復方骨肽原溶液高分子量物質(zhì)檢查方法研究 20140604

1、復方骨肽原溶液高分子量物質(zhì)檢查方法研究常州方圓制藥有限公司 芳園QC小組一、 概況（一）產(chǎn)品介紹復方骨肽原溶液為淡黃褐色至黃褐色澄明液體。主要為健康的豬或牛四肢骨與全蝎經(jīng)提取制成的滅菌水溶液，主要活性成分為多肽。目前，以復方骨肽原溶液為原料制成的制劑臨床上主要用于骨折的治療，以及風濕、類風濕性關節(jié)炎等疾病的輔助治療。（二）QC小組簡介1、小組概況芳園QC小組成立于2015年8月，由檢測中心人員本著自愿參加的原則組成，自成立以來一直以“提高產(chǎn)品質(zhì)量控制水平，完善質(zhì)量管理體系”為宗旨，不斷進行有目的、有計劃的QC創(chuàng)新活動。表1 小組概況表小組名稱芳園QC小組成立時間2015.08課題名稱復方骨肽原

2、溶液高分子量物質(zhì)檢查方法研究課題類型創(chuàng)新型注冊號小組長王亮小組成員4人活動日期2015.092016.03出勤率100%2、小組成員表表2 小組成員一覽表序號姓名文化程度職務職稱組內(nèi)分工1王亮本科儀器組班長助理工程師組長數(shù)據(jù)整理2酈莎莎大專檢驗員助理工程師具體實施數(shù)據(jù)分析3宋曉霞本科檢驗員助理工程師具體實施數(shù)據(jù)分析4王薇本科檢驗員助理工程師具體實施成果發(fā)表人3、小組活動計劃表3 活動計劃表活動內(nèi)容和階段9月10月11月12月1月2月選題、培訓P提出方案并制定最佳方案制訂對策對策實施D效果確認C鞏固措施A總結(jié)和展望二、選題理由復方骨肽原溶液中的高分子量物質(zhì)是引起過敏的主要物質(zhì)，復方骨肽原溶液的生

3、產(chǎn)工藝中，有對其高分子量物質(zhì)過濾截留裝置，為了提高產(chǎn)品的安全性，控制產(chǎn)品中高分子量物質(zhì)，增加高分子量物質(zhì)檢查項，并根據(jù)實際樣品的測定情況，暫定供試品中分子量大于10000的組分不得過5.0%。 三、目標設定及可行性分析（一）目標設定建立復方骨肽原溶液高分子量物質(zhì)檢驗方法，以達到進一步控制產(chǎn)品質(zhì)量的目的。（二）可行性分析公司支持：公司多次派檢驗員參加各類檢驗知識和儀器操作等方面的培訓，多次舉辦相關會議。技術保障：小組成員具有多年的儀器分析經(jīng)驗，且具有較強的開拓創(chuàng)新意識。小組成員4人中3人本科學歷，1人大專學歷，專業(yè)均為藥物分析等相關專業(yè)，理論基礎扎實。小組成員具有嚴謹細致的工作態(tài)度，優(yōu)良的團隊合

4、作精神，對于疑難問題能集體共謀對策。儀器保障：目標可以實現(xiàn)！具備研究和檢測所需的液相色譜儀、超純水制備儀等。且這些設備均為知名品牌的廠家。四、提出方案并確定最佳方案（一）提出方案1、檢測方法的初步確定檢驗方法確定采用分子排阻色譜法對復方骨肽原溶液中分子按照大小進行分離檢測。分子排阻色譜法一般選用親水硅膠或凝膠為填充劑，這些凝膠表面分布著不同孔徑尺寸的孔，樣品分子進入色譜柱后，它們中的不同組分按其分子大小進入相應的孔內(nèi)，大于所有孔徑的分子將不能進去，在色譜柱中保留比較差，最早被流動相洗脫出去，表現(xiàn)為保留時間較短；小于所有孔徑的分子能自由進入填充劑，滯留時間較長，表現(xiàn)為保留時間較長，其余的分子按大

5、小依次被洗脫。2、色譜柱選擇選擇供試品分子大小相適應的色譜柱填充劑，粒徑相對小，pH耐受力符合要求。3、流動相的選擇多肽液相色譜通常使用的流動相為含酸性或中性介質(zhì)的甲醇-水或乙腈-水，或用甲醇與緩沖鹽溶液做流動相。在測定多肽時如果出峰效果不理想的話，可以再流動相中加入少量的三氟乙酸可改善出峰效果。4、系統(tǒng)適用性包括理論塔板數(shù)、分離度、靈敏度、重復性、拖尾因子等。5、結(jié)果計算經(jīng)色譜分離的多肽分子通常以線性形式分離，以標準物質(zhì)分子量（M）的對數(shù)對應的保留時間（t）制得標準曲線回歸方程lgM=a+bt，供試品中大于10000分子量的分布時間即可以計算，以峰面積歸一化法對多肽分布情況進行積分，保留時間

6、前段為大于10000分子量多肽分布段，保留時間后段為小于10000分子量多肽分布段，計算出復方骨肽原溶液大于10000分子量組分含量。（二）制訂方案小組成員根據(jù)本部門目前現(xiàn)有HPLC級試劑的實際情況以及日常檢驗經(jīng)驗，對小組成員意見整理后制定了下列方案：方案內(nèi)容綜合分析評估結(jié)論可行性 (25分)合理性(25分)實施周期 (25分)分)預期效果(25分)分)總分 (100分)儀器選擇安捷倫高效液相色譜儀目前有兩臺，配置齊全，但使用頻繁，幾乎為其他產(chǎn)品專用。251010550不選島津高效液相色譜儀目前有一臺，配置齊全，但偶爾使用，頻次為2月/次。25 25 20 20 90 選擇色譜柱選擇TSK g

7、el G 2000SW剛性的球型硅膠為基質(zhì),在其表面通過共價鍵合親水基團而成，孔徑125Å，粒徑5m，7.8×300mm，耐受流速 0.5-1.0ml/min，分子量 5,000-150,000 ；pH 2.5-7.52020 20 1575不選Zenix SEC-100表面鍵合親水薄膜的硅膠，孔徑100Å，粒徑3m，7.8×300mm，耐受流速 0.5-1.0ml/min，分子量 100-100,000 ；pH 2-8.525252020 90選擇 通過總結(jié)，決定采用島津高效液相色譜儀，選用Zenix SEC-100色譜柱進行復方骨肽原溶液高分子量物質(zhì)

8、檢查方法的研究。五、制定對策方案分解對策目標措施地點人員完成日期色譜條件的確定選擇酸性或中性介質(zhì)的甲醇-水或乙腈-水為流動相，考慮添加三氟乙酸適量各標準物質(zhì)能較好分離，核糖核酸酶A理論塔板數(shù)應大于5000查閱資料選取最佳色譜條件液相室王亮2015.10.15系統(tǒng)適用性試驗設計適用性試驗溶液進行測試各標準物質(zhì)均完全分離，分離度應大于1.5配制適用性試驗溶液進行測試液相室王亮2015.10.20線性確定選擇對照溶液進樣以標準物質(zhì)分子量（M）的對數(shù)對應的保留時間（t）制得標準曲線回歸方程，相關系數(shù)大于0.99配制1份對照溶液，進樣，以峰面積和濃度作標準曲線，計算相關系數(shù)液相室王亮2013.11.30

9、重復性試驗選擇對照溶液進樣各標準物質(zhì)保留時間RSD2.0%配制含四種不同高分子量的標準物質(zhì)混合液進樣，計算各標準物質(zhì)保留時間RSD液相室王亮酈莎莎2013.12.20中間精密度試驗不同時間、不同人員測試RSD10%2名檢驗員、2臺氣相色譜儀對同一批樣品進行乙醇、乙酸乙酯殘留量的檢測液相室王亮酈莎莎2014.01.10六、對策措施對策一、確定色譜條件1、色譜條件色譜柱：DB-5， 30m×0.32mm×0.5m氣體流速：氮氣1.0ml/min（恒流模式）；氫氣30ml/min；空氣300ml/min；尾吹氣為氮氣30ml/min柱溫：50（保持3min）10/min8015/

10、min250（5min）進樣口溫度：150檢測器溫度：260分流比：1:1頂空條件： 頂空瓶溫度80；定量環(huán)溫度95；傳輸線溫度110；進樣瓶平衡時間25min；振搖off；增壓0.4min；定量環(huán)填充時間0.20min；定量環(huán)平衡時間0.10min；進樣時間1.00min；GC總循環(huán)時間35min。2、儀器梅特勒-托利多 AG285 分析天平、Agilent7890A系統(tǒng)，7694E頂空進樣器3、溶液配制(1) 稀釋液：甲苯:二甲亞砜 = 2:1(2) 對照貯備液： 精密稱取乙醇、乙酸乙酯各0.1g，加入100ml容量瓶（瓶內(nèi)預先加入約30ml稀釋液）中，用稀釋液定容至刻度，搖勻。 精密移取

11、溶液 10ml，置50ml容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，搖勻即得對照貯備液。(3)供試品溶液：精密稱取地氯雷他定供試品0.12g，置20ml頂空瓶中，精密加入3ml稀釋液，密封，溶解并搖勻。平行配制兩份。(4) 系統(tǒng)適用性溶液：精密移取對照貯備液3ml，置20ml頂空進樣瓶中密封，平行配制5份。按照上述色譜條件，取系統(tǒng)適用性溶液進樣，結(jié)果如下表：進樣次數(shù)12345峰面積RSD乙醇峰面積83.1484.7881.3979.4985.283.0%乙酸乙酯126.57128.48126.28123.75129.081.7%從上表看出，乙醇、乙酸乙酯峰面積的RSD均小于10%，達到了預期目標。對策二：

12、專屬性試驗定位溶液：用毛細管取乙醇、乙酸乙酯、甲苯、二甲亞砜各適量，分別置20ml頂空瓶中，密封備用。專屬性試驗溶液：精密移取稀釋液、對照液各3ml，置20ml頂空瓶中密封。按照測定條件分別用各定位溶液、稀釋液、對照液進樣，得到如下圖譜： 從上面各圖看出，各峰峰型對稱，乙醇、乙酸乙酯的分離度達到了22.91，遠遠大于1.5，并與甲苯、二甲亞砜完全分離，達到了預期目標。對策三：線性及范圍的確定精密稱取乙醇0.1050g、乙酸乙酯0.1009g，加入同一100ml容量瓶（瓶內(nèi)預先加入約30ml稀釋液）中，用稀釋液定容至刻度，搖勻，得線性試驗貯備液。按照下表的順序精密移取相應量的線性試驗貯備液于相應

13、的容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，再精密移取這些溶液3ml于20ml頂空瓶中，密閉，搖勻，得線性試驗系列溶液。濃度水平(%)濃度(g/ml)線性試驗貯備液(ml)容量瓶(ml)份數(shù)乙醇乙酸乙酯140294.00282.527253120252.00242.166253100210.00201.801050380168.00161.44850360126.00121.0865034084.0080.7245032042.0040.3625031021.0020.181503510.5010.090.5503用上述溶液進樣，每個濃度進樣三針，結(jié)果見下表：表4 乙醇檢驗結(jié)果記錄濃度水平乙醇濃度峰面積平

14、均峰面積信噪比5%10.501.910%21.009.329.323.720%42.0019.2919.4418.9719.239.240%84.0038.1436.8037.6337.5260%126.0057.3957.2055.8556.8180%168.0079.4074.4972.6175.50100%210.0091.4091.1291.0588.61120%252.00108.63104.34109.84107.60140%294.00118.22127.64129.78125.21表5 乙酸乙酯檢驗結(jié)果記錄濃度水平乙酸乙酯濃度峰面積平均峰面積信噪比5%10.092.110%20

15、.1811.8211.824.220%40.3624.1224.4323.9824.1810.240%80.7248.2547.3348.1647.9160%121.0873.2172.8371.9872.6780%161.4499.4996.7495.1597.13100%201.80119.64119.40119.92117.77120%242.16144.44140.65144.66143.25140%282.52166.82172.89173.76171.16以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，得到回歸方程和線性圖如下：從上述圖譜看出，乙醇在42.00g/ml294.00g/ml范圍內(nèi)，相

16、關系數(shù)為0.9992，乙酸乙酯在40.36g/ml282.52g/ml范圍內(nèi)，相關系數(shù)為0.9995，均大于0.99，達到了預期目標。對策四、檢測限的確定對線性試驗項下的圖表進行結(jié)果分析，將S/N =2時對應的濃度確定為檢測限，結(jié)果如下表：名稱S/N峰面積濃度乙醇1.94.5977110.50g/ml乙酸乙酯2.15.6050510.09g/ml從上表看出，乙醇的檢測限為10.50g/ml，乙酸乙酯的檢測限為10.09g/ml。對策五、回收率試驗配制80%、100%、120% 3個濃度水平的乙醇、乙酸乙酯對照溶液，加入已知乙醇、乙酸乙酯濃度的地氯雷他定樣品（20130801）中，每個濃度3份，

17、進樣測定，計算回收率，結(jié)果見下表：濃度水平樣品乙醇殘留(%)檢出乙醇含量(%)扣除樣品乙醇后的含量(%)理論含量(%)回收率(%)80%00.38160.38160.389497.990.42030.42030.3923107.150.39960.39960.3859103.54100%0.50850.50850.4903103.700.49010.49010.4891100.200.52910.52910.5001105.79120%0.57110.57110.587697.190.59610.59610.5874101.480.61540.61540.5942 103.56濃度水平樣品乙酸

18、乙酯殘留(%)檢出乙酸乙酯含量(%)扣除樣品乙酸乙酯后的含量(%)理論含量(%)回收率(%)80%0.12460.50790.38340.392997.570.53380.40920.3958103.390.52070.39610.3894101.71100%0.62340.49880.4947100.820.61860.49410.4936100.110.64590.52140.5047103.31120%0.70780.58330.592398.480.72280.59820.5927100.930.73900.61500.5996102.57從上表看出，乙醇、乙酸乙酯的回收率均在80%1

19、20%間，達到了預期目標。對策六、重復性試驗平行配制100%濃度水平的對照液6份，進樣，計算峰面積的RSD。結(jié)果見下表：序號乙醇峰面積乙酸乙酯乙醇RSD乙酸乙酯RSD191.40119.645.6%4.1%291.12119.40391.05119.92488.97118.73578.81108.16690.33120.75 從上表看出，乙醇峰面積的RSD為5.6%，乙酸乙酯峰面積的RSD為4.1%，均小于10%，達到了預期目標。對策七、中間精密度試驗在不同時間由2名檢驗員，分別在2臺氣相色譜儀(7890A、6890N)上，對同一批地氯雷他定（20130801）進行檢驗，每次試驗均配制6份供試

20、品溶液，計算乙醇、乙酸乙酯的含量，結(jié)果見下表：表6 同一檢驗員、不同儀器的檢驗結(jié)果樣品名稱色譜儀型號乙醇/乙酸乙酯含量(%)平均含量(%)不同儀器RSD(%)乙醇7890A00000006890N0000000乙酸乙酯7890A0.12990.12380.12900.12490.11800.13080.12610.56890N0.12650.12710.13220.12350.12000.12260.1253表7 同一檢驗員、同一儀器、不同時間的檢驗結(jié)果樣品名稱時間乙醇/乙酸乙酯含量(%)平均含量(%)不同時間RSD(%)乙醇2014.1.500000002014.1.90000000乙酸乙酯

21、2014.1.50.12900.12450.12550.12650.11950.13010.12650.42014.1.90.12550.12800.13200.12600.12050.12300.1258表8 同一儀器、不同檢驗員的檢驗結(jié)果樣品名稱檢驗員乙醇/乙酸乙酯含量(%)平均含量(%)不同人員RSD(%)乙醇王亮0000000酈莎莎0000000乙酸乙酯王亮0.12850.12550.12650.12400.12000.13000.12580.7酈莎莎0.12580.12600.12600.12800.12900.12650.1269從上表看出，乙醇均未檢出；乙酸乙酯的檢驗結(jié)果，同一檢驗員、不同儀器的RSD為0.5%，同一檢驗員、同一儀器、不同時間的RSD為0.4%，同一儀器、不同檢驗員的RSD為0.7% ，均遠小于10%，達到了預期目標。對策八、耐用性試驗通過改變流速、進樣口溫度、檢測器溫度，用對照液進樣，觀察出峰情況，結(jié)果如下：流速(ml/min)進樣口溫度()檢測器溫度()乙醇、乙酸乙酯分離度乙醇、乙酸乙酯、甲苯、二甲亞砜分離情況11.015026021.16完全分離21.215026022.81完全分離30.81