分子生態(tài)學(xué)1分子標(biāo)記

1、分子生態(tài)學(xué)參考書:1.Molecular Ecology (Second Edition) ( Freeland J. R., Kirk H. and Petersen S.), 2011, Wiley-Blackwell. 2. 分子生態(tài)學(xué)(Bee T.J.C., Rowe G.)(張軍麗等譯），中山大學(xué)出版社，2009。3.生物多樣性譯叢（三） 中國科學(xué)院生物多樣性委員會(huì)?？茖W(xué)出版社，19974植物分子生態(tài)學(xué) 阮成江，何禎祥，周長芳?；瘜W(xué)工業(yè)出版社，2005同工酶 1. 同功酶同功酶（Isozyme）: 是指同一種酶的多種分子形式，這些不同的分子形式具有相同或相似的底物，催化相同的反應(yīng)。

2、2. 等位酶等位酶（Allozyme）：由同一基因位點(diǎn)上受不同等位基因來編碼的同工酶，即造成同種酶多種分子形式的原因在于編碼它們的是同一位點(diǎn)上不同的等位基因。這類特殊的同工酶叫做等位基因同工酶（allele isozyme），簡稱等位酶(allozyme)。利用同工酶變異作為基因組變異的指標(biāo). 材料的采集材料的采集研磨和酶的提取研磨和酶的提取酶的保存酶的保存淀粉凝膠制備淀粉凝膠制備電泳電泳凝膠切片凝膠切片酶的組織化學(xué)染色酶的組織化學(xué)染色酶譜的記錄與分析酶譜的記錄與分析數(shù)據(jù)分析數(shù)據(jù)分析同工酶與等位酶同工酶與等位酶等位酶分析的過程同工酶與等位酶同工酶與等位酶酶譜照片酶譜照片二倍體二倍體同工酶與等位

3、酶同工酶與等位酶酶譜照片酶譜照片多倍體多倍體同工酶的遺傳學(xué)分析 1 酶蛋白的結(jié)構(gòu)酶蛋白的結(jié)構(gòu) 我們常選來作遺傳分析的酶都是單體酶、二聚體酶或四聚體酶。因?yàn)樗鼈兊拿缸V比較少，容易分析。對大多數(shù)酶的遺傳學(xué)控制已了解得相當(dāng)清楚，所以這就允許我們從凝膠上的帶譜作出遺傳學(xué)的推斷。 過氧化物酶、脂酶、磷酸酶和肽酶等，其同工酶的數(shù)量、位置和四級結(jié)構(gòu)往往是可變的，雖然它們也常常也被用來檢查遺傳變異性，但這些酶對種群遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育的分析可能是無用的，因?yàn)樗鼈兊耐葱酝荒芸隙?。二倍體的基因型與酶型的關(guān)系等位酶分析的應(yīng)用1. 了解自然種群的遺傳結(jié)構(gòu); 2. 探查種群的交配系統(tǒng)和交配類型;3. 探查種群間的分

4、化程度;4. 交系分析;5. 分子生態(tài)學(xué)其它應(yīng)用.等位酶分析方法的優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)： 1. 等位酶的遺傳和表達(dá)遵循孟德爾定律,便于遺傳學(xué)分析; 2. 量化, 可實(shí)驗(yàn),可重復(fù); 3. 不容易飾變; 4. 取材和樣品制備簡單易行; 5. 結(jié)果明解,可比性強(qiáng).缺點(diǎn): 1. 有限種類的酶分析會(huì)帶來一定的偏差; 2. 所先酶的所有基因未必都能表達(dá)在酶譜上; 3.大量的新鮮的活體素構(gòu)造表示活體取樣可能遇到困難; 4.可能有非遺傳性的或人為的帶干擾酶譜解釋; 5. 同一個(gè)體不同器官或不同發(fā)育時(shí)期酶的活性有時(shí)可能不一樣。推薦讀物 王中仁.1996.植物等位酶分析.北京：科學(xué)出版社同工酶與等位酶同工酶與等位酶 DNA

5、分子標(biāo)記分子標(biāo)記在遺傳學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的在遺傳學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的DNA分子標(biāo)記已經(jīng)分子標(biāo)記已經(jīng)發(fā)展了很多種：發(fā)展了很多種：（1）是以）是以Southern雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，雜交技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，（如（如RFLP），這類分子標(biāo)記被稱為第一代分），這類分子標(biāo)記被稱為第一代分子標(biāo)記。子標(biāo)記。（2）是以）是以PCR技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，（如技術(shù)為核心的分子標(biāo)記，（如STS、RAPD、AFLP、SSR）等，這類分子標(biāo)）等，這類分子標(biāo)記被稱為第二代分子標(biāo)記；單核苷酸多態(tài)性記被稱為第二代分子標(biāo)記；單核苷酸多態(tài)性（SNP）標(biāo)記被稱為第三代分子標(biāo)記）標(biāo)記被稱為第三代分子標(biāo)記 。它也是。它也是以以PC

6、R技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。幾種主要的幾種主要的DNA分子標(biāo)記分子標(biāo)記（二）（二）RFLP標(biāo)記：稱為限制性片段長度標(biāo)記：稱為限制性片段長度多態(tài)性，是指用某一種限制性內(nèi)切酶來多態(tài)性，是指用某一種限制性內(nèi)切酶來切割來自不同個(gè)體的切割來自不同個(gè)體的DNA分子上，內(nèi)切分子上，內(nèi)切酶的識別序列有差異，即是由限制性酶酶的識別序列有差異，即是由限制性酶切位點(diǎn)上堿基的插入、缺失、重排或點(diǎn)切位點(diǎn)上堿基的插入、缺失、重排或點(diǎn)突變所引起的。這種差異反映在酶切片突變所引起的。這種差異反映在酶切片段的長度和數(shù)目上。段的長度和數(shù)目上。RFLP標(biāo)記是發(fā)展最早的標(biāo)記是發(fā)展最早的DNA標(biāo)記技術(shù)。標(biāo)記技

7、術(shù)。RFLP技術(shù)主要包括以下基本步驟：技術(shù)主要包括以下基本步驟：DNA提取用限制性內(nèi)切酶酶切提取用限制性內(nèi)切酶酶切DNA 、 用凝膠電泳分開用凝膠電泳分開DNA片段把片段把DNA片段片段轉(zhuǎn)移到濾膜上利用放射性標(biāo)記的探針雜交轉(zhuǎn)移到濾膜上利用放射性標(biāo)記的探針雜交顯示特定的顯示特定的DNA片段（片段（Southern雜交）和結(jié)果雜交）和結(jié)果分析。分析。 特點(diǎn)特點(diǎn)A 無表型效應(yīng)，無表型效應(yīng)，RFLP標(biāo)記的檢測不受環(huán)標(biāo)記的檢測不受環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響。境條件和發(fā)育階段的影響。B RFLP標(biāo)記在等位基因之間是共顯性的，標(biāo)記在等位基因之間是共顯性的，因此在配制雜交組合時(shí)不受雜交方式的因此在配制雜交組合時(shí)

8、不受雜交方式的影響。影響。C 在非等位的在非等位的RFLP標(biāo)記之間不存在上位標(biāo)記之間不存在上位效應(yīng)，因而互不干擾效應(yīng)，因而互不干擾D RFLP標(biāo)記起源于基因組標(biāo)記起源于基因組DNA的自身變的自身變異，在數(shù)量上幾乎不受限制異，在數(shù)量上幾乎不受限制E DNA需要量大，檢測技術(shù)繁雜，難以需要量大，檢測技術(shù)繁雜，難以用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。在植物分子用于大規(guī)模的育種實(shí)踐中。在植物分子標(biāo)記輔助育種中需要將標(biāo)記輔助育種中需要將RFLP轉(zhuǎn)換成以轉(zhuǎn)換成以PCR為基礎(chǔ)的標(biāo)記。為基礎(chǔ)的標(biāo)記。RAPD（三）（三）RAPD標(biāo)記標(biāo)記 RAPD標(biāo)記的基本原理是利用合成的隨機(jī)引物標(biāo)記的基本原理是利用合成的隨機(jī)引物（一般為（

9、一般為10個(gè)堿基）對基困組個(gè)堿基）對基困組DNA進(jìn)行進(jìn)行PCR擴(kuò)擴(kuò)增增 ，然后電泳檢測，然后電泳檢測PCR產(chǎn)物的多態(tài)性。產(chǎn)物的多態(tài)性。RAPD標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：（1）不需）不需DNA探針，設(shè)計(jì)引物也無須知道探針，設(shè)計(jì)引物也無須知道序列信息；序列信息；（2）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒）顯性遺傳（極少數(shù)共顯性），不能鑒別雜合子和純合子；別雜合子和純合子；（3）技術(shù)簡便，不涉及分子雜交和放射性）技術(shù)簡便，不涉及分子雜交和放射性自顯影等技術(shù)；自顯影等技術(shù)；（4）DNA樣品需要量少，引物價(jià)格便宜，樣品需要量少，引物價(jià)格便宜，成本較低；成本較低；（5）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低

10、。）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低。 （二）（二）AFLP標(biāo)記標(biāo)記 Amplified Fragment Length Polymorphism(AFLP) AFLP標(biāo)記是擴(kuò)增片段長度多態(tài)性的簡稱標(biāo)記是擴(kuò)增片段長度多態(tài)性的簡稱 是是RFLP與與PCR兩項(xiàng)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，兩項(xiàng)技術(shù)相結(jié)合的產(chǎn)物，AFLP技技術(shù)的主要步驟：術(shù)的主要步驟：DNA提取有兩種限制性內(nèi)切酶酶切提取有兩種限制性內(nèi)切酶酶切DNA寡聚核苷酸接頭的連接對限制性酶切片段的寡聚核苷酸接頭的連接對限制性酶切片段的選擇性擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析。選擇性擴(kuò)增擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分析。由于不同由于不同材料材料DNA酶切片段存在差異，因而便產(chǎn)生發(fā)擴(kuò)增產(chǎn)

11、物的酶切片段存在差異，因而便產(chǎn)生發(fā)擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。多態(tài)性。 AFLP的實(shí)驗(yàn)過程AFLPKeygene N. V. Wageningen, the Netherlands Zabeau, M., and P. Vos. 1993. Selective restriction fragment amplification: a general method for DNA fingerpringting. European Patent Application, Publ. No.: EP0534858, no. 92402629.7. Vos, P. et al. 1995. AFLP: a

12、new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Research, 23:4407-4414.AFLPAFLP的重復(fù)性問題Jones et al.（1997）同一實(shí)驗(yàn)在歐洲的8個(gè)實(shí)驗(yàn)室重復(fù)，172條帶只有1條在一次實(shí)驗(yàn)中沒有，重復(fù)率99.4%，與SSR的水平相當(dāng)。（Jones, C. J. et al. 1997. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories. Mol. Breed

13、. 3:381-390)AFLP AFLP標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：（1）由于）由于AFLP分析可以采用的限制性內(nèi)切酶及選擇性分析可以采用的限制性內(nèi)切酶及選擇性堿基種類、數(shù)目很多，所以該技術(shù)所產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目堿基種類、數(shù)目很多，所以該技術(shù)所產(chǎn)生的標(biāo)記數(shù)目是無限多的；是無限多的；（2）典型的）典型的AFLP分析，每次反應(yīng)產(chǎn)物的譜帶在分析，每次反應(yīng)產(chǎn)物的譜帶在50-100條之間，所以一次分析可以同時(shí)檢測到多個(gè)座位，且條之間，所以一次分析可以同時(shí)檢測到多個(gè)座位，且多態(tài)性極高；多態(tài)性極高；（3）分辯率高，結(jié)果可靠；）分辯率高，結(jié)果可靠；（4）目前該技術(shù)受專利保護(hù)，用于分析的試劑盒昂貴，）目前該

14、技術(shù)受專利保護(hù)，用于分析的試劑盒昂貴，實(shí)驗(yàn)條件要求較高。但也存在假陽性帶出現(xiàn)頻繁、技實(shí)驗(yàn)條件要求較高。但也存在假陽性帶出現(xiàn)頻繁、技術(shù)復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)。術(shù)復(fù)雜、成本高等缺點(diǎn)。 （四）（四）SSR標(biāo)記標(biāo)記又叫微衛(wèi)星又叫微衛(wèi)星DNA標(biāo)記，它是指基因組中存標(biāo)記，它是指基因組中存在的由在的由2-5個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長個(gè)核苷酸為重復(fù)單位組成的長達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛達(dá)幾十個(gè)核苷酸的串聯(lián)重復(fù)序列，廣泛分布于真核生物基因組中。分布于真核生物基因組中。 SSR標(biāo)記具有共顯性、高多態(tài)性和易于標(biāo)記具有共顯性、高多態(tài)性和易于檢測等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的分子標(biāo)記，檢測等優(yōu)點(diǎn)，是一種理想的分子標(biāo)記， SS

15、R標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：標(biāo)記的主要特點(diǎn)有：（1）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個(gè)基因）數(shù)量豐富，廣泛分布于整個(gè)基因（2）具有較多的等位性變異；）具有較多的等位性變異；（3）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；）共顯性標(biāo)記，可鑒別出雜合子和純合子；（4）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好，結(jié)果可靠；（5）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時(shí)需知道重復(fù)序列兩端）由于創(chuàng)建新的標(biāo)記時(shí)需知道重復(fù)序列兩端的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也的序列信息，因此其開發(fā)有一定困難，費(fèi)用也較高。較高。 SSR位位點(diǎn)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)點(diǎn)標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn) 約50%呈多態(tài)性 共顯性 數(shù)目多且在基因組中均勻分布 多數(shù)位點(diǎn)呈選擇中性，符合群體遺傳學(xué)了理論 技術(shù)

16、上適合用PCR分析半自動(dòng)化，結(jié)果可靠 部分降解的DNA樣品也可用 適合于等位酶變異小的居群水平的研究 SSRSSRSSR位點(diǎn)標(biāo)記的缺點(diǎn)位點(diǎn)標(biāo)記的缺點(diǎn) 可用的位點(diǎn)數(shù)目少 設(shè)計(jì)引物的費(fèi)用高，耗時(shí)長 物種專一性 在說明群體分化和物種分化時(shí)可能產(chǎn)生錯(cuò)誤SSRSSR標(biāo)記的應(yīng)用領(lǐng)域 遺傳圖譜的構(gòu)建 連鎖分析特殊的基因（如感病基因） 姻親分析樣品鑒定（如父本分析、血緣分析、等號樣品分析、雜種分析） 物種和居群的遺傳多樣性 群體遺傳學(xué)分析（如有效群體大小、群體遺傳結(jié)構(gòu)、群體分化、遷移與基因流動(dòng)） 傳粉生物學(xué)與散布生物學(xué)（如花粉和種子的散布、交配系統(tǒng)） 保護(hù)生物學(xué)SSRISSR標(biāo)記（五）（五）SNP標(biāo)記標(biāo)記 也

17、是以也是以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。它是指不同生物個(gè)體基技術(shù)為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。它是指不同生物個(gè)體基因組因組DNA序列之間單個(gè)核苷酸的差異，這種差異可以通過設(shè)計(jì)特序列之間單個(gè)核苷酸的差異，這種差異可以通過設(shè)計(jì)特異異PCR引物擴(kuò)增和電泳檢測顯示出來。引物擴(kuò)增和電泳檢測顯示出來。 SNP標(biāo)記是根據(jù)基因組測序結(jié)果發(fā)展起來的，因而它的數(shù)量非常標(biāo)記是根據(jù)基因組測序結(jié)果發(fā)展起來的，因而它的數(shù)量非常豐富。檢測豐富。檢測SNP的最佳方法是新近發(fā)展起來的的最佳方法是新近發(fā)展起來的DNA芯片技術(shù)。芯片技術(shù)。 目前目前SNP作為一種的分子標(biāo)記技術(shù)，已有作為一種的分子標(biāo)記技術(shù)，已有2000多個(gè)多個(gè)SNP標(biāo)記定

18、位在標(biāo)記定位在人類染鈀體上，在稻和大豆等植人類染鈀體上，在稻和大豆等植 物上也發(fā)展了一些物上也發(fā)展了一些SNP標(biāo)記。標(biāo)記。 Genetic Variations The genetic variations in DNA sequences (e.g., insertions, deletions, and mutations) have a major impact on genetic diseases and phenotypic differences. All humans share 99% the same DNA sequence. The genetic variations

19、 in the coding region may change the codon of an amino acid and alters the amino acid sequence. Single Nucleotide Polymorphism A Single Nucleotide Polymorphisms (SNP), pronounced “snip,” is a genetic variation when a single nucleotide (i.e., A, T, C, or G) is altered and kept through heredity. SNP:

20、Single DNA base variation found 1% Mutation: Single DNA base variation found 3)commentsreferenceITS1TCCGTAGGTGAACCTGCGG White et al, 1990ITS2GCTGCGTTCTTCATCGATGC (is similar to 5.8S below)White et al, 1990ITS3GCATCGATGAAGAACGCAGC (is similar to 5.8SR below)White et al, 1990ITS4TCCTCCGCTTATTGATATGC W

21、hite et al, 1990ITS5GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG (is similar to SR6R)White et al, 1990ITS1-FCTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA Gardes & Bruns, 1993ITS4-BCAGGAGACTTGTACACGGTCCAG Gardes & Bruns, 19935.8SCGCTGCGTTCTTCATCG Vilgalys lab5.8SRTCGATGAAGAACGCAGCG Vilgalys labSR6RAAGWAAAAGTCGTAACAAGG Vilgalys labback to the to

22、p of this page 基因組信息資源基因組信息資源l GenBank (/)l DDBJ (http:/www.ddbj.nig.ac.jp/)l EMBL (http:/www.embl-heidelberg.de/)NCBI ( National Center for Biotechnology Information) / 全球最大的生物信息資源中心 DNA 序列、蛋白質(zhì)序列、出版物、數(shù)據(jù)挖掘工具等NCBI主頁主頁密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁EMBL (Germany)EB

23、I, Hinxton (Cambridge), UK 2004年2月22日攝密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁EMBL-EBI (UK)EMBnet密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁DDBJNCBI、EBI和和DDBJ之間的區(qū)別與聯(lián)系之間的區(qū)別與聯(lián)系密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁GenBank序列投送指南序列投送指南密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁GenBank序列投送軟件平臺序列投送軟件平臺 GenBank用純文本文件 注釋、作者 、版本等信息 例: 可視化 怎樣檢索分子數(shù)據(jù)庫?l 分類學(xué)分類學(xué) (Taxonomy ) 檢索檢索l 序列相似性序列相似性 (Similarity) 檢索檢索數(shù)據(jù)庫查詢 只查詢某一種生物 布爾查詢 (AND/OR/NOT) 時(shí)間限制查詢 密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁SRS SRS (2004)密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁GenBank 的分類學(xué)檢索的分類學(xué)檢索 (以睡蓮科以睡蓮科Nymphaeaceae為例為例)密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁挑選白睡蓮挑選白睡蓮 (Nymphaea alba) 的的 nrDNA ITS 區(qū)序列區(qū)序列 (收錄號收錄號AF136283)密密蘇蘇里里植植物物園園主主頁頁白睡蓮白睡蓮 (Nymphaea alba) 的的 nrD