植物花藥培養(yǎng)及單倍體植株鑒定-2015

1、花藥培養(yǎng)：是指將未成熟的花藥接種是指將未成熟的花藥接種在人工培養(yǎng)基上分化成為植株的過(guò)程。在人工培養(yǎng)基上分化成為植株的過(guò)程。屬于器官培養(yǎng)。屬于器官培養(yǎng)。供體植株供體植株小孢子（小孢子（n）花培花培花粉植株花粉植株（n）雄核發(fā)育雄核發(fā)育自然加倍自然加倍人工加倍人工加倍純合植株純合植株DH（2n）一年內(nèi)獲得純系一年內(nèi)獲得純系常規(guī)育種需常規(guī)育種需4-6年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。年獲得純系，而小孢子培養(yǎng)僅需一年。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c原理原理：原理： 利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)利用組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)植物花藥進(jìn)行離體植物花藥進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生再生植株。通過(guò)形態(tài)觀察培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生再生植株。通過(guò)形態(tài)

2、觀察和染色體分析鑒定單倍體植株，作為新的和染色體分析鑒定單倍體植株，作為新的遺傳資源和選擇材料。遺傳資源和選擇材料。目的：目的：u掌握植物花藥離體培養(yǎng)技術(shù)；掌握植物花藥離體培養(yǎng)技術(shù)；u掌握單倍體植株鑒定的方法；掌握單倍體植株鑒定的方法；u了解單倍體育種的意義。了解單倍體育種的意義?；ㄋ幣囵B(yǎng)基本流程：花藥培養(yǎng)基本流程：預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）預(yù)處理花藥（物理或生理逆境）收集具有胚性小孢子的花藥收集具有胚性小孢子的花藥培養(yǎng)（充足的營(yíng)養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體培養(yǎng)（充足的營(yíng)養(yǎng)、合適的溫光、或條件培養(yǎng)）形成胚狀體胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上胚狀體轉(zhuǎn)移至固化培養(yǎng)基上”萌發(fā)萌發(fā)”形成小植株形成

3、小植株選擇合適的供體植株選擇合適的供體植株單倍體植株鑒定單倍體植株鑒定二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1 1、鏡檢花粉發(fā)育時(shí)期、鏡檢花粉發(fā)育時(shí)期2 2、花藥離體培養(yǎng)、花藥離體培養(yǎng) 2.1 2.1 取樣取樣 2.2 2.2 消毒消毒 2.3 2.3 接種接種 2.4 2.4 培養(yǎng)培養(yǎng)3 3、單倍體植株的鑒定、單倍體植株的鑒定三、實(shí)驗(yàn)器材三、實(shí)驗(yàn)器材材料：煙草花藥。材料：煙草花藥。試劑：試劑：MSMS培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、N6N6培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、B5B5培養(yǎng)基、培養(yǎng)基、酒精、酒精、2,4-D2,4-D、NAANAA、KTKT、蔗糖、醋酸洋紅、蔗糖、醋酸洋紅、蒸餾水。蒸餾水。儀器：電子天平、磁力加熱攪拌器、普儀器

4、：電子天平、磁力加熱攪拌器、普通光學(xué)顯微鏡、微波爐、通光學(xué)顯微鏡、微波爐、pHpH計(jì)、培養(yǎng)箱、計(jì)、培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、鑷子、剪刀、超凈工作臺(tái)、高壓滅菌鍋、鑷子、剪刀、解剖針、燒杯、試劑瓶、三角瓶、封口膜、解剖針、燒杯、試劑瓶、三角瓶、封口膜、橡皮筋、低溫冰箱。橡皮筋、低溫冰箱。四、實(shí)驗(yàn)步驟四、實(shí)驗(yàn)步驟1.1.適期花藥的選擇適期花藥的選擇 花藥中的花粉是由生殖細(xì)胞花藥中的花粉是由生殖細(xì)胞（體細(xì)胞）經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂而來(lái)，（體細(xì)胞）經(jīng)過(guò)減數(shù)分裂而來(lái)，其染色體只是體細(xì)胞中的一半，其染色體只是體細(xì)胞中的一半，如果通過(guò)一定的途徑將花粉培如果通過(guò)一定的途徑將花粉培養(yǎng)成植株，獲得單倍體植株。養(yǎng)成植株，

5、獲得單倍體植株。再經(jīng)過(guò)染色體加倍，得到純合再經(jīng)過(guò)染色體加倍，得到純合的二倍體，大大縮短育種進(jìn)程。的二倍體，大大縮短育種進(jìn)程。一般而言，單核期（第一次有絲一般而言，單核期（第一次有絲分裂前）對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)最敏感，為分裂前）對(duì)誘導(dǎo)反應(yīng)最敏感，為最佳培養(yǎng)期。最佳培養(yǎng)期。形成雙核后，在合適的條件下，形成雙核后，在合適的條件下，主要由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分裂產(chǎn)生胚狀體主要由營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞分裂產(chǎn)生胚狀體。 花粉發(fā)育時(shí)期：花粉發(fā)育時(shí)期： 被子植物的花粉發(fā)育可分為四分體期、單核期（小孢子期）、被子植物的花粉發(fā)育可分為四分體期、單核期（小孢子期）、二核期和三核期（雄配子期）二核期和三核期（雄配子期）4 4個(gè)時(shí)期。個(gè)時(shí)期。四分體時(shí)期四

6、分體時(shí)期單核靠邊期單核靠邊期花藥切片顯微觀察花藥切片顯微觀察花粉的發(fā)育花粉的發(fā)育 營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞生殖細(xì)胞生殖細(xì)胞精子精子四分體四分體: 醋酸洋紅染色醋酸洋紅染色四分體四分體: Alexanders 染色染色單核期單核期雙核期雙核期成熟花粉粒成熟花粉粒煙草花粉發(fā)育時(shí)期的檢測(cè)：煙草花粉發(fā)育時(shí)期的檢測(cè)： 一般將植物的花藥置于載玻片上壓碎，加一般將植物的花藥置于載玻片上壓碎，加1-21-2滴滴1%1%醋酸洋紅染色，再進(jìn)行鏡檢，以確定花粉發(fā)育時(shí)期。醋酸洋紅染色，再進(jìn)行鏡檢，以確定花粉發(fā)育時(shí)期。單核晚期單核晚期液泡液泡第一次有絲分裂后期第一次有絲分裂后期雙核早期雙核早期雙核中期雙核中期生殖核生殖核生殖核

7、生殖核營(yíng)養(yǎng)核營(yíng)養(yǎng)核處于不同發(fā)育階段的煙草花芽處于不同發(fā)育階段的煙草花芽 煙草花粉發(fā)育時(shí)期的確定煙草花粉培養(yǎng)，選擇單核靠邊期的花藥，培養(yǎng)效果最好。煙草花粉培養(yǎng)，選擇單核靠邊期的花藥，培養(yǎng)效果最好。從煙草花的外部形態(tài)變化來(lái)看，從煙草花的外部形態(tài)變化來(lái)看，當(dāng)花蕾的花冠長(zhǎng)度與花萼的長(zhǎng)當(dāng)花蕾的花冠長(zhǎng)度與花萼的長(zhǎng)度相等度相等時(shí)，花藥里面的多數(shù)花時(shí)，花藥里面的多數(shù)花粉粒正處于單核靠邊的階段。粉粒正處于單核靠邊的階段。不同物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時(shí)期不同物種誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的最佳小孢子發(fā)育時(shí)期發(fā)育時(shí)期發(fā)育時(shí)期物種物種減數(shù)分裂期減數(shù)分裂期草莓、番茄草莓、番茄四分孢子期四分孢子期葡萄葡萄單核早中期單核早中期石

8、刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯石刁柏、油菜、大麥、天仙子、馬鈴薯單核晚期單核晚期荔枝、茄子、青椒、小麥荔枝、茄子、青椒、小麥單核早期至晚期單核早期至晚期煙草煙草單核早期至雙核期單核早期至雙核期梨、水稻、甘藍(lán)梨、水稻、甘藍(lán)四分孢子期至雙核期四分孢子期至雙核期玉米玉米2.2.花藥離體培養(yǎng)花藥離體培養(yǎng)（1 1）取材）取材 鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適鏡檢，根據(jù)花粉的發(fā)育時(shí)期，選取大小適宜的花蕾。（考慮供體植物基因型、生理狀態(tài)）宜的花蕾。（考慮供體植物基因型、生理狀態(tài)）（2 2）消毒）消毒 70酒精擦洗花蕾表面，酒精擦洗花蕾表面，70酒精浸泡酒精浸泡15-30s后，在后，在1次氯酸鈉溶液中浸

9、泡次氯酸鈉溶液中浸泡8-10min或在或在0.1的的氯化汞溶液中消毒氯化汞溶液中消毒8-10min，無(wú)菌水沖洗，無(wú)菌水沖洗3-5次。次。（3 3）接種）接種 剝?nèi)ポ嗥突ò?，將花藥取出。去除花絲，剝?nèi)ポ嗥突ò?，將花藥取出。去除花絲，但不應(yīng)使花藥受到損傷。但不應(yīng)使花藥受到損傷。（4 4）培養(yǎng)）培養(yǎng) 先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形先進(jìn)行脫分化培養(yǎng)，至小孢子大量分裂形成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（成胚或愈傷，并突破花藥壁表面，形成突出物（2-3周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株。周）；后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基培養(yǎng)，形成小植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)過(guò)程取花蕾（鏡檢）取花蕾（鏡檢）預(yù)處理預(yù)處理取花藥

10、取花藥消毒消毒接種接種培養(yǎng)培養(yǎng)愈傷組織發(fā)生愈傷組織發(fā)生 預(yù)處理預(yù)處理 預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件。預(yù)處理是小孢子培養(yǎng)成功的前提條件。 預(yù)處理目的：預(yù)處理目的：是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能是改變小孢子的發(fā)育方向，使盡可能多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑多的小孢子從配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理（即成為具胚胎發(fā)生潛力的小孢子）。適當(dāng)?shù)念A(yù)處理能使綠苗產(chǎn)量大量增加。能使綠苗產(chǎn)量大量增加。 預(yù)處理方法：預(yù)處理方法：主要是對(duì)花藥進(jìn)行適度的逆境處理，主要是對(duì)花藥進(jìn)行適度的逆境處理，包括低溫、高溫、化學(xué)物質(zhì)、離心、射線等。包括低溫、高溫、化

11、學(xué)物質(zhì)、離心、射線等。煙草花藥培養(yǎng)，煙草花藥培養(yǎng)，44低溫低溫預(yù)處理預(yù)處理2-32-3天。天。 培養(yǎng)基培養(yǎng)基 主要為主要為MS、H、N6、B5和和Nitsch培養(yǎng)基，在此培養(yǎng)基，在此基礎(chǔ)上發(fā)展出一些其它的培養(yǎng)基。基礎(chǔ)上發(fā)展出一些其它的培養(yǎng)基。 H H培養(yǎng)基（基本成分培養(yǎng)基（基本成分+ + 6-6-BA/KT 2mg/L+ NAA/2,4-D 2mg/L+ NAA/2,4-D 0.2mg/L0.2mg/L+ 30g/L+ 30g/L蔗糖蔗糖+ 7g/L+ 7g/L瓊脂瓊脂+ 1g/L+ 1g/L活性炭，活性炭，pHpH值值5.5-5.85.5-5.8）上誘導(dǎo)愈傷組織；愈傷組織形成后轉(zhuǎn)移到）上誘導(dǎo)

12、愈傷組織；愈傷組織形成后轉(zhuǎn)移到H H培培養(yǎng)基（養(yǎng)基（ 基本成分基本成分+ + NAA 2mg/L+ 6-NAA 2mg/L+ 6-BA 0.2mg/L 0.2mg/L+ 20g/L+ 20g/L蔗糖蔗糖+ 7g/L+ 7g/L瓊脂）上分化成苗。瓊脂）上分化成苗。 1/2 MS 1/2 MS培養(yǎng)基培養(yǎng)基+ + 激素激素+ + 蔗糖蔗糖+ + 瓊脂瓊脂+ + 活性炭活性炭高濃度的高濃度的NH4+顯著抑制花粉愈傷組織形成。顯著抑制花粉愈傷組織形成。鐵鹽鐵鹽對(duì)花粉胚狀體發(fā)育很重要。對(duì)花粉胚狀體發(fā)育很重要。活性炭活性炭促進(jìn)胚狀體發(fā)育。促進(jìn)胚狀體發(fā)育。 較高濃度蔗糖較高濃度蔗糖可誘導(dǎo)花粉形成愈傷組織；可誘

13、導(dǎo)花粉形成愈傷組織；較低濃度蔗糖較低濃度蔗糖可使愈傷組織分化成苗?？墒褂鷤M織分化成苗。細(xì)胞分裂素細(xì)胞分裂素可促進(jìn)胚狀體形成；可促進(jìn)胚狀體形成；生長(zhǎng)素生長(zhǎng)素可誘導(dǎo)愈傷組織形成?？烧T導(dǎo)愈傷組織形成。細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值高細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素比值高時(shí)可誘導(dǎo)愈傷組織分化苗。時(shí)可誘導(dǎo)愈傷組織分化苗。氨基酸氨基酸有機(jī)附加物有機(jī)附加物類別化合物培養(yǎng)基濃度(mg/L)母液擴(kuò)大倍數(shù)500mL母液中藥品量(g)每升培養(yǎng)基取母液的量(ml)大量元素KNO3 95020倍9.550NH4NO37207.2MgSO47H2O1851.85CaCl2 2H2O 1661.66KH2 PO4680.68微量元素MnSO4

14、4H2O25200倍2.55ZnSO47H2O101.0H3BO3 101.0Na2MoO42H2O0.250.025CuSO45H2O0.0250.0025鐵鹽Na2EDTA37.3200倍3.735FeSO47H2O27.82.78有機(jī)物鹽酸硫胺素(B1)0.5200倍0.055鹽酸吡哆素(B6)0.50.05甘氨酸20.2葉酸0.50.05煙酸50.5生物素(維生素H)0.05 0.005肌醇10010H培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制類別化合物培養(yǎng)基濃度(mg/L)母液擴(kuò)大倍數(shù)500mL母液中藥品量(g)每升培養(yǎng)基取母液的量(ml)大量元素KNO3 190020倍1950NH4NO316501

15、6.5MgSO47H2O3703.7CaCl2 2H2O 4404.4KH2 PO41701.7微量元素MnSO44H2O22.3200倍2.235ZnSO47H2O8.60.86H3BO3 6.20.62KI0.830.083Na2MoO42H2O0.250.025CuSO45H2O0.0250.0025CoCl2.6H2O0.0250.0025鐵鹽Na2EDTA37.3200倍3.735FeSO47H2O27.82.78有機(jī)物鹽酸硫胺素(B1)0.4200倍0.045鹽酸吡哆素(B6)0.50.05甘氨酸20.2煙酸0.50.05肌醇10010MS培養(yǎng)基的配制培養(yǎng)基的配制激素激素名稱名稱濃

16、度濃度（mg/mL）100mL母液中母液中藥品量（藥品量（g）配方配方NAA101先少量先少量95%乙乙醇或醇或1 1當(dāng)量的當(dāng)量的NaOHNaOH溶解溶解，后加水定容后加水定容6-BA10 1先少量濃先少量濃HCl或或1 1當(dāng)量的鹽酸當(dāng)量的鹽酸溶解溶解，后加水定容后加水定容2,4-D101先少量先少量95%95%乙醇或乙醇或1 1當(dāng)量的當(dāng)量的NaOHNaOH溶解，溶解，后加水定容后加水定容KT101先少量濃先少量濃HClHCl或或1 1當(dāng)量的鹽酸當(dāng)量的鹽酸溶解，溶解，后加水定容后加水定容 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 1 1、溫度、溫度 適宜溫度是適宜溫度是2528，一般不應(yīng)低于，一般不應(yīng)低于25。2 2

17、、光照、光照 每天每天 1212小時(shí)光照小時(shí)光照, ,光強(qiáng)為光強(qiáng)為 1800-2000lx1800-2000lx。3 3、接種密度、接種密度 每瓶接種花藥多少，應(yīng)根據(jù)三角瓶的大小來(lái)決定。每瓶接種花藥多少，應(yīng)根據(jù)三角瓶的大小來(lái)決定。50mL三角瓶一般接種三角瓶一般接種10個(gè)花藥。個(gè)花藥。1 1、胚狀體發(fā)育途徑、胚狀體發(fā)育途徑 小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的小孢子經(jīng)歷胚發(fā)生的各個(gè)階段，最后子葉展開(kāi)，形成花粉植株。各個(gè)階段，最后子葉展開(kāi)，形成花粉植株。2 2、愈傷組織發(fā)育途徑、愈傷組織發(fā)育途徑 小孢子分裂數(shù)次形成小孢子分裂數(shù)次形成愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的愈傷，再分化形成花粉植株。此途徑產(chǎn)生的植株會(huì)

18、出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。植株會(huì)出現(xiàn)變異且倍性復(fù)雜。 花粉植株形態(tài)發(fā)生方式花粉植株形態(tài)發(fā)生方式單倍體植株的發(fā)育方式單倍體植株的發(fā)育方式胚狀體發(fā)育途徑部分花藥通過(guò)部分花藥通過(guò)胚狀體途徑形胚狀體途徑形成小植株。成小植株。煙草花藥培養(yǎng)A：從裂開(kāi)的花藥中長(zhǎng)出胚狀體; B、C：從藥室中直接長(zhǎng)出的幼苗;D、E：具有根、莖、葉的小苗; F：小苗發(fā)達(dá)的根系愈傷組織發(fā)育途徑部分花藥產(chǎn)生愈傷組織接種在平板上的水稻花藥水稻花藥培養(yǎng)愈傷組織轉(zhuǎn)接種到再生培養(yǎng)基愈傷組織分化形成再生植株 白化苗現(xiàn)象白化苗現(xiàn)象（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理（一）白化苗產(chǎn)生的影響因素及機(jī)理1 1、內(nèi)因、內(nèi)因 供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）

19、、供體植株基因型（如秈稻比粳稻白苗率高）、花粉發(fā)育時(shí)期?；ǚ郯l(fā)育時(shí)期。2 2、外因、外因 預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、激素水平與種類、培養(yǎng)條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時(shí)間等。條件和方法、愈傷組織轉(zhuǎn)分化時(shí)間等。3 3、機(jī)理、機(jī)理 核基因起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致質(zhì)體核基因起關(guān)鍵作用，導(dǎo)致質(zhì)體DNA缺失，產(chǎn)生缺失，產(chǎn)生白苗。另外地、無(wú)性系變異也可能是原因之一。白苗。另外地、無(wú)性系變異也可能是原因之一。（二）白化苗的控制（二）白化苗的控制 通過(guò)對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分等因素進(jìn)行通過(guò)對(duì)花粉發(fā)育時(shí)期、預(yù)處理、培養(yǎng)基成分等因素進(jìn)行調(diào)控。調(diào)控。3.3.單倍體植株的鑒定單倍體植株

20、的鑒定 通過(guò)花藥培養(yǎng)獲得的再生植株的染色體數(shù)目也常通過(guò)花藥培養(yǎng)獲得的再生植株的染色體數(shù)目也常發(fā)生變異，其后代常是混倍體，所以必須對(duì)其后代進(jìn)發(fā)生變異，其后代常是混倍體，所以必須對(duì)其后代進(jìn)行鑒定。行鑒定。 鑒定方法既可以根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行間接鑒定，也鑒定方法既可以根據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行間接鑒定，也可以鏡檢體細(xì)胞中的染色體數(shù)或花粉母細(xì)胞中染色體可以鏡檢體細(xì)胞中的染色體數(shù)或花粉母細(xì)胞中染色體數(shù)以及染色體配對(duì)的情況進(jìn)行直接鑒定。此外還可以數(shù)以及染色體配對(duì)的情況進(jìn)行直接鑒定。此外還可以根據(jù)花粉的育性或利用遺傳標(biāo)記性狀進(jìn)行鑒定。根據(jù)花粉的育性或利用遺傳標(biāo)記性狀進(jìn)行鑒定。（1 1）染色體直接計(jì)數(shù)法）染色體直接計(jì)數(shù)法

21、通常取根尖、莖尖等分生組織用醋酸洋紅染色進(jìn)通常取根尖、莖尖等分生組織用醋酸洋紅染色進(jìn)行制片，直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。行制片，直接計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。（2 2）間接鑒定）間接鑒定（1 1）植株形態(tài)學(xué)鑒定法）植株形態(tài)學(xué)鑒定法 單倍體植株瘦弱，葉片窄小，單倍體植株瘦弱，葉片窄小，花小柱頭長(zhǎng)，花粉粒小，不結(jié)實(shí)?；ㄐ≈^長(zhǎng)，花粉粒小，不結(jié)實(shí)。（2 2）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法）細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定法 葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位葉片保衛(wèi)細(xì)胞大小、單位面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目面積上的氣孔數(shù)及保衛(wèi)細(xì)胞中葉綠體的大小和數(shù)目與倍性具有高度的相關(guān)性。與倍性具有高度的相關(guān)性。（3 3）掃描細(xì)胞光度儀鑒定（流式細(xì)胞儀）掃描細(xì)

22、胞光度儀鑒定（流式細(xì)胞儀） 主要測(cè)主要測(cè)定葉片單個(gè)細(xì)胞中定葉片單個(gè)細(xì)胞中DNADNA的含量確定細(xì)胞的倍性。的含量確定細(xì)胞的倍性。（4 4）雜交鑒定法）雜交鑒定法自交或測(cè)交鑒定自交或測(cè)交鑒定 根據(jù)后代分離情根據(jù)后代分離情況確定二倍體植株是來(lái)自小孢子還是體細(xì)胞。況確定二倍體植株是來(lái)自小孢子還是體細(xì)胞。（5 5）分子標(biāo)記鑒定）分子標(biāo)記鑒定 包括生化標(biāo)記（如同工酶標(biāo)記）包括生化標(biāo)記（如同工酶標(biāo)記）和分子標(biāo)記（如和分子標(biāo)記（如RFLPRFLP、RAPDRAPD、AFLPAFLP等）。等）。醋酸洋紅染色法觀察植物根尖細(xì)胞染色體醋酸洋紅染色法觀察植物根尖細(xì)胞染色體 實(shí)驗(yàn)步驟：實(shí)驗(yàn)步驟：1 1、取材、取材：煙

23、草根尖。：煙草根尖。2 2、預(yù)處理、預(yù)處理：冷凍處理。：冷凍處理。 根尖置于冰水浴中，放到根尖置于冰水浴中，放到4 4的冰箱中處理的冰箱中處理2424小時(shí)。小時(shí)。3 3、固定、固定 沖洗干凈處理的材料，卡諾氏液（冰乙酸：無(wú)水乙醇沖洗干凈處理的材料，卡諾氏液（冰乙酸：無(wú)水乙醇=1=1：3 3或冰乙酸：氯仿：無(wú)水乙醇或冰乙酸：氯仿：無(wú)水乙醇=1=1；3 3：6 6）固定）固定24h24h。4 4、解離、解離 取出取出4-54-5條根置于表面皿中，用條根置于表面皿中，用蒸餾蒸餾水沖洗水沖洗3-43-4次，加入數(shù)次，加入數(shù)滴滴1N1N鹽酸于表面皿中，在酒精燈上間歇式加熱鹽酸于表面皿中，在酒精燈上間歇式

24、加熱2-42-4分鐘。分鐘。5 5、染色、染色 加幾滴醋酸洋紅于表面皿內(nèi)，在燈上加熱。取一根已染過(guò)加幾滴醋酸洋紅于表面皿內(nèi)，在燈上加熱。取一根已染過(guò)色的根放在載玻片上，加一滴色的根放在載玻片上，加一滴1%1%醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片輕醋酸洋紅溶液，蓋上蓋玻片輕敲蓋玻片，使根尖壓成一薄層。敲蓋玻片，使根尖壓成一薄層。6 6、鏡檢、鏡檢 先在先在1010倍下找到分裂相后，再換倍下找到分裂相后，再換4040倍觀察。倍觀察。四、注意事項(xiàng)四、注意事項(xiàng)1. 1. 提高誘導(dǎo)效率。提高誘導(dǎo)效率。2. 2. 降低白化苗的發(fā)生頻率。降低白化苗的發(fā)生頻率。五、作業(yè)與思考題五、作業(yè)與思考題1. 1. 花藥培養(yǎng)的一般程序；花藥培養(yǎng)的一般程序；附培養(yǎng)結(jié)果（照片）附培養(yǎng)結(jié)果（照片）2. 2. 影響花藥培養(yǎng)的因素；影響花藥培養(yǎng)的因素；誘導(dǎo)率誘導(dǎo)