸酐作用于酸酐本章僅對(duì)本章僅對(duì)肽酶肽酶及及酯酶酯酶作一些介紹作一些介紹 肽酶肽酶催化蛋白質(zhì)的肽鍵水解催化蛋白質(zhì)的肽鍵水解蛋白質(zhì)為高分子物質(zhì)，不能透過(guò)細(xì)胞膜，必須蛋白質(zhì)為高分子物質(zhì)，不能透過(guò)細(xì)胞膜，必須水解成小分子才能被腸吸收。蛋白質(zhì)由各種肽水解成小分子才能被腸吸收。蛋白質(zhì)由各種肽酶催化，水解成小分子，被腸吸收。酶催化，水解成小分子，被腸吸收。肽酶肽酶肽鏈端解酶肽鏈端解酶肽鏈內(nèi)切酶（蛋白酶）肽鏈

4、內(nèi)切酶（蛋白酶）氨肽酶氨肽酶羧肽酶羧肽酶嗜熱菌嗜熱菌蛋白酶蛋白酶 根據(jù)作用方式，肽酶又分為根據(jù)作用方式，肽酶又分為肽鏈端解酶肽鏈端解酶和和肽鏈肽鏈內(nèi)切酶內(nèi)切酶。肽鏈端解酶肽鏈端解酶從肽鏈羧基末端和氨基末從肽鏈羧基末端和氨基末端切下氨基酸，前者稱端切下氨基酸，前者稱羧肽酶羧肽酶，后者稱，后者稱氨肽酶氨肽酶。 內(nèi)切酶內(nèi)切酶是另一類肽酶，用于切斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)是另一類肽酶，用于切斷蛋白質(zhì)分子內(nèi)部肽鍵使之變成小分子多肽，如嗜熱菌蛋白酶。部肽鍵使之變成小分子多肽，如嗜熱菌蛋白酶。 酯酶酯酶催化酯鍵水解，其中催化酯鍵水解，其中羧酸酯酶羧酸酯酶催化羧酸催化羧酸酯水解酯水解RCOOR + H2O RCOOH +

5、 ROH磷酸酯酶磷酸酯酶催化磷酸酯鍵水解催化磷酸酯鍵水解 O O ROPOR + H2O RO POH +ROH | | OH OHR=H時(shí)，磷酸單酯酶（如：堿性磷酸酯酶）時(shí)，磷酸單酯酶（如：堿性磷酸酯酶）磷酸二酯酶（如：磷脂酶磷酸二酯酶（如：磷脂酶C) 水解金屬酶之中很多都與水解金屬酶之中很多都與Zn2+有關(guān)。有關(guān)。 其次：其次：Ca2+、Mg2+，還有少數(shù)酶含，還有少數(shù)酶含Mn2+ 由于水解過(guò)程不發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，所以金屬由于水解過(guò)程不發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，所以金屬離子的氧化態(tài)在催化過(guò)程中不變化。離子的氧化態(tài)在催化過(guò)程中不變化。二、水解金屬酶研究中的過(guò)渡金屬離子二、水解金屬酶研究中的過(guò)渡金屬離子 EP

6、R、Mssbauerssbauer、d-dd-d電子光譜電子光譜金屬酶存金屬酶存在某種過(guò)渡金屬在某種過(guò)渡金屬。 ZnZn2+2+,Ca,Ca2+2+,Mg,Mg2+2+等離子不具有未充滿的等離子不具有未充滿的d d軌道，軌道，因此含有因此含有ZnZn2+2+,Ca,Ca2+2+,Mg,Mg2+2+等離子的金屬酶就難以等離子的金屬酶就難以應(yīng)用上述檢測(cè)技術(shù)獲得有用信息。應(yīng)用上述檢測(cè)技術(shù)獲得有用信息。 為了深入研究金屬酶的性質(zhì)，通常采用探針。為了深入研究金屬酶的性質(zhì)，通常采用探針。一般采用一般采用CoCo2+2+代替代替ZnZn2+2+，用，用MnMn2+2+代替代替MgMg2+2+。非過(guò)。非過(guò)渡金

7、屬渡金屬TlTl+ +作為作為K K+ +的的NMRNMR探針。探針。 使用探針離子遵循的原則：使用探針離子遵循的原則：同晶置換同晶置換，即，即探針離子在酶分子中占據(jù)原有金屬離子所探針離子在酶分子中占據(jù)原有金屬離子所在的同一位置。在的同一位置。 電子構(gòu)型、離子半徑、配位幾何構(gòu)型。電子構(gòu)型、離子半徑、配位幾何構(gòu)型。 很關(guān)鍵問(wèn)題：是否能繼續(xù)保持酶分子的生很關(guān)鍵問(wèn)題：是否能繼續(xù)保持酶分子的生物活性。物活性。 金屬配位鍵的強(qiáng)弱對(duì)于決定反應(yīng)的途徑也金屬配位鍵的強(qiáng)弱對(duì)于決定反應(yīng)的途徑也很重要，而這種配位鍵的強(qiáng)度可隨金屬不很重要，而這種配位鍵的強(qiáng)度可隨金屬不同而變化。同而變化。 Zn2+的電子結(jié)構(gòu)：的電子結(jié)

8、構(gòu)：d10，在可見(jiàn)區(qū)沒(méi)有吸收。，在可見(jiàn)區(qū)沒(méi)有吸收。在羧肽酶研究中采用在羧肽酶研究中采用Mn2+，F(xiàn)e2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Rh3+，Cd2+，Pd2+等離子取代。等離子取代。 Co2+取代的羧肽酶取代的羧肽酶A對(duì)肽鍵的水解具有很強(qiáng)的對(duì)肽鍵的水解具有很強(qiáng)的活性?；钚浴?Co2+羧肽酶羧肽酶A的吸收光譜與經(jīng)典的四面體配位的吸收光譜與經(jīng)典的四面體配位的鈷配合物很不同，而且摩爾消光系數(shù)很大，的鈷配合物很不同，而且摩爾消光系數(shù)很大，這是由于金屬處在畸變四面體配位引起的；這是由于金屬處在畸變四面體配位引起的；圓二色譜、磁圓二色譜和低溫圓二色譜、磁圓二色譜和低溫EPR譜的結(jié)果譜的結(jié)果證實(shí)這一點(diǎn)

9、。證實(shí)這一點(diǎn)。 證明鋅酶中的證明鋅酶中的Zn2+處于畸變四面體配位狀態(tài)。處于畸變四面體配位狀態(tài)。 碳酸酐酶研究中，鈷酶活性是鋅酶活性的碳酸酐酶研究中，鈷酶活性是鋅酶活性的50%，而，而Ni2+，Mn2+，F(xiàn)e2+酶僅稍具活性，酶僅稍具活性，其它惰性。其它惰性。 Co2+取代酶大都能在不同程度上保持酶的取代酶大都能在不同程度上保持酶的催化活性。催化活性。 電子結(jié)構(gòu)、離子半徑、配位幾何構(gòu)型。電子結(jié)構(gòu)、離子半徑、配位幾何構(gòu)型。 Co2+配合物有多種幾何構(gòu)型，高自旋配合物有多種幾何構(gòu)型，高自旋Co(II)配合物優(yōu)先采取四面體結(jié)構(gòu)。配合物優(yōu)先采取四面體結(jié)構(gòu)。 四面體場(chǎng)中，高自旋四面體場(chǎng)中，高自旋Co2+

10、的電子組態(tài)為的電子組態(tài)為e4t23，相當(dāng)于，相當(dāng)于Zn2+的的d10組態(tài)的球?qū)ΨQ結(jié)構(gòu)。組態(tài)的球?qū)ΨQ結(jié)構(gòu)。 采用采用Co2+作為探針，就能提供鋅酶的金屬作為探針，就能提供鋅酶的金屬結(jié)合部位結(jié)構(gòu)的有用信息。結(jié)合部位結(jié)構(gòu)的有用信息。第二節(jié)第二節(jié) 羧肽酶羧肽酶 羧肽酶是催化肽鏈的羧肽酶是催化肽鏈的C-末端氨基酸殘基水解的末端氨基酸殘基水解的酶。酶。 第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的鋅酶第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的鋅酶 第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的金屬酶第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的金屬酶 動(dòng)力學(xué)、結(jié)構(gòu)、光譜最清楚的水解酶動(dòng)力學(xué)、結(jié)構(gòu)、光譜最清楚的水解酶 羧肽酶分類：羧肽酶分類： 金屬酶，存在于胰液中，細(xì)胞外酶，幫助蛋白金屬酶，存在于胰液中，細(xì)胞外酶，幫助蛋白質(zhì)消

11、化，中性或弱堿性顯示極大的活性質(zhì)消化，中性或弱堿性顯示極大的活性 非金屬酶（酵母羧肽酶非金屬酶（酵母羧肽酶C），細(xì)胞內(nèi)酶，在酸），細(xì)胞內(nèi)酶，在酸性條件下具有很大活性。性條件下具有很大活性。一、羧肽酶一、羧肽酶A1.組成、結(jié)構(gòu)與功能組成、結(jié)構(gòu)與功能（1）組成：）組成：存在哺乳動(dòng)物胰臟中，相對(duì)分存在哺乳動(dòng)物胰臟中，相對(duì)分子質(zhì)量子質(zhì)量3460034600， Zn2+作為輔基，單一多肽作為輔基，單一多肽鏈，約鏈，約300個(gè)氨基酸殘基。個(gè)氨基酸殘基。研究比較多的是牛的羧肽酶研究比較多的是牛的羧肽酶A。 羧肽酶原羧肽酶原A A在胰蛋白酶作用下，一個(gè)肽鍵斷在胰蛋白酶作用下，一個(gè)肽鍵斷裂，釋放出大約裂，釋放出

12、大約6060個(gè)氨基酸殘基的個(gè)氨基酸殘基的N-N-末端末端裂解物。在不同條件下，可以產(chǎn)生裂解物。在不同條件下，可以產(chǎn)生4 4種不同種不同羧肽酶羧肽酶A A：307; 305; 300;300307; 305; 300;300動(dòng)物體內(nèi)羧肽酶原A二聚體或三聚體，無(wú)活性胰蛋白酶激活60個(gè)氨基酸殘基-N末端裂解物肽鍵斷裂不同條件下,四種不同的羧肽酶307，305，300，300通常說(shuō)的羧肽酶通常說(shuō)的羧肽酶A就是羧肽酶就是羧肽酶A (2)結(jié)構(gòu)：橢球形，羧肽酶結(jié)構(gòu)：橢球形，羧肽酶A() 大約一半的氨大約一半的氨基酸形成基酸形成-螺旋結(jié)構(gòu)或螺旋結(jié)構(gòu)或-折疊結(jié)構(gòu)。折疊結(jié)構(gòu)。 其余其余氨基酸氨基酸無(wú)確定模式，相對(duì)

13、容易變形，與無(wú)確定模式，相對(duì)容易變形，與底物結(jié)合相聯(lián)系的構(gòu)象變化主要在這些容易底物結(jié)合相聯(lián)系的構(gòu)象變化主要在這些容易變形的部分發(fā)生。變形的部分發(fā)生。 酶分子中部一狹長(zhǎng)的空腔，底物結(jié)合位置。酶分子中部一狹長(zhǎng)的空腔，底物結(jié)合位置。 底物的底物的C C末端沿這條溝槽伸入到酶分子內(nèi)末端沿這條溝槽伸入到酶分子內(nèi)的活性部位，空腔中還有一定數(shù)量的水分子，的活性部位，空腔中還有一定數(shù)量的水分子， Zn2+就處于這條空腔的內(nèi)表面，它是維持就處于這條空腔的內(nèi)表面，它是維持羧羧肽酶肽酶A活性所必須的組分?；钚运仨毜慕M分。 Zn2+與多肽鏈的兩個(gè)組氨酸（與多肽鏈的兩個(gè)組氨酸（69,196）的咪唑）的咪唑基氮原子，以

14、及谷氨酸（基氮原子，以及谷氨酸（72）的羧基氧原子以）的羧基氧原子以配位鍵結(jié)合，配位鍵結(jié)合，Zn2+第配位為水。第配位為水。Zn2+處于畸變四面體配位處于畸變四面體配位狀態(tài)中。狀態(tài)中。 3功能：功能： 催化蛋白質(zhì)或多肽的羧基末端肽鍵的水解反應(yīng)。催化蛋白質(zhì)或多肽的羧基末端肽鍵的水解反應(yīng)。除了脯氨酸之外，羧肽酶能不同程度的催化具有除了脯氨酸之外，羧肽酶能不同程度的催化具有各種各種C-末端氨基酸的肽鏈水解。末端氨基酸的肽鏈水解。 底物的底物的C-末端側(cè)鏈為芳基或分支較大的脂基羧肽末端側(cè)鏈為芳基或分支較大的脂基羧肽酶顯示出很強(qiáng)的活性。酶顯示出很強(qiáng)的活性。 NHCHCONHCHCOO- + H2O |

15、| R2 R1 NHCHCOOH + NH2CHCOO- | | R2 R12.肽水解的催化機(jī)理肽水解的催化機(jī)理 （1）活性部位）活性部位 早期的蛋白鏈化學(xué)修飾法已經(jīng)確定羧肽酶的早期的蛋白鏈化學(xué)修飾法已經(jīng)確定羧肽酶的活性部位?；钚圆课?。 Zn2+除與組氨酸（除與組氨酸（His-69)、-196，以及，以及Glu-72形成直接參與催化作用的活性部位外，形成直接參與催化作用的活性部位外，還包括還包括Arg-145，Tyr-248和和Glu-270，它們，它們的側(cè)聯(lián)基團(tuán)也是直接與底物結(jié)合的部位。的側(cè)聯(lián)基團(tuán)也是直接與底物結(jié)合的部位。 當(dāng)上述氨基酸與其他物質(zhì)作用而被化學(xué)修飾當(dāng)上述氨基酸與其他物質(zhì)作用而被

16、化學(xué)修飾時(shí)，酶失去活性時(shí)，酶失去活性 （2）鋅）鋅-羰基機(jī)理羰基機(jī)理 主要特征：底物的主要特征：底物的C-末末端肽鍵的羰基通過(guò)鋅的配位作用而極化，端肽鍵的羰基通過(guò)鋅的配位作用而極化，極化羰基的碳原子由于親核反應(yīng)發(fā)生水解極化羰基的碳原子由于親核反應(yīng)發(fā)生水解作用。作用。 第一步：第一步：Arg-145的胍基和底物的帶負(fù)電荷的胍基和底物的帶負(fù)電荷的的C-末端羧基相互吸引。末端羧基相互吸引。 第二步：底物酪氨酸殘基的芳基側(cè)鏈進(jìn)入第二步：底物酪氨酸殘基的芳基側(cè)鏈進(jìn)入酶的非極性口袋形空腔中擠走酶的非極性口袋形空腔中擠走4H2O。 第三步第三步:底物敏感肽鍵的底物敏感肽鍵的-NH-基上的氮原子基上的氮原子與

17、酶的與酶的Tyr-248的的-OH以氫鍵連結(jié)。以氫鍵連結(jié)。 第四步：底物肽鍵上的羰基擠走了水分子第四步：底物肽鍵上的羰基擠走了水分子而與鋅配位，鋅使羰基極化以致碳原子容而與鋅配位，鋅使羰基極化以致碳原子容易接受親核進(jìn)攻。易接受親核進(jìn)攻。 第五步：底物末端的羰基碳原子通過(guò)一個(gè)第五步：底物末端的羰基碳原子通過(guò)一個(gè)插入的水分子與酶的谷氨酸插入的水分子與酶的谷氨酸Glu-270的側(cè)鏈的側(cè)鏈以氫鍵連結(jié)。但最后這一步不一定發(fā)生。以氫鍵連結(jié)。但最后這一步不一定發(fā)生。 羧肽酶與甘氨酰胺結(jié)合的過(guò)程，必須通過(guò)羧肽酶與甘氨酰胺結(jié)合的過(guò)程，必須通過(guò)活性中心的重排，特別是酶分子的構(gòu)象的活性中心的重排，特別是酶分子的構(gòu)象

18、的重大改變才能實(shí)現(xiàn)。重大改變才能實(shí)現(xiàn)。 Arg-145 和和 Glu-270移動(dòng)移動(dòng)0.2nm，Arg的位的位移帶動(dòng)了肽鏈的扭轉(zhuǎn)，使移帶動(dòng)了肽鏈的扭轉(zhuǎn)，使Tyr-248移動(dòng)了移動(dòng)了1.2nm。 誘導(dǎo)誘導(dǎo)喫喫合狀態(tài)合狀態(tài)：酶分子構(gòu)象改變，配位鍵、：酶分子構(gòu)象改變，配位鍵、范德華力、靜電吸引力和氫鍵等作用力，使范德華力、靜電吸引力和氫鍵等作用力，使酶分子與底物在空間和電荷上都很匹配，因酶分子與底物在空間和電荷上都很匹配，因而處于而處于喫喫合狀態(tài)。合狀態(tài)。 羧肽酶與甘氨酰胺結(jié)合正是酶的羧肽酶與甘氨酰胺結(jié)合正是酶的誘導(dǎo)誘導(dǎo)喫喫合狀合狀態(tài)的范例。態(tài)的范例。 酶分子構(gòu)象改變和各種相互作用力使底物肽酶分子構(gòu)

19、象改變和各種相互作用力使底物肽鍵處于張力狀體下，因此，反應(yīng)活化能大大鍵處于張力狀體下，因此，反應(yīng)活化能大大降低。降低。 酶與底物結(jié)合后進(jìn)一步反應(yīng)的步驟有兩種不酶與底物結(jié)合后進(jìn)一步反應(yīng)的步驟有兩種不同的觀點(diǎn)。同的觀點(diǎn)。 第一種：第一種：Glu-270激活了水分子，提高了水激活了水分子，提高了水分子的氧的親核能力，向底物肽健羰基的碳分子的氧的親核能力，向底物肽健羰基的碳原子進(jìn)攻，原子進(jìn)攻，Glu-270羰基質(zhì)子化，羰基質(zhì)子化，Tyr-248也也提供一個(gè)質(zhì)子，肽鍵斷裂，底物分解。提供一個(gè)質(zhì)子，肽鍵斷裂，底物分解。第二種：第二種： 鋅的作用：鋅的作用： 在鋅在鋅-羰基機(jī)理中起了使肽鍵產(chǎn)生張力的作羰基機(jī)

20、理中起了使肽鍵產(chǎn)生張力的作 用，從而促進(jìn)了底物的水解。由于用，從而促進(jìn)了底物的水解。由于Zn2+的的作用，底物肽鍵的羰基碳原子的電子云密作用，底物肽鍵的羰基碳原子的電子云密度降低而呈正電性，因此羰基碳原子更容度降低而呈正電性，因此羰基碳原子更容易接受親核進(jìn)攻。易接受親核進(jìn)攻。 底物末端羧基與底物末端羧基與Arg-145帶正電的胍基連帶正電的胍基連結(jié)，觸發(fā)了結(jié)，觸發(fā)了Tyr-248大幅度位移，酶顯示活大幅度位移，酶顯示活性。由此可見(jiàn)：酶與底物的誘導(dǎo)性。由此可見(jiàn)：酶與底物的誘導(dǎo)喫喫合是一合是一個(gè)互相識(shí)別的動(dòng)態(tài)過(guò)程。這個(gè)過(guò)程發(fā)生活個(gè)互相識(shí)別的動(dòng)態(tài)過(guò)程。這個(gè)過(guò)程發(fā)生活性中心重排，使底物有可能被酶的功能

21、基性中心重排，使底物有可能被酶的功能基包圍而發(fā)生催化。包圍而發(fā)生催化。第三節(jié)：碳酸酐酶第三節(jié)：碳酸酐酶 廣泛存在動(dòng)物、植物和某些微生物體內(nèi)。廣泛存在動(dòng)物、植物和某些微生物體內(nèi)。 可逆催化二氧化碳的水合作用，還能催化可逆催化二氧化碳的水合作用，還能催化醛類水合作用和某些脂的水解。醛類水合作用和某些脂的水解。 碳酸酐酶分含碳酸酐酶分含ZnZn2+2+酶和不含酶和不含ZnZn2+2+酶。酶。 鋅酶鋅酶，紅細(xì)胞中僅次于血紅蛋白。，紅細(xì)胞中僅次于血紅蛋白。一、組成、結(jié)構(gòu)、功能一、組成、結(jié)構(gòu)、功能 相對(duì)分子量約相對(duì)分子量約30000，單一肽鏈，每個(gè)分子，單一肽鏈，每個(gè)分子含一個(gè)含一個(gè)Zn2+，260個(gè)氨基酸殘基，脯氨酸含個(gè)氨基酸殘基，脯氨酸含量較高，沒(méi)有二硫鍵。量較高，沒(méi)有二硫鍵。 通常碳酸酐酶指碳酸酐酶通常碳酸酐酶指碳酸酐酶B。 橢球形，