生姜中蛋白酶的提取、分子量和含量的測定

1、課題一、生姜蛋白酶的提取與分離純化課題一、生姜蛋白酶的提取與分離純化課題二、生姜蛋白酶活力的測定課題二、生姜蛋白酶活力的測定課題三、生姜蛋白酶含量的測定課題三、生姜蛋白酶含量的測定課題四、聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)測定蛋白酶分子量課題四、聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)測定蛋白酶分子量材料：生姜材料：生姜試劑：試劑：0.01%0.01%考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G-250G-250溶液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液、溶液、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液、0.5%0.5%酪蛋白酪蛋白溶液、溶液、0.2mol/L pH7.50.2mol/L pH7.5的磷酸緩沖液、的磷酸緩沖液、0.05mol/L pH6.00.05mol/L pH6.0的磷酸鹽

2、的磷酸鹽緩沖液、緩沖液、1N HCl1N HCl、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、分離膠丙膠貯液、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液、分離膠丙膠貯液、濃縮膠丙膠貯液、過硫酸銨溶液、核黃素溶液、電極緩沖液、濃縮膠丙膠貯液、過硫酸銨溶液、核黃素溶液、電極緩沖液、40%40%蔗糖、蔗糖、pH4.7pH4.7乙酸緩沖液、樣品提取液、乙酸緩沖液、樣品提取液、0.5%0.5%溴酚藍(lán)溴酚藍(lán)儀器：研缽、透析袋、垂直板電泳裝置、分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒儀器：研缽、透析袋、垂直板電泳裝置、分光光度計(jì)、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、勻漿機(jī)、分析天平、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀溫水浴鍋、勻漿機(jī)、分析天平、穩(wěn)流穩(wěn)壓電泳儀生姜屬姜科姜屬植物，是一種重要的藥

3、生姜屬姜科姜屬植物，是一種重要的藥食兼用蔬菜，自古被醫(yī)學(xué)家視為藥食同食兼用蔬菜，自古被醫(yī)學(xué)家視為藥食同源的保健品。目前，在食品中開發(fā)利用源的保健品。目前，在食品中開發(fā)利用的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠蘿的植物蛋白酶主要有木瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶等。生姜蛋白酶是有待開發(fā)利用蛋白酶等。生姜蛋白酶是有待開發(fā)利用的植物蛋白酶，可用于肉類嫩化、姜汁的植物蛋白酶，可用于肉類嫩化、姜汁凝乳、蛋白質(zhì)水解等方面。開發(fā)生姜蛋凝乳、蛋白質(zhì)水解等方面。開發(fā)生姜蛋白酶的研究，可以改變我國植物蛋白酶白酶的研究，可以改變我國植物蛋白酶資源長期依賴木瓜、菠蘿等少數(shù)熱帶水資源長期依賴木瓜、菠蘿等少數(shù)熱帶水果資源的現(xiàn)狀。果資源的

4、現(xiàn)狀。 從溶液中分離純化可溶性蛋白質(zhì)的主流方法包括：從溶液中分離純化可溶性蛋白質(zhì)的主流方法包括：等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法：在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以兩性離子形式存在，其分子凈電荷為零( (即正負(fù)電即正負(fù)電荷相等荷相等) )，此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減，此時(shí)蛋白質(zhì)分子顆粒在溶液中因沒有相同電荷的相互排斥，分子相互之間的作用力減弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀弱，其顆粒極易碰撞、凝聚而產(chǎn)生沉淀，所以蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)，其溶解度最小，最易形成沉淀物

5、，從而有利于懸浮液的過濾。物，從而有利于懸浮液的過濾。鹽析：鹽析：溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程溶液中加入無機(jī)鹽類而使某種物質(zhì)溶解度降低而析出的過程。透析透析：是通過小分子經(jīng)過半透膜擴(kuò)散到水（或緩沖液）的原理，將小分子與生物大分子分開的是通過小分子經(jīng)過半透膜擴(kuò)散到水（或緩沖液）的原理，將小分子與生物大分子分開的一種分離純化技術(shù)。一種分離純化技術(shù)。 生姜蛋白酶的提取方法很多，但主要是有機(jī)溶劑提取方法如丙酮、鹽析沉淀法、硫酸銨沉生姜蛋白酶的提取方法很多，但主要是有機(jī)溶劑提取方法如丙酮、鹽析沉淀法、硫酸銨沉淀法。淀法。本研究中采用磷酸鹽緩沖液（本研究中采用磷酸鹽緩沖液（Ph6.

6、0Ph6.0）提取粗酶液，再應(yīng)用硫酸銨鹽析）提取粗酶液，再應(yīng)用硫酸銨鹽析，可獲得高酶活的，可獲得高酶活的生姜蛋白酶，而且操作簡單，成本低，易于產(chǎn)業(yè)化。生姜蛋白酶，而且操作簡單，成本低，易于產(chǎn)業(yè)化。實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程（1 1）生姜蛋白酶提取液的制備）生姜蛋白酶提取液的制備取外形完好無損傷，富含纖維的生姜取外形完好無損傷，富含纖維的生姜50g50g，切成小塊，切成小塊，按料液比按料液比1:21:2加入磷酸緩沖液，研磨勻漿加入磷酸緩沖液，研磨勻漿30min30min，所得，所得漿液用八層紗布過濾，濾渣用少量磷酸緩沖液洗滌后，漿液用八層紗布過濾，濾渣用少量磷酸緩沖液洗滌后，收集濾液收集濾液44靜置靜置2

7、h2h，離心去沉淀，上清液用磷酸緩沖，離心去沉淀，上清液用磷酸緩沖液定容至液定容至100mL100mL，44冰箱貯存待用。冰箱貯存待用。（2 2）生姜蛋白酶的純化）生姜蛋白酶的純化 丙酮沉淀丙酮沉淀鹽析鹽析透析透析 丙酮沉淀丙酮沉淀：取生姜蛋白酶溶液：取生姜蛋白酶溶液20mL20mL，加入，加入1.51.5倍的倍的44預(yù)冷丙酮進(jìn)行沉淀，預(yù)冷丙酮進(jìn)行沉淀，沉淀完全后，沉淀完全后，44靜置靜置2h2h，冷凍離心去除上清液后收集沉淀（及粗酶）。，冷凍離心去除上清液后收集沉淀（及粗酶）。 鹽析鹽析：沉淀用磷酸緩沖液溶解，用四層紗布過濾，濾液再離心：沉淀用磷酸緩沖液溶解，用四層紗布過濾，濾液再離心30m

8、in,30min,取取上清液緩慢加入上清液緩慢加入1.21.2倍的冷丙酮酸輕輕攪拌倍的冷丙酮酸輕輕攪拌5min5min，離心，取沉淀溶于，離心，取沉淀溶于Ph6.0Ph6.0的緩沖液中，緩慢加入硫酸銨至的緩沖液中，緩慢加入硫酸銨至40%40%飽和度，低溫靜置飽和度，低溫靜置24h24h，離心，上清液，離心，上清液中繼續(xù)加入硫酸銨至中繼續(xù)加入硫酸銨至60%60%飽和度，低溫靜置飽和度，低溫靜置24h24h，離心取沉淀。，離心取沉淀。 透析透析：沉淀溶于：沉淀溶于0.010.01mol/L pH6.0mol/L pH6.0的磷酸鹽緩沖液中，采用截留分子量的磷酸鹽緩沖液中，采用截留分子量14000U

9、14000U的透析袋進(jìn)行的透析袋進(jìn)行44透析，直至透析，直至1%1%氯化鋇檢查無白色沉淀為止。濃縮干氯化鋇檢查無白色沉淀為止。濃縮干燥得粗酶粉。燥得粗酶粉。生姜蛋白酶活力的定義：在一定溫度（生姜蛋白酶活力的定義：在一定溫度（4040）下，每分鐘分解）下，每分鐘分解酪蛋白產(chǎn)生酪蛋白產(chǎn)生1 1g酪氨酸所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。酪氨酸所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位。實(shí)驗(yàn)方法：實(shí)驗(yàn)方法：1.0ml1.0ml蛋白酶液與蛋白酶液與1.0ml0.5%1.0ml0.5%酪蛋白混合，酪蛋白混合，4040水浴水浴保溫保溫10min10min，加入，加入2.0ml0.4mol/l2.0ml0.4mol/l三氯乙酸

10、終止反應(yīng)，靜置三氯乙酸終止反應(yīng)，靜置10min10min后過濾。取后過濾。取0.5ml0.5ml濾液與濾液與5.0ml5.0ml考馬斯亮藍(lán)充分混勻，靜置考馬斯亮藍(lán)充分混勻，靜置5min5min，在在595nm595nm處，以對照調(diào)消光度處，以對照調(diào)消光度0 0，測量樣品吸光度。，測量樣品吸光度。蛋白酶活力的計(jì)算：蛋白酶活力的計(jì)算：蛋白酶活力單位【蛋白酶活力單位【U U】= OD595nm = OD595nm * * K K * * N NK-100K-100除以絡(luò)氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上除以絡(luò)氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線上100mg/ml100mg/ml對應(yīng)的對應(yīng)的OD595nmOD595nm值值N-N-酶液稀釋倍數(shù)酶

11、液稀釋倍數(shù)實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程（1 1）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線取取7 7支支試管，依次分別加入試管，依次分別加入0.00.0、0.100.10、0.150.15、0.200.20、0.300.30、0.400.40、0.50mL0.50mL的牛的牛血清蛋白溶液，用水補(bǔ)足到血清蛋白溶液，用水補(bǔ)足到0.5mL0.5mL，每管再加，每管再加5mL5mL染色液，立即搖勻，置于室溫染色液，立即搖勻，置于室溫下下5min5min，然后測定在波長，然后測定在波長595nm595nm下的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。下的吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2 2）生姜蛋白酶含量的測定生姜蛋白酶含量的測定吸取吸取0.5ml0.

12、5ml樣品提取液于試管中，加入樣品提取液于試管中，加入5ml5ml考馬斯亮藍(lán)考馬斯亮藍(lán)G250G250染色液，充分混勻，染色液，充分混勻，靜置靜置5min5min，測量吸光度（，測量吸光度（OD595nmOD595nm），記錄結(jié)果，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蛋白質(zhì)濃度），記錄結(jié)果，查標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蛋白質(zhì)濃度 X X（g/ml)g/ml)（3 3）生姜蛋白酶含量計(jì)算）生姜蛋白酶含量計(jì)算生姜蛋白酶含量（生姜蛋白酶含量（g/mlg/ml）= =X X* *提取液的總體積提取液的總體積/ /樣品鮮重（樣品鮮重（g)g)實(shí)驗(yàn)過程實(shí)驗(yàn)過程1 1、試劑的配置、試劑的配置30%30%分離膠貯液；分離膠貯液；10%10%濃縮

13、膠貯液；分離膠緩沖液濃縮膠貯液；分離膠緩沖液濃縮膠緩沖液；電泳緩沖液；濃縮膠緩沖液；電泳緩沖液；20%20%過硫酸銨溶液過硫酸銨溶液1%TEMED1%TEMED；0.2mol/L,pH7.20.2mol/L,pH7.2磷酸緩沖液磷酸緩沖液1mol/L HCl1mol/L HCl；10%SDS10%SDS；樣品溶解液樣品溶解液染色液；染色液；脫色液脫色液2 2、分離膠的制備、分離膠的制備（1 1）安裝電泳槽）安裝電泳槽（2 2）凝膠的制備（先配置分離膠，再配置濃縮膠）凝膠的制備（先配置分離膠，再配置濃縮膠）（3 3）灌膠）灌膠（4 4）樣品處理）樣品處理 待測蛋白質(zhì)樣品處理：獲得的蛋白質(zhì)樣品待測

14、蛋白質(zhì)樣品處理：獲得的蛋白質(zhì)樣品5050l,l,再加入再加入2x2x樣品緩沖液樣品緩沖液5050l l混勻，在混勻，在100100水浴中煮沸水浴中煮沸5min5min。（5 5）加樣）加樣待樣品冷卻后，用微量進(jìn)樣器吸取待樣品冷卻后，用微量進(jìn)樣器吸取30-40l30-40l樣品，按號(hào)依次加入樣品槽，使樣品，按號(hào)依次加入樣品槽，使樣品沉降在凝膠面上。樣品沉降在凝膠面上。（6 6）電泳）電泳（7 7）剝膠）剝膠（8 8）染色以及脫色）染色以及脫色 取下電泳后的凝膠板，放入染色液中染色取下電泳后的凝膠板，放入染色液中染色1h1h，倒回染色液，加入脫色，倒回染色液，加入脫色液，脫液液，脫液4-8h4-8h，其間更換脫色液，其間更換脫色液3-43-4次。將凝膠浸于水中或固定在次。將凝膠浸于水中或固定在20%20%甘油中甘油中或抽干，干燥后成膠片保存或拍照?；虺楦?，干燥后成膠片保存或拍照。3 3