流式細胞儀原理

1、流式細胞儀 工作原理 EPICS XL/MCL FC500MCL/MPL流式細胞術(shù)的原理 流式細胞術(shù)（FCM）是一種能對單個細胞、分子和生物顆粒（微生物）進行多參數(shù)快速檢測的新型分析和分選技術(shù)。近幾年隨著多種單克隆抗體的成功制備和多種熒光素的應(yīng)用。FCM逐步運用于對疾病診斷和治療監(jiān)測的臨床檢驗常規(guī)工作。 基本原理基本原理流路流動室 鞘液SHEATH 樣本流SAMPLE 單細胞懸液5*1051*106個/ml光路光源檢測信號光電倍增管PMT HV電路放大電路HV及GAIN 增益A/D轉(zhuǎn)換統(tǒng)計：計算機 流流 路路 單細胞懸液 大多數(shù)儀器是在50-300 m 大小的孔徑中,將細胞懸液注射進入鞘液中

2、這一過程,成為流體動力學聚焦FLOW CELLInjector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid光光 路路光源光源檢測信號檢測信號 散射光信號散射光信號FS: 前向角散射光前向角散射光SS: 側(cè)向角散射光側(cè)向角散射光(90度散射光度散射光) 熒光信號熒光信號熒光染料熒光染料光學濾片光學濾片 顏色補償顏色補償電路電路-光電倍增管光電倍增管 光光 路路 光源與通過的細胞聚焦在同一點上 激光 空冷 488nm blue, 633nm red, 325nm UV, 514nm green,空冷/水冷Enterprise II水冷In

3、nova300系列Innova70系列檢測信號檢測信號 散射光信號散射光信號前向散射光前向散射光(FS) FS-Forward (Angel Light) Scatter在激光束正前方的檢測器, 為前向散射光檢測器 FS的強度與細胞或其他顆粒的大小, 形狀及 optical homogeneity 有關(guān) FS用于檢測細胞或其他粒子的表面屬性如:大小 前向散射光前向散射光 散射光信號散射光信號 側(cè)向散射光側(cè)向散射光 SS-Side (Angel Light) Scatter 與激光束垂直方向的檢測器為側(cè)向檢測器, 也稱為90度散射光檢測器 SS的強度與細胞或其他顆粒的大小, 形狀及 optica

4、l homogeneity 有關(guān) SS用于檢測細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)如:胞漿內(nèi)顆粒多少, 核質(zhì)比 側(cè)向散射光側(cè)向散射光90 Degree Scatter0 200 400 600 8001000Forward Scatter0 200 400 600 8001000 815203040501002001000LymphocytesMonocytesNeutrophilsSide Scatter ProjectionForward Scatter ProjectionLight Scatter GatingScale 光路光路-熒光信號熒光信號 每種熒光染料均有特定的激發(fā)波長, 并激發(fā)后會有發(fā)射波長,流式

5、細胞儀檢測的即是它特定的發(fā)射波長. 利用各種不同波長的光學濾片來收集(檢測)這些光學信號熒光染料的特性激發(fā)波長(EXCITING)發(fā)射波長(EMISSION)常用熒光染料的特性常用熒光染料的特性熒光染料 激發(fā)波長 (nm) 發(fā)射波長(nm) 用途 顏色FITC 488 525 免疫熒光 綠色PE(RD1) 488 575 免疫熒光 橙色 ECD 488 620 免疫熒光 橙紅PeCy5 488 675 免疫熒光 紅PI 488 620 DNA染色 橙紅PECy7 488 755 免疫熒光 深紅PerCP 488 670APC 633 670 光路光路 - 濾片特性濾片特性 當以 45o 角放置

6、濾片時,該濾片可以通過一定波長的光,同時也可以阻斷并折射該波長以下的光 這種方式的濾片稱為二向色性濾片( dichroic filter) SourcelightPassedlightCertain colorsabsorbedAbsorbancefilter標準帶通濾片標準帶通濾片 band pass 光源光源通過的光譜通過的光譜630/30 nm BP615-645 nm light Unique 4-Color Single Laser DesignAir-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Fl

7、ow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (RD1)620BP FL3 (ECD)675BP FL4 (PC5)488DL488BK550DL600DL645DLPC7Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (RD1) 675BP(PC5

8、)750BP FL4 (PC7)488DL488BK550DL600DL 700DLOptics - Detectors Photomultiplier tube (PMT) 將光學信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娒}沖(數(shù)字數(shù)據(jù))信號 不同的脈沖信號被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道不同的脈沖信號被轉(zhuǎn)換成數(shù)字通道(CHANNEL)的過程的過程 Log FITC 1000 100 10 1 110.1Count 30 700 150ImmunophenotypingImmunophenotypinguSingle Parameter Histogram: Count vs MFI 各熒光染料發(fā)射的熒光信號有重迭, 因此要進行色補償以

9、除去重迭部分emission intensitywavelengthFLBFLA光譜重疊需進行色補償光譜重疊需進行色補償減法顏色補償減法顏色補償 減法補償 去除疊加信號,在使用雙色以上時會產(chǎn)生減得過多的錯誤 BD FACSCalibur 補償試劑FITCPEFITCPEFITCPE全矩陣顏色補償全矩陣顏色補償全矩陣 在每個PMT上對于每一個熒光計算 “疊加熒光素” 的比率 通過矩陣去除或加上信號 EPICS XL Cytomics FC500FL1FL2FL3FL4PMT155.00.50.30.3PMT21.747.01.20.3PMT30.67.445.00.3PMT40.21.43.42

10、8.0Normalized Relative IntensityFL1FL2FL3FL4PMT1100.01.10.71.1PMT23.1100.02.71.1PMT31.115.7100.01.1PMT40.43.07.6100.0PercentageMean IntensitySingle Parameter MnIIOT CD45CD45-ECD PMT 1 PMT 2 PMT 3 PMT 4 FL1 100 -1.28 -1.08 -0.74 FL2 -3.5 100 -7.41 -0.44 FL3 1.01 -41.25 100 0.18 FL4 -0.04 6.67 -24.40

11、100 EPICS XLEPICS XL臨床科研型流式細胞儀臨床科研型流式細胞儀 EPICS XLEPICS XL合理的光路設(shè)計 -單激光激發(fā)四色熒光標準模式確保在同一個細胞上獲得最多的信息 EPICS XL直線光路設(shè)計，光損失少可互換式光學濾片，方便新染料的應(yīng)用Air-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (RD1)620BP FL3 (ECD)67

12、5BP FL4 (PC5)488DL488BK550DL600DL645DLAir-cooled Argon Ion LaserBeam Shaping LensesHigh SensitivityQuartz Flow CellForward ScatterDetectorSide ScatterDetector525BP FL1 (FITC)575BP FL2 (RD1) 675BP(PC5)750BP FL4 (PC7)488DL488BK550DL600DL 700DLPC7With Thanks to Dr. Frank SchniedersGentherapie Gruppe Ab

13、teilung Molekulare Zellbiologie Institut fr Medizinische Biochemie und MolekularbiologieUniversittsklinikum Hamburg-EppendorfEGFP, EYFP and 7-AADWith EPICS XLTM and EXPO32TM ADC-SoftwareHEK293Human EmbryonalKidney Cells 293Filter SetBP 510LAF21BP 550LAF30Dichroic Mirror 525DRLPCell Viability with 7-

14、AADHEK293-cells with EYFP TransfectionHEK293-cells with EGFP TransfectionMixture of EGFP- and EYFP-transfected HEK293-CellsEGFP . Enhanced Green Fluorescent Protein (Ex 488; Em 507 nm)EYFP . Enhanced Yellow Fluorescent Protein (Ex 513; Em 527 nm)7-AAD .7-Aminoactinomycin (Viability Stain ; Ex 546; E

15、m 647 nm) 四色熒光中的補償傳統(tǒng)補償與傳統(tǒng)補償與ADC補償補償EPICS XLEPICS XL采用最先進的通訊傳輸設(shè)計 -光纖通訊與數(shù)字信號傳輸EPICS XL中的PRISM功能-將多張直方圖濃縮在一張上Howard M. Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd ed., page 355“The XL is presently unique among production flow cytometer in its use of digital electronics for transformation between linear and

16、logarithmic signals and of computer algorithm for fluorescence compensation. I have already praised this approach a few times (pp. 19, 166, 189), while also nothing that it probably represented the only practical way to implement another feature which presently distinguishes the EPICS XL from its co

17、mpetitors, i.e., 4-color fluorescence analysis. Both features will have the other manufacturers trying to play catch-up for a while.”“XL因為有全數(shù)字化的線性-數(shù)轉(zhuǎn)換及電腦軟體螢光補償而成為現(xiàn)今流式細胞分析儀系統(tǒng)中最獨特的產(chǎn)品.個人也多次表示欽佩(第19,166,189頁). EPICS XL(單一激光產(chǎn)生)的四個螢光分析性能,使其鶴立於其他競爭者之中.這些功能將會讓其他廠商花很長的時間來追趕”.摘自”流式細胞分析儀系統(tǒng)實務(wù)第三版,1995.” 作者Howard

18、 M. Shapiro, Practical Flow Cytometry, 3rd ed., page 355專家評述專家評述來自ISAC的報告產(chǎn)品介紹產(chǎn)品介紹 XL設(shè)計的所有優(yōu)勢：設(shè)計的所有優(yōu)勢：單激光激發(fā)四色熒光光纖通訊數(shù)字化信號傳遞可互換式光學濾片，無需調(diào)整光路具有620nm的濾片,最適合DNA倍體分析利用軟件進行全矩陣優(yōu)化（ADC)顏色補償PRISM 濃縮柱形圖 快速調(diào)節(jié)電壓快速調(diào)整補償補償向?qū)Ю蒙飿颖具M行顏色補償WINDOWS界面操作軟件Cytomics FC500 MCL 進樣 MCL 自動模式. MCL 直接( 或手動) 模式. 單管固定位置進樣. 可以暫停 / 旋轉(zhuǎn)以方便隨時添加刺激劑等 條碼識別 樣本混勻產(chǎn)品介紹：硬件產(chǎn)品介紹：硬件產(chǎn)品介紹：硬件產(chǎn)品介紹：硬件 可選MPL (研究用) 24 孔 每孔樣本體積0.5 2.5 ml 96 孔 最少體積200 ul 40 管 (12x75mm) 最少體積500 ul 固定樣本體積 吸樣25 ul 樣本混勻功能FC500特點特點 1根激光同時激發(fā)5色熒光 2根激光可選 3種進樣方式 4種直方圖分辨率 5色熒光同時檢測全球第一臺單激光激發(fā)五色熒光的流式細胞儀全球唯一一臺獲得Quality leadership Award 的流式細胞儀全球唯一一