動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測(cè)定not;—紙片擴(kuò)散法編制說(shuō)明

1、動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測(cè)定紙片擴(kuò)散法編制說(shuō)明一、任務(wù)來(lái)源本標(biāo)準(zhǔn)是根據(jù)國(guó)家質(zhì)檢總局下達(dá)的2011年度行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)修訂計(jì)劃項(xiàng)目，項(xiàng)目編號(hào)為：2011B522r。由上海出入境檢驗(yàn)檢疫局進(jìn)行修訂。二、修訂意義抗菌藥物是目前人類和獸醫(yī)臨床使用最廣泛的抗感染藥物，在治療與控制人畜傳染病方面起著重要的作用。在畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中也常常使用抗生素來(lái)提高動(dòng)物的抗病能力，促進(jìn)生長(zhǎng)。但隨著抗生素的不斷應(yīng)用，細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性逐年上升，耐藥菌的產(chǎn)生日趨增多，傳播日漸迅速，其嚴(yán)重性已不容忽視。動(dòng)物源性細(xì)菌的耐藥性不但和畜牧業(yè)生產(chǎn)有著十分密切的聯(lián)系，更直接關(guān)系人類的健康。控制動(dòng)物源性細(xì)菌的耐藥性的產(chǎn)生及傳播是解決人類日趨嚴(yán)重

2、的耐藥性問(wèn)題中的重要環(huán)節(jié)，也是目前國(guó)際社會(huì)的共識(shí)。現(xiàn)行的SN/T1944-2007動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測(cè)定紙片擴(kuò)散法于2007-08-06發(fā)布，2008-03-01實(shí)施，由上海出入境檢驗(yàn)檢疫局負(fù)責(zé)起草，標(biāo)準(zhǔn)主要參考了美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute,CLSI)的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)第十六版補(bǔ)充說(shuō)明M100-S16(2006)和抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法操作標(biāo)準(zhǔn)M02-A9(2006)的相關(guān)內(nèi)容。為符合和適應(yīng)抗菌藥物臨床應(yīng)用和研究進(jìn)展，CLSI對(duì)解釋標(biāo)準(zhǔn)M100每年進(jìn)行更新，操作標(biāo)準(zhǔn)M02每3年進(jìn)行更新。到20

3、13年為止，M100已更新至第23版(M100-S23,2013),M02更新至第11版(M02-A11,2012)。而CLSI針對(duì)獸用藥臨床的動(dòng)物來(lái)源細(xì)菌的抗菌藥物敏感性試驗(yàn)擴(kuò)散法和稀釋法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)更新至第3版(M31-A3，2008)。隨著近年來(lái)抗菌藥物耐藥性的發(fā)展，新耐藥機(jī)制的出現(xiàn)和用藥方式的改變，以及法律法規(guī)層面對(duì)抗生素使用的新規(guī)定，從2007年至今，CLSI系列標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)內(nèi)容較原先行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)參考的內(nèi)容已有不少的改變。為適應(yīng)出入境檢驗(yàn)檢疫工作與時(shí)俱進(jìn)的需要，按照國(guó)家認(rèn)監(jiān)委關(guān)于出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)復(fù)審修訂計(jì)劃項(xiàng)目的批復(fù)意見(jiàn)，參考CLSI標(biāo)準(zhǔn)最新版本內(nèi)容，按GB/T1.1、GB/T1.2要

4、求，對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行文本格式及內(nèi)容的修訂。三、修訂依據(jù)1. GB/T1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)規(guī)則2. CLSIM100-S23抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)-第二十三版及補(bǔ)充說(shuō)明3. CLSIM02-A11抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法操作標(biāo)準(zhǔn)-第十一版4. CLSIM31-A3抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法操作標(biāo)準(zhǔn)-第三版5.SN/T1944-2007動(dòng)物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測(cè)定紙片擴(kuò)散法四、修訂內(nèi)容本標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)CLSIM100-S23和CLSIM02-A11與原CLSIM100-S16和CLSIM02-A9之間的更新點(diǎn)進(jìn)行了修訂，增加了CLSIM31-A2的規(guī)定要求和技

5、術(shù)內(nèi)容，并按照GB/T1.1-2009規(guī)范了文本格式。本標(biāo)準(zhǔn)對(duì)SN/T1944-2007主要修訂如下：按照GB/T1.1-2009標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫(xiě)，規(guī)范了文本格式。檢測(cè)方法部分按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)最新標(biāo)準(zhǔn)CLSIM100-S23（2013）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)和CLSIM02-A11（2012）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂。具體內(nèi)容見(jiàn)表1。附錄部分按美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)最新標(biāo)準(zhǔn)CLSIM100-S23（2013）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)和CLSIM31-A3（2008）動(dòng)物源性細(xì)菌抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了修訂?？紤]到標(biāo)準(zhǔn)的適用

6、范圍為動(dòng)物源性細(xì)菌，對(duì)原附錄中與動(dòng)物源性細(xì)菌耐藥性無(wú)關(guān)的部分進(jìn)行刪減，動(dòng)物源性細(xì)菌耐藥性特有的部分及特定耐藥機(jī)制的測(cè)定進(jìn)行了增補(bǔ)。具體內(nèi)容見(jiàn)表1。表1.標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容區(qū)別區(qū)別SN/T1944-2007本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范性引用文件SN0170出口食品沙門(mén)氏菌屬（包括亞利桑那菌）檢驗(yàn)方法GB4789.4食品微生物學(xué)檢驗(yàn)沙門(mén)氏菌檢驗(yàn)術(shù)語(yǔ)和定義中介：被測(cè)細(xì)菌對(duì)常規(guī)劑量的抗生素的反應(yīng)率較敏感菌株低，其生長(zhǎng)繁殖可被咼于常規(guī)劑量的抗生素濃度抑制。中介：常規(guī)劑量的抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的療效低于敏感菌株，藥物在生理濃集部位有效或可使用高于正常劑量得藥物進(jìn)行治療。耐藥：被測(cè)細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖不能被常規(guī)劑量的抗生素所抑制。耐藥：細(xì)菌不能被

7、常規(guī)劑量抗菌藥物達(dá)到的濃度所抑制，和（或）證明抑菌環(huán)直徑落在某些特定的細(xì)菌耐藥機(jī)制范圍內(nèi)。無(wú)非敏感Unsusceptible（US）:用在僅有敏感解釋，無(wú)中介或耐藥解釋的細(xì)菌。受試菌株抑菌環(huán)直徑低于敏感解釋折點(diǎn)時(shí)稱為不敏感。設(shè)備和材料在5測(cè)定方法中的5.3儀器和設(shè)備4設(shè)備和材料培養(yǎng)基與試劑在5測(cè)定方法中的5.2試劑和材料5培養(yǎng)基與試劑列出了培養(yǎng)基名稱樣品米集第4節(jié)第6節(jié)測(cè)定方法第5節(jié)第7節(jié)5.5沙門(mén)氏菌的增菌培養(yǎng)、分離和鑒定：按SN0170進(jìn)行。7.2沙門(mén)氏菌的增菌培養(yǎng)、分離和鑒定：按GB4789.3進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室自制抗生素紙片方法見(jiàn)，刪除多片加藥法。商品化的抗生素藥物紙片見(jiàn)，增加使用注意事項(xiàng)。

8、制備菌液：推薦順序?yàn)榕囵B(yǎng)法、振搖法、懸浮法。推薦順序?yàn)閼腋》?、培養(yǎng)法、振搖法。貼藥物紙片貼藥物紙片中增加細(xì)化要求：一般直徑150mm勺瓊脂平板應(yīng)放置不超過(guò)12個(gè)紙片，或直徑100mm勺平板放置不超過(guò)5個(gè)紙片。結(jié)果觀察結(jié)果解釋中增加解釋：在抑菌圈邊緣的只能在放大鏡下觀察到的微小菌落的生長(zhǎng)可忽略不計(jì)。結(jié)果及判斷67.5結(jié)果及判斷：增加了非敏感(US報(bào)告要求。增加了特定耐藥機(jī)制的判定要求。培養(yǎng)基和試劑附錄A附錄A:增加了A.2緩沖蛋白胨水(BPW)細(xì)菌的抑菌環(huán)直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)附錄B附錄B:刪除了羧芐西林、美洛西林、氨芐西林/克拉維酸、哌拉西林/它唑巴坦、頭孢克洛、頭孢尼西、頭孢呋辛鈉、頭孢美唑、頭孢哌酮

9、、頭孢唑肟、頭孢地尼、拉氧頭孢、碳氯頭孢、頭孢丙烯、頭孢布烯、奈替米星、地紅霉素、多四環(huán)素、米諾環(huán)素、加替沙星、吉米沙星、洛美沙星、依諾沙星、格帕沙星、斯帕沙星、萘啶酸、西諾沙星、氟洛沙星、甲氧芐氨嘧啶、呋喃妥因、磷霉素和替拉考丁的解釋標(biāo)準(zhǔn)；修改了哌拉西林、頭孢唑林、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢唑肟、頭孢曲松、頭孢他啶、多利培南、氨曲南、泰利霉素、四環(huán)素和環(huán)丙沙星的解釋標(biāo)準(zhǔn)；增加了青霉素/新生霉素、頭孢洛林、厄他培南、莫西沙星、吡利霉素和氯苯尼考的解釋標(biāo)準(zhǔn)。細(xì)菌耐藥性檢測(cè)的質(zhì)里控制附錄C附錄C:質(zhì)控菌株的抑菌環(huán)直徑允許范圍根據(jù)抑菌環(huán)直徑解釋標(biāo)準(zhǔn)的更新而作相應(yīng)更新，并增加了氨芐西林和哌拉西林的大腸桿

10、菌ATCC35218允許范圍推薦的抗生素分組附錄D附錄D動(dòng)物源性細(xì)菌耐藥性檢測(cè)中推薦挑選的抗菌藥物分組：增加了動(dòng)物專用的常規(guī)報(bào)告試驗(yàn)藥物分組；將匍萄球菌屬改為金黃色匍萄球菌。常規(guī)試驗(yàn)的藥物改為通用人類臨床標(biāo)準(zhǔn)的常規(guī)報(bào)告試驗(yàn)藥物；金黃色葡萄球菌增加阿奇霉素/克拉霉素/紅霉素、克林霉素、甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑；腸桿菌科刪除頭孢唑啉；沙門(mén)氏菌喹諾酮類限定為環(huán)丙沙星或左氧沙星。選擇試驗(yàn)的藥物改為通用人類臨床標(biāo)準(zhǔn)的選擇報(bào)告試驗(yàn)藥物；腸桿菌科刪除氨芐西林/克拉維酸、哌拉西林/它唑巴坦、部分頭孢類抗生素，增加頭孢噻吩、四環(huán)素、磺胺和亞胺培南；沙門(mén)氏菌刪除頭孢他啶、頭孢哌酮和頭孢唑肟；金黃色葡萄球菌刪除泰利

11、霉素、阿奇霉素/克拉霉素/紅霉素、克林霉素和甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲惡唑，增加氨芐西林、慶大霉素、頭孢噻吩、磺胺、四環(huán)素和利福平。補(bǔ)充試驗(yàn)的藥物改為選擇性報(bào)告的補(bǔ)充試驗(yàn)藥物；腸桿菌科僅保留氨曲南、頭孢他啶和氯霉素；金黃色葡萄球菌刪除呋喃妥因、洛美沙星、諾氟沙星、磺胺異惡唑，增加泰利霉素特定耐藥機(jī)制的測(cè)定與判定附錄E產(chǎn)超廣譜B-內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌和耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的測(cè)定與判定附錄E特定耐藥機(jī)制的測(cè)定與判定：增加了E.2產(chǎn)碳青霉烯酶的腸桿菌的測(cè)疋；E.3耐甲氧西林/本唑西林的金黃色葡萄球菌（MRSA的測(cè)定中刪除本唑西林，增加頭孢洛林，更新頭孢西丁的判斷標(biāo)準(zhǔn)和質(zhì)控要求附錄表注刪除“本表內(nèi)容摘自

12、美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法操作標(biāo)準(zhǔn)和美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所（CLSI）抗菌藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)。五、驗(yàn)證測(cè)試1室內(nèi)驗(yàn)證以標(biāo)準(zhǔn)菌株及38株禽源性大腸桿菌對(duì)6種抗生藥物的耐藥性檢測(cè)比較擴(kuò)散法和稀釋法之間的符合程度。結(jié)果見(jiàn)表2和表3。表2:標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)6種抗菌藥物的耐藥測(cè)定:抗菌藥物大腸桿菌ATCC25922金黃色葡萄球菌ATCC25923紙片擴(kuò)散法微量稀釋法紙片擴(kuò)散法微量稀釋法抑菌環(huán)直徑判疋MIC判疋抑菌環(huán)直徑判定MIC判疋氨卞西林21mms4.0g/mLs33mms0.25g/mLs頭孢西丁26mms8g/mLs30mms8g/mLs頭孢噻肟32mms

13、8g/mLs30mms8g/mLs慶大霉素20mms0.5g/mLs21mms0.5g/mLs環(huán)丙沙星32mms0.25卩g/mLs25mms0.5g/mLs甲氧卞氨嘧啶/磺胺甲惡唑26mms2/38卩g/mLs26mm敏感2/38g/mLss:敏感表3:38株禽源性大腸桿菌對(duì)3種抗菌藥物的耐藥性測(cè)定:抗菌藥物方法試驗(yàn)結(jié)果耐藥（R）菌株數(shù)/%符合率%中介（1）菌株數(shù)/%符合率%敏感（S）菌株數(shù)/%符合率%氨卞西林紙片擴(kuò)散法32/84.21001/2.6/5/13.183.3微量稀釋法32/84.20/06/15.7頭孢噻肟紙片擴(kuò)散法2/5.21000/0/36/94.7100微量稀釋法2/5.

14、20/036/94.7環(huán)丙沙星紙片擴(kuò)散法17/44.71001/2.6/20/52.695.3微量稀釋法17/44.70/021/55.2紙片擴(kuò)散法與藥物敏感性試驗(yàn)參考方法稀釋法之間有很好的一致性，耐藥率的符合率達(dá)到100%氨芐西林和環(huán)丙沙星各有一株大腸桿菌的結(jié)果為“中介（I）”，而用微量稀釋法測(cè)定結(jié)果均為“敏感（S）”，符合CLSI關(guān)于“中介”的解釋標(biāo)準(zhǔn)。2、室間驗(yàn)證江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心、浙江出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心、國(guó)家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（上海）和上海市食品藥品檢驗(yàn)所應(yīng)邀對(duì)本修訂標(biāo)準(zhǔn)的部分技術(shù)內(nèi)容進(jìn)行了驗(yàn)證測(cè)試。內(nèi)容包括標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株的紙片擴(kuò)散法和微量稀釋法比對(duì)，結(jié)果匯總見(jiàn)表4;隨機(jī)編號(hào)的3株大腸桿菌未知菌株和3株金黃色葡萄球菌未知菌株同時(shí)采用紙片擴(kuò)散法和微量稀釋法比對(duì)檢測(cè)，其中有1株耐甲氧西林/苯唑西林的金黃色葡萄球菌（MRSA和1株產(chǎn)超廣譜B內(nèi)酰胺酶的大腸桿菌（ESBL，結(jié)果匯總見(jiàn)表5。表4標(biāo)準(zhǔn)菌株對(duì)抗菌藥物的耐藥測(cè)定驗(yàn)證單位大腸桿菌的符合率%金黃色葡萄球菌的符合率%1100%100%2100%100%3100%1