樣本前期處理及HE染色-趙恒

1、1沈陽佰創(chuàng)生物技術(shù)有限公司沈陽佰創(chuàng)生物技術(shù)有限公司樣本的前期處理及樣本的前期處理及HE染色染色制作人：趙恒制作人：趙恒日日 期：期：2014-12-30注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1、植物材料選擇時(shí)須盡可能不損傷植物體或所需要的部分 動(dòng)物材料取用時(shí)常對動(dòng)物施以麻醉，常用的麻醉劑有氯 仿和乙醚，或?qū)?dòng)物殺死后迅速取出所需要的組織2、取材必須新鮮，這一點(diǎn)對于從事細(xì)胞生物學(xué)研究尤為重 要，應(yīng)該盡可能割取生活著的組織塊，并投入固定液3、切取材料時(shí)刀要銳利，避免因擠壓細(xì)胞使其受到損傷4、切取的材料應(yīng)該小而薄，便于固定劑迅速滲入內(nèi)部。一 般厚度不超過2mm，大小不超過55mm22固定液的性質(zhì)和條件固定液的性質(zhì)和條件1

2、、能迅速滲入組織，使組織細(xì)胞形態(tài)在短期內(nèi)不至于有 較大變化2、固定液有相當(dāng)?shù)臐B透力，對組織各部分的滲透力相等，可使組織內(nèi)外完全固定3、使組織細(xì)胞不至于因固定而引起人為的改變4、盡可能避免固定劑使組織膨脹或收縮5、使組織達(dá)到一定硬度，獲得較佳的折光率和對染料具 有較強(qiáng)的親合力。固定劑種類固定劑種類單純固定劑 ：10%甲醛、 4%多聚甲醛 、飽和的苦味酸溶 液 、冰醋酸 、鋨酸 混合固定劑 ：Bouin氏固定液 、Zenker液（PH2.3）、 Carnoy液 、改良Bouin氏固定液 固定的目的固定的目的1、防止組織溶解及腐敗，以保持組織和細(xì)胞與正常生活 時(shí)的形態(tài)相似2、使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂肪、糖

3、、酶等各種成分轉(zhuǎn)變?yōu)椴?溶性物質(zhì)，以保持它原有的結(jié)構(gòu)與生活時(shí)的相仿3、組織細(xì)胞內(nèi)的不同物質(zhì)經(jīng)固定后可以產(chǎn)生不同的折光 率，對染料也產(chǎn)生不同的親和力，造成光學(xué)上的差異，使得在生活情況下原來看不清楚的結(jié)構(gòu)變得清晰起 來，并使得細(xì)胞各部分容易著色，有利于區(qū)別不同的 組織成分4、固定劑的硬化作用，增加組織硬度，便于制片固定時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)固定時(shí)應(yīng)注意的事項(xiàng)1、固定液及被固定的組織必須新鮮；固定液的用量一般為 組織體積的1020倍2、固定時(shí)間視組織塊的種類、性質(zhì)、大小，固定液的種類 性質(zhì)、滲透力的強(qiáng)弱，固定時(shí)的溫度的高低，實(shí)驗(yàn)?zāi)康?等來決定3、防止被固定的組織因固定劑的作用而發(fā)生變形4、固定所用的固定液，

4、以新配的為好，放置過久會(huì)失效5、在固定期間搖動(dòng)組織或搖動(dòng)容器有利于固定液的滲入， 對長期固定的標(biāo)本，可經(jīng)常更換固定液6、固定時(shí)間太短，就會(huì)影響組織固定的效果時(shí)間太長，福爾馬林會(huì)產(chǎn)生一種酸，影響核的染色標(biāo)本經(jīng)二甲苯透明后，折射率改變，透明度提高，使得染上色的部位更清晰地顯示出來。步驟步驟流水沖洗4h 70乙醇2h 80 乙醇過夜 90 乙醇2h無水乙醇1h 無水乙醇1h 二甲苯15min 二甲苯15min較常用的透明劑是二甲苯、甲苯、苯、氯仿等較常用的透明劑是二甲苯、甲苯、苯、氯仿等1、二甲苯作用較快，透明力強(qiáng)，但組織塊在其中停留過久， 容易收縮變脆變硬2、甲苯的一般性質(zhì)與二甲苯相似。用法亦同，

5、唯沸點(diǎn)較低， 透明較慢，但不會(huì)使組織變脆3、苯的用法同于二甲苯，對組織的收縮作用小，但須警惕其 爆炸和吸入而引起中毒。4、氯仿適于大塊組織的透明注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1、透明時(shí)間應(yīng)由組織大小而定，般各級停留時(shí)間在5min 至15min，在純二甲苯中應(yīng)更換2次，總時(shí)間則以不超過 1h為宜2、材料經(jīng)過透明，會(huì)顯示出前一步脫水的效果如何，若脫 水徹底，組織則顯現(xiàn)透明狀態(tài)，如組織中有白色云霧狀 說明脫水不凈，須返工處理，但返工的效果往往不好3、使用二甲苯透明時(shí)，應(yīng)避免其揮發(fā)和吸收空氣中的水分 并保持其無水狀態(tài)1、組織經(jīng)過脫水透明處理后浸蠟4h，然后進(jìn)行包埋2、浸蠟須在恒溫箱中進(jìn)行，恒溫箱的溫度調(diào)節(jié)至高于石

6、蠟熔點(diǎn)3度切片厚薄不勻切片厚薄不勻原 因： 1、切片機(jī)有毛病 2、夾刀不當(dāng)，刀的傾角太大 3、未旋緊標(biāo)本臺螺旋 4、石蠟塊過硬解決辦 法 1矯正切片機(jī)裝置 2對癥治療 3旋緊螺旋 4將石蠟塊在水中浸泡材料發(fā)生裂隙破碎或脫落材料發(fā)生裂隙破碎或脫落原 因： 1、脫水不干凈 2、有透明劑殘留 3、石蠟透入時(shí)，溫度過高或時(shí)間過長 4、由于脫水劑和透明劑的影響，使組織變硬發(fā)脆 5、材料太硬或太粗補(bǔ) 救 辦 法 ： 1、無法彌補(bǔ) 2、增加浸蠟時(shí)間，重新包埋 3、無法補(bǔ)救 4、用正丁醇、叔丁醇和二氧六環(huán)等進(jìn)行脫水和透明 5、在蠟塊表面涂一薄層火棉膠溶液 1、直接展片法：在載玻片上滴加幾滴蒸餾水，然后把切片

7、鋪在小滴上面，用酒精燈在載玻片下面加熱，待完全展 平，傾斜載玻片，倒棄多余水分，同時(shí)擺正切片。 2、溫水漂浮法：用恒溫水浴箱，先使水溫保持在42，使 切好的石蠟切片漂浮在溫水中受熱后及在表面張力的作 用會(huì)自然平整地展開，必要時(shí)可用眼科鑷輕輕拔開，然 后撈片，并及時(shí)編號。 展好的切片放在64恒溫烤箱中4h，烤干備用。 包埋模具包埋模具 染色缸染色缸 切片盒切片盒切片機(jī)切片機(jī) 蘇木精 伊紅染色法簡稱HE染色法 ，石蠟切片技術(shù)里常用的染色法之一 。S蘇木精染液為堿性 ，主要使細(xì)胞核內(nèi)的染色質(zhì)與胞質(zhì)內(nèi)的核糖體著紫藍(lán)色 ；伊紅為酸性染料 ，主要使細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外基質(zhì)中的成分著紅色 。HE染色法是組織學(xué)、胚

8、胎學(xué)、病理學(xué)教學(xué)與科研中最基本、使用最廣泛的技術(shù)方法。染色步驟染色步驟1、64烤片30min2、脫蠟至水（二甲苯各15min，無水乙醇各5min，90、80、70乙醇各1min）3、蒸餾水浸洗3min4、蘇木素染3min5、鹽酸酒精分化6、自來水返藍(lán)15min7、伊紅染色30min8、脫水（70、80、90乙醇各30s，無水乙醇各2min，二甲苯各15min）9、封片鏡檢脫蠟： 切片中白色的區(qū)域脫蠟不徹底，染色液由于石蠟斑點(diǎn)的殘留而不能滲透著色。原因：原因：烤( 烘) 片溫度太低，脫蠟前沒有充分烤( 烘) 干。 二甲苯脫蠟時(shí)間不足， 或二甲苯使用過久，造成脫蠟不盡。對策：對策：切片需退回到脫蠟

9、步驟，延長脫蠟時(shí)間，或跟換二甲苯，重新染色。染色：蘇木素著色原因：原因：染色時(shí)間短；蘇木素過度氧化，失去染色能力；分化時(shí)間過長。 蘇木素染色太淺，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)顏色對比度差。對策：對策：切片重新染色。 細(xì)胞核過染， 核膜、核仁等不清晰， 細(xì)胞質(zhì)( 尤其是皮膚上皮細(xì)胞) 含有大量的細(xì)胞核染色液蘇木精， 導(dǎo)致細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比例失調(diào)。原因：原因：與圖2相反，染色液時(shí)間過長、切片太厚、分化步驟時(shí)間太短。對策：對策：如果切片不是因?yàn)樘?，脫色、漂白、重新染色?對于染色和分化時(shí)間做些適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。若太厚則需要重新切片。 切片細(xì)胞核棕色， 表明蘇木精沒有充分藍(lán)化， 或蘇木精過度氧化失去染色能力原因：原因：蘇

10、木精染色液過度氧化和切片在蘇木精染液染色后返藍(lán)不足。對策：對策：染色前檢查蘇木精染色液的染色能力，過渡氧化，應(yīng)及時(shí)更換。其次，在蘇木精染色后， 給切片以足夠的藍(lán)化時(shí)間。染色后有雜質(zhì)原因：原因：蘇木精染色液中的金屬膜，黏附在玻片上。對策：對策：每天染色前仔細(xì)過濾蘇木精染色液，或建議使用半氧化蘇木精染色液。伊紅著色 切片中央?yún)^(qū)域伊紅染色不均勻， 可能為弱堿性溶液殘留導(dǎo)致伊紅拒染所致原因：原因：伊紅染液的pH 值可能大于5 ；也可能是藍(lán)化液殘留過多；切片太?。换蚯衅?jīng)伊紅染色后在乙醇脫水時(shí)間過長。對策：對策：檢查伊紅染液的pH值，用乙酸將其調(diào)節(jié)在4.6-5.0 之間，使伊紅染色色彩艷麗。確保每次藍(lán)化

11、后，用自來水沖干凈。檢查切片的厚度。脫水時(shí)不要讓切片在低濃度乙醇停留時(shí)間過長， 因?yàn)楹嗟牡蜐舛纫掖紩?huì)將伊紅的顏色分化掉。原因：原因：伊紅染色液濃度太高；切片在伊紅染色時(shí)間過長；切片在伊紅染色后經(jīng)乙醇脫水步驟時(shí)過的太快， 而使乙醇分化伊紅的作用不能產(chǎn)生。對策：對策：適當(dāng)稀釋伊紅染色液，減少伊紅染色時(shí)間，或者使切片在乙醇脫水等步驟時(shí)，停留時(shí)間相對均勻。同樣， 也要檢查切片的厚度是否合適。 伊紅深染導(dǎo)致細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)沒有層次，缺乏對比 在顯微鏡下呈現(xiàn)大量水珠或云霧狀改變原因：原因：切片經(jīng)梯度乙醇處理后沒有完全脫水， 導(dǎo)致二甲苯透明中性樹膠封固后殘留大量水分。也可能是封片的時(shí)候出現(xiàn)的氣泡。對策：對策：移去蓋玻片， 用二甲苯溶解封固劑如中性樹膠。將切片置入新鮮的無水乙醇換幾道。待切片重新脫水完全后，用新二甲苯透明， 中性樹膠封固。所有用于脫水和透明的液體，在使用一定時(shí)間以后，應(yīng)即時(shí)更換。將切片浸如二甲苯中，重新封片。u封片：蓋玻片上有封固劑所致切片組織模糊不清原因：原因：蓋玻片上可能有封固切片的封固劑。對策：對策：移去蓋玻片， 重新用干凈的蓋玻片封片。 封片后鏡下則會(huì)出現(xiàn)類似色素的點(diǎn)狀結(jié)晶或類似“裸核”樣的改變原因：原因：切片封片前放置在空氣中時(shí)間太長， 以至于二甲苯揮發(fā)切片干燥所致。對策：對策：移去組織切片上的蓋玻片和封固