生物化學第一章蛋白質

1、。第一章第一章 蛋白質蛋白質(Protein)(Protein) Whats Protein?蛋白質的生物學重要性蛋白質的生物學重要性 分布廣：分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質；所有器官、組織都含有蛋白質； 細胞的各個部分都含有蛋白質。細胞的各個部分都含有蛋白質。 含量高：含量高：蛋白質是細胞內最豐富的有機分蛋白質是細胞內最豐富的有機分 子，占人體干重的子，占人體干重的4545，某些組某些組 織含量更高，例如脾、肺及橫紋織含量更高，例如脾、肺及橫紋 肌等高達肌等高達8080。 1. 蛋白質是生物體重要組成成分蛋白質是生物體重要組成成分作為生物催化劑（酶）作為生物催化劑（酶） 代謝調節(jié)作用代謝

2、調節(jié)作用 免疫保護作用免疫保護作用 物質的轉運和存儲物質的轉運和存儲 運動與支持作用運動與支持作用 參與細胞間信息傳遞參與細胞間信息傳遞 2. 2. 蛋白質具有重要的蛋白質具有重要的生物學功能生物學功能 3. 3. 氧化供能氧化供能 2. 蛋白質的化學組成n一.蛋白質的元素組成 主要的： C H O N S 5055% 68% 2023% 1518% 04% 微量的： P Fe Cu Zn Mo I Se 大多數蛋白質含氮量較恒定，平均16 %，即1g氮相當于6.25g蛋白質。 6.25稱為蛋白質系數。 樣品中蛋白質含量=樣品中的含氮量 6.25 二.蛋白質的分子組成蛋白質蛋白質 月示 胨胨

3、多肽多肽 二肽二肽 氨基酸氨基酸 104 d 5103d 2103d 1035102d 2102d 102d 三.蛋白質的其他組分簡單蛋白質簡單蛋白質 結合蛋白質結合蛋白質 氨基酸部分氨基酸部分 非氨基酸部分非氨基酸部分 糖糖 脂脂 核酸核酸 輔因子輔因子 蛋白質分類分類 蛋白質是一類最重要的生物大分子，英文稱protein，意為“最原初的，第一重要的”。分類分類單純蛋白質（如清蛋白、球蛋白、組蛋白、谷蛋白、硬蛋白等）綴合蛋白質（如糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、金屬蛋白、黃素蛋白等）分類分類 ：按生物學功能可將蛋白質分為酶、調節(jié)蛋白、結構蛋白、轉運蛋白等等；分類分類分類分類纖維狀蛋白質（一般不溶于水

4、。典型的有：膠原蛋白、彈性蛋白、角蛋白、絲蛋白、肌球蛋白等）球狀蛋白質（可溶性好。典型的有：胞質酶類等）膜蛋白（與細胞的膜系統(tǒng)結合而存在）單體蛋白質（寡）多聚蛋白質 組成人體蛋白質的組成人體蛋白質的20種氨基酸均屬種氨基酸均屬 于于 L- -氨基酸氨基酸（amino acidamino acid）除甘氨酸外，且均屬除甘氨酸外，且均屬 L-L- -氨基酸氨基酸自然界中的氨基酸自然界中的氨基酸300300余種余種人體蛋白質中人體蛋白質中的氨基酸的氨基酸2020種種L-L- - -氨基酸的結構通式氨基酸的結構通式COOH H 2 N C H R 共同部分共同部分側鏈側鏈13 - -氨基酸的立體異構體

5、（一）氨基酸的立體異構體（一） - -氨基酸的分子構型氨基酸的分子構型非極性脂肪族氨基酸非極性脂肪族氨基酸 極性中性氨基酸極性中性氨基酸 芳香族氨基酸芳香族氨基酸 酸性氨基酸酸性氨基酸 堿性氨基酸堿性氨基酸二、氨基酸二、氨基酸可根據側鏈結構和理化可根據側鏈結構和理化性質進行分類性質進行分類 含有非極性的側鏈，含有非極性的側鏈， 具有疏水性具有疏水性 GLyGLy（甘）、（甘）、AlaAla（丙）、（丙）、 VaLVaL（纈）、（纈）、LeuLeu（亮）、（亮）、 ILeILe（異亮）、（異亮）、ProPro（脯）（脯）1.1.側鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性側鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸

6、脂肪族氨基酸常見氨基酸的分類常見氨基酸的分類（1 1）R R為脂肪烴基的氨基酸（為脂肪烴基的氨基酸（5 5種）種）甘氨酸甘氨酸（Gly, GGly, G）丙氨酸丙氨酸（Ala, AAla, A）纈氨酸纈氨酸（Val, VVal, V）亮氨酸亮氨酸（Leu, LLeu, L）異亮氨酸異亮氨酸（Ile, I Ile, I ）按的化學結構分類）按的化學結構分類（2 2）R R中含有羥基和硫的氨基酸（中含有羥基和硫的氨基酸（4 4種）種）絲氨酸絲氨酸（Ser, SSer, S）蘇氨酸蘇氨酸（Thr, TThr, T）羥基氨基酸羥基氨基酸半胱氨酸半胱氨酸（Cys, CCys, C）甲硫氨酸甲硫氨酸（Me

7、t, MMet, M）蛋氨酸蛋氨酸含硫氨基酸含硫氨基酸nSerSer的的-CH-CH2 2 OH OH基（基（pKa=15pKa=15）在生理條件下不解離，）在生理條件下不解離，但在大多數酶的活性中心都發(fā)現有但在大多數酶的活性中心都發(fā)現有SerSer殘基存在。殘基存在。nSerSer和和ThrThr的的-OH-OH往往與糖鏈相連，形成糖蛋白。往往與糖鏈相連，形成糖蛋白。 nCysCys含巰基（含巰基（-SH-SH），具有兩個重要性質：），具有兩個重要性質：（1 1）在較高）在較高pHpH值條件，巰基離解。值條件，巰基離解。（2 2）兩個）兩個CysCys的巰基氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸。的巰基

8、氧化生成二硫鍵，生成胱氨酸。n CysCys與結石與結石nMetMet在生物合成中是一種重要的在生物合成中是一種重要的甲基供體甲基供體。（3 3）R R中含有酰胺基團（中含有酰胺基團（2 2種）種）天冬酰氨天冬酰氨（Asn, NAsn, N）谷氨酰氨谷氨酰氨（Gln, QGln, Q）酰胺基中氨基易發(fā)酰胺基中氨基易發(fā)生氨基轉移反應生氨基轉移反應 （4 4） R R中含有酸性基團（中含有酸性基團（2 2種）種）天冬氨酸天冬氨酸（Asp, DAsp, D）谷氨酸谷氨酸（Glu, EGlu, E）生理條件下帶有負電荷生理條件下帶有負電荷 （5 5）R R中含堿性基團（中含堿性基團（3 3種）種）組氨

9、酸組氨酸（His, HHis, H）賴氨酸賴氨酸（Lys, KLys, K）精氨酸精氨酸（Arg, RArg, R）nLysLys側鏈氨基的側鏈氨基的pKapKa為為10.5310.53，生理條件下，生理條件下，LysLys側鏈帶有一側鏈帶有一個正電荷（個正電荷（NHNH3 3+ +），側鏈的氨基反應活性增大。），側鏈的氨基反應活性增大。 nArgArg是堿性最強的氨基酸，側鏈上的胍基是已知堿性最強的是堿性最強的氨基酸，側鏈上的胍基是已知堿性最強的有機堿，有機堿，pKapKa值為值為12.4812.48，生理條件下完全質子化。，生理條件下完全質子化。 nHisHis是是pKapKa值最接近生理

10、值最接近生理pHpH值的一種值的一種 （游離氨基酸中為（游離氨基酸中為6.006.00，在多肽鏈中為，在多肽鏈中為7.35 7.35 ） 生理生理pHpH條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸條件下唯一具有緩沖能力的氨基酸nHisHis在酶的酸堿催化機制中起重要作用在酶的酸堿催化機制中起重要作用 （6 6）芳香族氨基酸）芳香族氨基酸苯丙氨酸苯丙氨酸（Phe, FPhe, F）酪氨酸酪氨酸（Tyr, YTyr, Y）色氨酸色氨酸（Trp, WTrp, W）l280nm280nm，TrpTrp吸收最強，吸收最強，TyrTyr次之，次之，PhePhe最弱最弱（7 7）雜環(huán)族氨基酸（）雜環(huán)族氨基酸（1 1種）

11、種）脯氨酸脯氨酸（Pro, PPro, P）組氨酸組氨酸（His, HHis, H）ProPro的的-亞氨基是環(huán)的一部亞氨基是環(huán)的一部分，因此具有特殊的剛性結構。分，因此具有特殊的剛性結構。幾種特殊氨基酸幾種特殊氨基酸 脯氨酸脯氨酸 （亞氨基酸）（亞氨基酸）CH2CHCOO-NH2+CH2CH2CH2CHCOO-NH2+CH2CH2-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3-OOC-CH-CH2-S+NH3S-CH2-CH-COO-+NH3 半胱氨酸半胱氨酸 +胱氨酸胱氨酸-HH-OOC-CH-CH2-SH+NH3-OOC-CH-CH2-SH+NH3HS-CH2-CH

12、-COO-+NH3HS-CH2-CH-COO-+NH3二硫鍵二硫鍵2)2)按照按照R R基的極性基的極性n4 4類類（1 1）非極性）非極性R R基團氨基酸基團氨基酸：8 8個個 Ala Val Leu Ile Pro Phe Trp MetAla Val Leu Ile Pro Phe Trp Met（2 2）極性）極性R R基團不帶電荷氨基酸：基團不帶電荷氨基酸：7 7個個 Gly Ser Thr Cys Tyr Asn GlnGly Ser Thr Cys Tyr Asn Gln（3 3）極性）極性R R基團帶負電荷氨基酸：基團帶負電荷氨基酸：2 2個個 Asp GluAsp Glu（4

13、 4）極性）極性R R基團帶正電荷氨基酸：基團帶正電荷氨基酸：3 3個個 His Lys ArgHis Lys Arg非極性氨基酸非極性氨基酸 9 9種種維持蛋白質的三維結構中起維持蛋白質的三維結構中起著重要作用著重要作用 （蛋白質的疏水核心）（蛋白質的疏水核心）n膠原蛋白中的膠原蛋白中的LysLys側鏈氧化時能形成很強的分子間側鏈氧化時能形成很強的分子間( (內內) )交聯交聯nArgArg：強堿，與：強堿，與NaOHNaOH相當。相當。nHisHis：弱堿，天然緩沖劑，它往往存在于許多酶的活性中心。：弱堿，天然緩沖劑，它往往存在于許多酶的活性中心。n非極性非極性aaaa一般形成蛋白質的疏水

14、核心，帶電荷的一般形成蛋白質的疏水核心，帶電荷的aaaa和極性和極性aaaa位位于表面。于表面。n酶的活性中心：酶的活性中心：HisHis、SerSer、CysCys修飾氨基酸：修飾氨基酸：胱氨酸胱氨酸 羥脯氨酸羥脯氨酸（Hyp） 羥賴氨酸羥賴氨酸（HyL）非生蛋白氨基酸：非生蛋白氨基酸： 瓜氨酸瓜氨酸 鳥氨酸鳥氨酸 同型半胱氨酸同型半胱氨酸4-4-羥脯氨酸（膠原蛋白）羥脯氨酸（膠原蛋白）5-5-羥賴氨酸（結締組織）羥賴氨酸（結締組織）修飾氨基酸修飾氨基酸p蛋白質合成后，由基本氨基酸修飾而來。蛋白質合成后，由基本氨基酸修飾而來。 p作用：作用：1. 1. 保護蛋白質保護蛋白質 2. 2. 使蛋

15、白質出現新的結構和功使蛋白質出現新的結構和功能能 （1 1）溶解性：）溶解性：水中的溶解度差別很大水中的溶解度差別很大 溶解于稀酸或稀堿溶解于稀酸或稀堿 不能溶解于有機溶劑（乙醇沉淀析出）不能溶解于有機溶劑（乙醇沉淀析出） （2 2）熔點：）熔點：熔點極高，一般在熔點極高，一般在200200以上。以上。（3 3）味感：）味感：不同氨基酸有所不同，無味、甜、苦不同氨基酸有所不同，無味、甜、苦 味精：谷氨酸鈉鹽味精：谷氨酸鈉鹽二二. .氨基酸的重要理化性質氨基酸的重要理化性質1.1.一般物理性質一般物理性質n無色結晶無色結晶, ,其形狀因構型而異其形狀因構型而異 n酪氨酸的酪氨酸的 max275n

16、m， 275=1.4x103;n苯丙氨酸的苯丙氨酸的 max257nm， 257=2.0 x102;n色氨酸的色氨酸的 max280nm， 280=5.6x103; 2.2.氨基酸的離解性質氨基酸的離解性質n氨基酸在結晶形態(tài)或在水溶液中，并不是以游離的羧基或氨基形式存在，而是離解成兩性離子。在兩性離子中，氨基是以質子化(-NH3+)形式存在，羧基是以離解狀態(tài)(-COO-)存在。n在不同的pH條件下，兩性離子的狀態(tài)也隨之發(fā)生變化CO O HCHH3N+R-pK1+H+H+C O O-CHH3N+RH+H+p K2-C O O-CHH2NRPH 1 7 10凈電荷 +1 0 -1 正離子 兩性離子

17、 負離子 等電點PIH3NCHCOOHR+（pHpI）H3NCHCOO-R+（pH=pI）H2NCHCOO-R（pHpI）氨基酸的解離氨基酸的解離Ka1*Ka2=l側鏈不含離解基團的中性側鏈不含離解基團的中性AAAAlpI = (pK1 + pK2 )/2 甘氨酸滴定曲線甘氨酸滴定曲線n對于側鏈含有可解離基團的對于側鏈含有可解離基團的AAAAnp pI I取決于兩性離子兩邊取決于兩性離子兩邊p pK K值的算術平均值的算術平均值值n酸性酸性AAAA：p pI I = (p = (pK K1 1 + p + pK KR-COOR-COO- - )/2 )/2 n堿性堿性AAAA：p pI I =

18、 (p = (pK K2 2 + p + pK KR-NH2 R-NH2 )/2 )/2 3.氨基酸的等電點氨基酸的等電點 當溶液濃度為某一當溶液濃度為某一pH值時，氨基酸分子中所含的值時，氨基酸分子中所含的-NH3+和和-COO-數目正好相等，凈電荷為數目正好相等，凈電荷為0。這一。這一pH值即為氨基酸的值即為氨基酸的等電點，簡稱等電點，簡稱pI。在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負極。在等電點時，氨基酸既不向正極也不向負極移動，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)。移動，即氨基酸處于兩性離子狀態(tài)。 側鏈不含離解基團的中性氨基酸，其等電點是它的側鏈不含離解基團的中性氨基酸，其等電點是它的pK1和和pK2

19、的算術平均值：的算術平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 同樣，對于側鏈含有可解離基團的氨基酸，其同樣，對于側鏈含有可解離基團的氨基酸，其pI值也決定值也決定于兩性離子兩邊的于兩性離子兩邊的pK值的算術平均值。值的算術平均值。 酸性氨基酸：酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 鹼性氨基酸：鹼性氨基酸：pI = (pK2 + pKR-NH2 )/2 4.氨基酸的化學性質氨基酸的化學性質(1)與茚三酮的反應（顏色反應）與茚三酮的反應（顏色反應）氨基酸等電點（氨基酸等電點（PI）的計算）的計算中性氨基酸：PI=1/2（pk1+pK2)酸性氨基酸： PI=1/2（pk

20、1+pKR-COO-)堿性氨基酸： PI=1/2（pk2+pKR-NH2) 氨基酸與水合茚三酮共熱，發(fā)生氧化脫氨反應，生成NH3與酮酸。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。加熱過程中酮酸裂解，放出CO2，自身變?yōu)樯僖粋€碳的醛。水合茚三酮變?yōu)檫€原型茚三酮。NH3與水合茚三酮及還原型茚三酮脫水縮合，生成藍紫色化合物。n反應要點A.該反應由NH2與COOH共同參與B.茚三酮是強氧化劑C.該反應非常靈敏，可在570nm測定吸光值D. 測定范圍：0.550g/ml E.脯氨酸與茚三酮直接生成黃色物質（不釋放NH3）n應用：A.氨基酸定量分析（先用層析法分離）B.氨基酸自動分析儀： 用陽離子交換樹脂，將樣品中的氨

21、基酸分離，自動定性定量，記錄結果。(2)與甲醛反應與甲醛反應 n反應特點A.為- NH2的反應B.在常溫，中性條件，甲醛與- NH2很快反應，生成羥甲基衍生物，釋放氫離子。n應用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（間接滴定）A.直接滴定，終點pH過高（12），沒有適當指示劑。B.與甲醛反應，滴定終點在9左右，可用酚酞作指示劑。C.釋放一個氫離子，相當于一個氨基（摩爾比1：1）D.簡單快速，一般用于測定蛋白質的水解速度。(3) 與與2,4-二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFB）反應）反應 n反應特點A.為- NH2的反應B.氨基酸- NH2的一個H原子可被烴基取代(鹵代烴)C.在弱堿性條件下，與DNFB發(fā)生

22、芳環(huán)取代，生成二硝基苯氨基酸n應用：鑒定多肽或蛋白質的N-末端氨基酸A.雖然多肽側鏈上的- NH2、酚羥基也能與DNFB反應，但其生成物，容易與- DNP氨基酸區(qū)分和分離 首先由Sanger應用，確定了胰島素的一級結構A.B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游離氨基酸C.分離DNP-氨基酸D.n由Edman于1950年首先提出n為- NH2的反應n用于N末端分析，又稱Edman降解法肽分子與DNFB反應，得DNP-肽層析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的種類、數目(4)與異硫氰酸苯酯（與異硫氰酸苯酯（PITC）的反應）的反應 nEdman （苯異硫氰酸酯法）氨基酸順序分析法實際上

23、也是一種N-端分析法。此法的特點是能夠不斷重復循環(huán)，將肽鏈N-端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。NCSNHCHCOR2NCHCOR1HHNHS:CCHCOR1HNNHCHCOR2SNHCNHOCR1CHNH2CHCOR2NCOCHNHSCR1 肽鏈（N端氨基酸）與PITC偶聯，生成PTC-肽環(huán)化斷裂：最靠近PTC基的肽鍵斷裂，生成PTC-氨基酸和少 一殘基的肽鏈，同時PTC-氨基酸環(huán)化生成PTH-氨基酸分離PTH-氨基酸層析法鑒定nEdman降解法的改進方法- DNS-Edman降解法n用DNS(二甲基萘磺酰氯)測定N端氨基酸n原理DNFB法相同n但水解后的DNS-氨基酸不需分離，可直接用電泳或

24、層析法鑒定n由于DNS有強烈熒光，靈敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高幾到十幾倍n可用于微量氨基酸的定量 n用Edman降解法提供逐次減少一個殘基的肽鏈n靈敏度提高，能連續(xù)測定。n多肽順序自動分析儀n樣品最低用量可在5pmol（5）與熒光胺的反應）與熒光胺的反應 - NH2的反應氨基酸定量（6）與）與5,5-雙硫基雙硫基-雙雙(2-硝基苯甲酸硝基苯甲酸)反應反應-SH的反應測定細胞游離- SH的含量（7）其他反應）其他反應成鹽、成酯、成肽、脫羧反應 4. 肽n一.肽的概念 肽 肽鍵 肽鏈 N端 C端 二肽 三肽 多肽 寡肽 多肽鏈 氨基酸殘基 肽單位n二.肽的命名n三.肽的理化性質

25、1.在晶體或溶液中以兩性離子狀態(tài)存在 2.熔點高 3.其酸堿性決定于N端氨基、C端羧基和側鏈R基 4.雙縮脲反應 5.與氨基酸類似的反應：DNFB DNS PITC 反應等 四.常見的多肽（天然活性肽）肽的概念肽的概念肽和肽鍵氨基酸殘基及肽單位肽單元肽單元(peptide unit) 示意圖示意圖肽鍵的特點肽鍵的特點1.一般的C-N單鍵 肽鍵C-N 一般的C=N雙鍵 （鍵長1.49 ) （鍵長1.32） （鍵長1.27) 因此具有部分雙鍵的性質，不能沿C-N自由旋轉2.C=O和NH2中的O原子與H原子成反式排列3.與C-N鍵相連的N-C和C-C可以自由旋轉，其 旋轉角分別為和。 和稱為二面角，

26、可描述多肽的所有可能構象。 4.肽鍵中的四個原子和它相鄰的兩個C處于同一 平面，形成酰胺平面。 谷胱甘肽（谷胱甘肽（GSH）- 3.天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽 在生物體中，多肽最重要的存在形式是作為蛋白質的亞單位。但是，也有許多分子量比較小的多肽以游離狀態(tài)存在。這類多肽通常都具有特殊的生理功能，常稱為活性肽。如：腦啡肽；激素類多肽；抗生素類多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。NHCOC H2N HCOC HN HCOC H3C HC HO HC H2O HC HH NCN HC HCN HC H2CCOC HNHH OC H2N HN HC HC HC H3C H2C H3COOOOC H2

27、C H2SOO H鵝 膏 覃 堿 的 化 學 結 構蛋白質與多肽的區(qū)別：蛋白質與多肽的區(qū)別：氨基酸殘基氨基酸殘基 數目數目穩(wěn)定的穩(wěn)定的 空間結構空間結構50 50 蛋白質蛋白質50 50 多肽多肽不穩(wěn)定的空間結構不穩(wěn)定的空間結構 多肽多肽穩(wěn)定的空間結構穩(wěn)定的空間結構 蛋白質蛋白質 蛋白質的結構 二二.蛋白質的一級結構蛋白質的一級結構 1. 蛋白質的一級結構蛋白質的一級結構(Primary structure)包括：包括： (1)組成蛋白質的多肽鏈數目. (2)多肽鏈的氨基酸順序， (3)多肽鏈內或鏈間二硫鍵的數目和位置。 其中最重要的是多肽鏈的氨基酸順序，它是蛋白質生物功能的基礎。2.蛋白質的

28、一級結構的測定蛋白質的一級結構的測定 蛋白質氨基酸順序的測定是蛋白質化學研究的基礎。自從1953年F.Sanger測定了胰島素的一級結構以來，現在已經有上千種不同蛋白質的一級結構被測定。(1) 測定蛋白質的一級結構的要求測定蛋白質的一級結構的要求 一級結構（1 1）結構特點）結構特點l多為右手螺旋；多為右手螺旋；l多肽鏈主鏈骨架圍繞中心軸螺旋式多肽鏈主鏈骨架圍繞中心軸螺旋式 上升，每上升一圈為上升，每上升一圈為3.6 3.6 個殘基；個殘基；l每個殘基沿中心軸上升每個殘基沿中心軸上升0.15 nm0.15 nm，旋轉旋轉 100100 右手型- 螺旋 在-螺旋中肽平面的鍵長和鍵角一定,肽鍵的原

29、子排列呈反式構型,相鄰的肽平面構成兩面角.多肽鏈中的各個肽平面圍繞同一軸旋轉，形成螺旋結構，螺旋一周，沿軸上升的距離即螺距為0.54nm,含3.6個氨基酸殘基；兩個氨基酸之間的距離0.15nm.肽鏈內形成氫鍵，氫鍵的取向幾乎與軸平行，第一個氨基酸殘基的酰胺基團的-CO基與第四個氨基酸殘基酰胺基團的-NH基形成氫鍵。蛋白質分子為右手-螺旋。左手和右手螺旋左手和右手螺旋氫鍵 R基大小：較大的難形成，如多聚基大小：較大的難形成，如多聚Ile R基的電荷性質：不帶電荷易形成基的電荷性質：不帶電荷易形成 Pro吡咯環(huán)的形成吡咯環(huán)的形成 C -N /C -N不能不能旋轉旋轉 無法形成鏈內氫鍵無法形成鏈內氫

30、鍵影響影響 -螺旋形成的因素螺旋形成的因素結構要點：結構要點： - -折疊折疊（ -pleated sheet） 使多肽鏈形成片層結使多肽鏈形成片層結構構nC 總是處于折疊的角上總是處于折疊的角上nAA的的R基團處于折疊的棱角上并與之垂直基團處于折疊的棱角上并與之垂直n兩個兩個AA之間的軸心距為之間的軸心距為0.35nm - -折疊結構特點折疊結構特點n氫鍵主要在鏈間氫鍵主要在鏈間/ /同一肽鏈不同部分間形成同一肽鏈不同部分間形成n幾乎所有肽鍵都參與鏈內氫鍵的交聯幾乎所有肽鍵都參與鏈內氫鍵的交聯n氫鍵與鏈的長軸接近垂直氫鍵與鏈的長軸接近垂直n平行肽鏈間以氫鍵從側面連接的構象平行肽鏈間以氫鍵從側

31、面連接的構象 蛋白質的-折迭是蛋白質的一種二級結構肽鏈伸展，且按層排列，相鄰肽鏈的長軸相互平行，鏈間氫鍵與長軸接近垂直，靠相鄰肽鏈間氫鍵維持結構穩(wěn)定性，氨基酸殘基的軸心距為3.5 （3） -轉角轉角在-轉角部分，由四個氨基酸殘基組成.四個形成轉角的殘基中，第三個一般均為甘氨酸殘基彎曲處的第一個氨基酸殘基的 -C=O 和第四個殘基的 N-H 之間形成氫鍵，形成一個不很穩(wěn)定的環(huán)狀結構。這類結構主要存在于球狀蛋白分子中。（）自由回轉（）自由回轉沒有一定規(guī)律的松散肽鏈結構，但仍是緊密有序的穩(wěn)定結構，通過主鏈間及主鏈與側鏈間氫鍵維持其構象不同的蛋白質，自由回轉的數量和形式各不相同分兩類： 緊密環(huán) 連接條

32、帶超二級結構和結構域超二級結構和結構域（）超二級結構（）超二級結構在蛋白質分子中，由若干相鄰的二級結構單元組合在一起，彼此相互作用，形成有規(guī)則的、在空間上能辨認的二級結構組合體。幾種類型的超二級結構： ；超二級結構在結構超二級結構在結構層次上高于二級結構，但層次上高于二級結構，但沒有聚集成具有功能的結沒有聚集成具有功能的結構域構域 蛋白質的超二級結構蛋白質的超二級結構 這是由這是由相鄰的二級結構單位組合在一起，形成的有規(guī)則的、在空間上能辨認的二級結構組合體。二級結構組合體。a-發(fā)夾結構-發(fā)夾a-結構模體模體是具有特殊功能的是具有特殊功能的 超二級結構超二級結構在許多蛋白質分子中，可發(fā)現二個或三

33、在許多蛋白質分子中，可發(fā)現二個或三個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，個具有二級結構的肽段，在空間上相互接近，形成一個形成一個有規(guī)則的二級結構組合，被稱為有規(guī)則的二級結構組合，被稱為超超二級結構或模體二級結構或模體(motif) 。二級結構組合形式有二級結構組合形式有3 3種：種： ， 。鈣結合蛋白中結合鈣結合蛋白中結合鈣離子的模體鈣離子的模體鋅指結構鋅指結構- -螺旋螺旋-轉角（或轉角（或環(huán)）環(huán)）-螺旋模體螺旋模體 鏈鏈-轉角轉角- -鏈模體鏈模體 鏈鏈-轉角轉角-螺旋螺旋-轉角轉角- -鏈模體鏈模體n模體常見的形式模體常見的形式（）結構域（）結構域 對于較大的蛋白質分子或亞基，多肽鏈往

34、往由兩個或兩個以上相對獨立的三維實體締合而成三級結構。這種相對獨立的三維實體就稱結構域。結構域通常是幾個超二級結構的組合，對于較小的蛋白質分子，結構域與三級結構等同，即這些蛋白為單結構域。結構域一般由100200 個氨基酸殘基組成，但大小范圍可達 40400 個殘基。氨基酸可以是連續(xù)的，也可以是不連續(xù)的結構域之間常形成裂隙，比較松散，往往是蛋白質優(yōu)先被水解的部位。酶的活性中心往往位于兩個結構域的界面上結構域之間由“鉸鏈區(qū)”相連，使分子構象有一定的柔性，通過結構域之間的相對運動，使蛋白質分子實現一定的生物功能。 在蛋白質分子內，結構域可作為結構單位進行相對獨立的運動，水解出來后仍能維持穩(wěn)定的結構

35、，甚至保留某些生物活性核糖核酸酶分子中的二級結構核糖核酸酶分子中的二級結構-螺旋螺旋-折疊折疊-轉角轉角無規(guī)卷曲無規(guī)卷曲 結構域與功能域的關系：結構域與功能域的關系：有時一個結構域就是蛋白質的功能域，但不總是包含一個但通常是多個結構域蛋白質的三級結構蛋白質的三級結構蛋白質的三級結構是指多肽鏈在二級結構的基礎上進一步盤旋、折疊，從而生成特定的空間結構。包括主鏈和側鏈的所有原子的空間排布一般非極性側鏈埋在分子內部，形成疏水核，極性側鏈在分子表面肌紅蛋白的三級結構a 蛋白蛋白a+蛋白a/蛋白維系蛋白質三維結構的作用力蛋白質的四級結構蛋白質的四級結構許多蛋白質是由兩個或兩個以上獨立的三級結構通過非共價

36、鍵結合成的多聚體，稱為寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每個獨立三級結構單元稱為亞基。蛋白質的四級結構是指亞基的種類、數量以及各個亞基在寡聚蛋白質中的空間排布和亞基間的相互作用。如，血紅蛋白的四級結構得測定由佩魯茨1958年完成，其結構要點為：球狀蛋白，寡聚蛋白，含四個亞基兩條鏈，兩條鏈，22 鏈：141個殘基； 鏈：146個殘基分子量65 000含四個血紅素輔基親水性側鏈基團在分子表面，疏水性基團在分子內部蛋白質四級結構的結構特征分子伴侶參與蛋白質折疊分子伴侶參與蛋白質折疊 分子伴侶分子伴侶(chaperon)(chaperon)通過提供一個保護環(huán)境從通過提供一個保護環(huán)境從 而加速蛋白質折疊成天然構象或

37、形成四級結構。而加速蛋白質折疊成天然構象或形成四級結構。* * 分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨分子伴侶可逆地與未折疊肽段的疏水部分結合隨后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，后松開，如此重復進行可防止錯誤的聚集發(fā)生，使肽鏈正確折疊。使肽鏈正確折疊。 * * 分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚分子伴侶也可與錯誤聚集的肽段結合，使之解聚后，再誘導其正確折疊。后，再誘導其正確折疊。 * * 分子伴侶在蛋白質分子折疊過程中二硫鍵的正分子伴侶在蛋白質分子折疊過程中二硫鍵的正確形成起了重要的作用。確形成起了重要的作用。 三蛋白質分子中的共價鍵與次級鍵三蛋白質分子中的共價鍵與次級鍵一

38、級結構二級結構超二級結構結構域三級結構亞基四級結構維系蛋白質分子的一級結構：肽鍵、二硫鍵維系蛋白質分子的二級結構：氫鍵維系蛋白質分子的三級結構：疏水相互作用力、氫鍵、范德華力、鹽鍵維系蛋白質分子的四級結構：范德華力、鹽鍵 a鹽鍵（離子鍵 ） b氫鍵 c疏水相互作用力 d 范德華力 e二硫鍵 f 酯鍵氫鍵、范德華力、疏水相互作用力、鹽鍵，均為次級鍵氫鍵、范德華力雖然鍵能小，但數量大疏水相互作用力對維持三級結構特別重要鹽鍵數量小二硫鍵對穩(wěn)定蛋白質構象很重要，二硫鍵越多，蛋白質分子構象越穩(wěn)定離子鍵離子鍵氫鍵氫鍵范德華力范德華力疏水相互作用力疏水相互作用力第四節(jié)第四節(jié) 蛋白質分子結構與功能的關系蛋白質

39、分子結構與功能的關系一一.蛋白質一級結構與功能的關系蛋白質一級結構與功能的關系 研究蛋白質一級結構與功能的關系主要是：研究多肽鏈中不同部位的殘基與生物功能的關系。 進行這方面的研究常用的方法有：同源蛋白質氨基酸順序相似性分析、氨基酸殘基的化學修飾及切割實驗等。 例例1 鐮刀形貧血病鐮刀形貧血病l患者血紅細胞合成了一種不正常的血紅蛋白（Hb-S）l它與正常的血紅蛋白（Hb-A）的差別：僅僅在于鏈的N-末端第6位殘基發(fā)生了變化l（Hb-A）第6位殘基是極性谷氨酸殘基，（Hb-S）中換成了非極性的纈氨酸殘基l使血紅蛋白細胞收縮成鐮刀形，輸氧能力下降，易發(fā)生溶血l這說明了蛋白質分子結構與功能關系的高度

40、統(tǒng)一性正常血紅細胞鐮刀狀紅細胞貧血蛋白質的一級結構的變異與分子病n氨基酸順序 1 2 3 4 5 6 7 8n HbA Val.His.Leu.Thr.Pro.Glu.Glu.Lysn HbS Val.His.Leu.Thr.Pro.Val.Glu.Lys例例2 一級結構的局部斷裂與蛋白質的激一級結構的局部斷裂與蛋白質的激活活 體內的某些蛋白質分子初合成時，常帶有抑制肽，呈無活性狀態(tài)，稱為蛋白質原.蛋白質原的部分肽鏈以特定的方式斷裂后，才變?yōu)榛钚苑肿?例：胰島素，在剛合成時，是一個比成熟的胰島素分子大一倍多的單鏈多肽，稱為前胰島素原前胰島素原的N-末端有一段肽鏈，稱為信號肽.信號肽被切去，剩下

41、的是胰島素原。胰島素原比胰島素分子多一段C肽，只有當C肽被切除后才成為有51個殘基，分A、B兩條鏈的胰島素分子單體.瘋牛病中的蛋白質構象改變瘋牛病中的蛋白質構象改變 瘋牛病是由瘋牛病是由朊病毒蛋白朊病毒蛋白(prion protein,(prion protein, PrP)PrP)引起的一組人和動物神經退行性病變。引起的一組人和動物神經退行性病變。 正常的正常的PrPPrP富含富含-螺旋螺旋，稱為，稱為PrPPrPc c。 PrPPrPc c在某種未知蛋白質的作用下可轉變在某種未知蛋白質的作用下可轉變成全為成全為-折疊的折疊的PrPPrPscsc，從而致病。，從而致病。PrPPrPc c -

42、螺旋螺旋PrPPrPsc sc -折疊折疊正常正常瘋牛病瘋牛病例例3 同源蛋白同源蛋白 同源蛋白：是指在不同有機體中實現同一功能的蛋白質.同源蛋白中的一級結構中有許多位置的氨基酸對所有種屬來說都是相同的，稱為不變殘基；其他位置的氨基酸稱可變殘基.不同種屬的可變殘基有很大變化.可用于判斷生物體間親緣關系的遠近.例：細胞色素Cl60 個物種中，有 27 個位置上的氨基酸殘基完全不變，是維持其構象中發(fā)揮特有功能所必要的部位，屬于不變殘基.l可變殘基可能隨著進化而變異，而且不同種屬的細胞色素 C氨基酸差異數與種屬之間的親緣關系相關。親緣關系相近者，氨基酸差異少，反之則多（進化樹）.細胞色素C進化樹黃色

43、： 不變殘基（invariable residues）藍色 ： 保守氨基酸（conservative residues）未標記：可變殘基（variable residues）二二.蛋白質的構象與功能的關系蛋白質的構象與功能的關系 別構效應：又稱變構效應，是指寡聚蛋白與配基結合，改變蛋白質構象，導致蛋白質生物活性改變的現象.它是細胞內最簡單的調節(jié)方式.例：血紅蛋白的別構效應一個亞基與氧結合后，引起該亞基構象改變進而引起另三個亞基的構象改變整個分子構象改變與氧的結合能力增加卟啉鐵卟啉鐵n肌紅蛋白肌紅蛋白 血紅蛋白血紅蛋白 血紅蛋白血紅蛋白 肌紅蛋白肌紅蛋白 / 血紅蛋白血紅蛋白 / 血紅蛋白血紅蛋

44、白lAAAA序列大不相同，結構相似序列大不相同，結構相似l結構決定功能（載氧）結構決定功能（載氧）n氧分數飽和度（氧分數飽和度（fractional satuation ） 肌紅蛋白分子總數肌紅蛋白分子總數氧合肌紅蛋白分子數氧合肌紅蛋白分子數nY=1 Mb被氧完全飽和被氧完全飽和nY=0.5 p(O2)=K=P50P50 ：Mb被氧半飽和時的氧分壓被氧半飽和時的氧分壓YMb氧結合氧結合/ /解離曲線解離曲線在氧分壓不變時，低在氧分壓不變時，低pH能促進更多的氧釋放能促進更多的氧釋放Bohr效應效應 第五節(jié)第五節(jié) 蛋白質的性質蛋白質的性質一一.蛋白質的分子大小蛋白質的分子大小蛋白質是分子量很大的

45、生物分子，相對分子質量大于10 000.最高可達40 000 000（煙草花葉病毒） 蛋白質相對分子質量的測定方法蛋白質相對分子質量的測定方法1.根據化學成分測定最小相對分子質量根據化學成分測定最小相對分子質量 此法首先利用化學分析方法測定蛋白質分子中某一特殊成分的百分含量然后，假定蛋白質分子中該成分只有一個，據其百分含量可計算出最低相對分子質量：最小相對分子質量（已知成分的相對分子、原子質量）/已知成分的百分含量如果蛋白質分子中所含已知成分不是一個單位，則真實相對分子質量等于最小相對分子質量的倍數。2. 超離心法超離心法在60 00080 000r/min的高速離心力作用下，蛋白質分子會沿旋

46、轉中心向外周方向移動用光學方法測定界面移動的速度即為蛋白質的離心沉降速度蛋白質的沉降速度與分子大小和形狀有關沉降系數是溶質顆粒在單位離心場中的沉降速度，用S表示。一個S單位，為110-13秒相對分子質量越大，S值越大蛋白質的沉降系數：1200S 由沉降系數S可根據斯維得貝格Svedberg方程計算蛋白質分子的相對分子質量： M=RST/D1i R：氣體常數 T：絕對溫度 D：擴散系數 ：溶劑的密度3.凝膠過濾法凝膠過濾法凝膠過濾所用介質為凝膠珠，其內部為多孔網狀結構一定型號的凝膠網孔大小一定，只允許相應大小的分子進入凝膠顆粒內部，大分子則被排阻在外洗脫時大分子隨洗脫液從顆粒間隙流下來，洗脫液體

47、積??；小分子在顆粒網狀結構中穿來穿去，歷程長，后洗脫下來，洗脫體積大測定蛋白質分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex測得幾種標準蛋白質的洗脫體積Ve以相對分子質量對數（logM）對Ve作圖，得標準曲線再測出未知樣品洗脫體積Ve從標準曲線上可查出樣品蛋白質的相對分子質量4.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法聚丙烯酰胺凝膠電泳法SDS:十二烷基硫酸鈉，變性劑普通蛋白質電泳的泳動速率取決于荷質比（凈電荷、大小、形狀）用SDS和巰基乙醇（打開二硫鍵）處理蛋白質變性（肽鏈伸展）并與SDS結合，形成SDS-蛋白質復合物不同蛋白質分子的均帶負電（SDS帶負電）；且荷質比相同（蛋白質分子大，結合SDS多；分子

48、小，結合SDS少）不同蛋白質分子具有相似的構象用幾種標準蛋白質相對分子質量的對數值對它們的遷移率作圖測出待測樣品的遷移率從標準曲線上查出樣品的相對分子質量血液透析血液透析小分子溶出小分子被帶出小分子被帶出透析機透析機透析液透析液加加壓壓血液血液2 2、密度梯度（區(qū)帶）離心、密度梯度（區(qū)帶）離心6000080000轉/分重力60萬80萬倍 影響遷移率的主要因素影響遷移率的主要因素凝膠的分子篩效應對長短不同的棒形分子會 產 生不同的阻力主要因素凝膠的濃度和交聯度同一電泳條件下，分子小，受阻小，游動快，遷移率大。相對分子質量大者，遷移率小 優(yōu)點：優(yōu)點：快速，樣品用量少，可同時測幾個樣品 缺點：缺點：

49、誤差大，約為10（誤差主要來源于遷移距離的測量誤差） 此方法只能測得此方法只能測得 亞基肽鏈的相對分子質量亞基肽鏈的相對分子質量二. 蛋白質的兩性離解和電泳現象蛋白質的兩性離解和電泳現象蛋白質與多肽一樣，能夠發(fā)生兩性離解，也有等電點。在等電點時(Isoelectric point pI)，蛋白質的溶解度最小，在電場中不移動。在不同的pH環(huán)境下，蛋白質的電學性質不同。在等電點偏酸性溶液中，蛋白質粒子帶負電荷，在電場中向正極移動；在等電點偏堿性溶液中，蛋白質粒子帶正電荷，在電場中向負極移動。這種現象稱為蛋白質電泳(Electrophoresis)。 蛋白質含有酸蛋白質含有酸/ /堿堿AAAA殘基具

50、有兩性殘基具有兩性 堿堿/ /酸越大酸越大pI pI 越大越大npI通常在通常在 6.0 左右左右蛋白質的兩性電離及等電點蛋白質在等電點pH條件下，不發(fā)生電泳現象。利用蛋白質的電泳現象，可以將蛋白質進行分離純化。三三.蛋白質的膠體性質蛋白質的膠體性質由于蛋白質的分子量很大，它在水中能夠形成膠體溶液。蛋白質溶液具有膠體溶液的典型性質，如丁達爾現象、布郎運動等。由于膠體溶液中的蛋白質不能通過半透膜，因此可以應用透析法將非蛋白的小分子雜質除去。四四.蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性與它的分子量大小、所帶的電荷和水化作用有關。改變溶液的條件，將影響蛋白質的溶解性質在適當的條件下，蛋白質能夠從溶液中沉淀出來。 1

51、.(1)在溫和條件下，通過改變溶液的pH或電荷狀況，使蛋白質從膠體溶液中沉淀分離。(2) 在沉淀過程中，結構和性質都沒有發(fā)生變化，在適當的條件下，可以重新溶解形成溶液，所以這種沉淀又稱為非變性沉淀。(3)可逆沉淀是分離和純化蛋白質的基本方法，如等電點沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等。(1)在強烈沉淀條件下，不僅破壞了蛋白質膠體溶液的穩(wěn)定性，而且也破壞了蛋白質的結構和性質，產生的蛋白質沉淀不可能再重新溶解于水。(2)由于沉淀過程發(fā)生了蛋白質的結構和性質的變化，所以又稱為變性沉淀。(3)如加熱沉淀、強酸堿沉淀、重金屬鹽沉淀和生物堿沉淀等都屬于不可逆沉淀。 蛋白質的性質與它們的結構密切相關。某些物理

52、或化學因素，能夠破壞蛋白質的結構狀態(tài)，引起蛋白質理化性質改變并導致其生理活性喪失。這種現象稱為蛋白質的變性.蛋白質的蛋白質的沉淀沉淀 Pr從膠體溶液中析出從膠體溶液中析出 可逆沉淀：可逆沉淀：n溫和條件，改變溶液溫和條件，改變溶液pH或或Pr所所帶電荷帶電荷nPr結構和性質沒有變化結構和性質沒有變化n適當條件下可重新溶解適當條件下可重新溶解 非變性沉淀非變性沉淀npI沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等沉淀法、鹽析法和有機溶劑沉淀法等 不可逆沉淀不可逆沉淀n強烈沉淀條件強烈沉淀條件n破壞破壞Pr膠體溶液穩(wěn)定性膠體溶液穩(wěn)定性n也破壞也破壞Pr結構和性質結構和性質n沉淀不能再重新溶解沉淀不能再重新溶解

53、變性沉淀變性沉淀n如加熱沉淀、強酸如加熱沉淀、強酸/ /堿沉淀、重金屬鹽堿沉淀、重金屬鹽 和生物堿沉淀等和生物堿沉淀等.1.1.鹽析法鹽析法加入中性鹽脫去蛋白質的水化層，加入中性鹽脫去蛋白質的水化層，鹽析一般不引起變性鹽析一般不引起變性n等電點沉淀的蛋白質溶液中等電點沉淀的蛋白質溶液中加入加入NaCl后沉后沉淀溶解淀溶解鹽溶鹽溶n原因？原因？鹽溶鹽溶鹽析鹽析分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，分子在等電點時，相互吸引，聚合沉淀，加入少加入少量鹽離子量鹽離子后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶后破壞了這種吸引力，使分子分散，溶于水中于水中鹽溶鹽析n向蛋白質溶液中加入大量硫酸銨后蛋白向蛋白質溶液中加

54、入大量硫酸銨后蛋白質會沉淀析出質會沉淀析出n原因？原因？蛋白質脫去水化層而聚集沉淀鹽析（NH4）2SO4）2.2.有機溶劑沉淀有機溶劑沉淀脫去水化層以及降低介電常數而增脫去水化層以及降低介電常數而增加帶電質點間的相互作用加帶電質點間的相互作用3.3.等電點沉淀等電點沉淀4.4.重金屬鹽沉淀重金屬鹽沉淀 與帶負電荷蛋白質結成不溶性鹽與帶負電荷蛋白質結成不溶性鹽5.5.生物堿試劑和某些酸類沉淀生物堿試劑和某些酸類沉淀 與帶正電荷蛋白質生成不溶性鹽與帶正電荷蛋白質生成不溶性鹽6.6.加熱變性沉淀加熱變性沉淀 天然結構解體，疏水基外露，天然結構解體，疏水基外露， 破壞水化層及帶電狀態(tài)破壞水化層及帶電狀

55、態(tài) 變性蛋白質通常都是固體狀態(tài)物質，不溶于水和其它溶劑，也不可能恢復原有蛋白質所具有的性質。所以，蛋白質的變性通常都伴隨著不可逆沉淀。引起變性的主要因素是熱、紫外光、激烈的攪拌以及強酸和強堿等。大部分蛋白質均含有帶芳香環(huán)的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。這三種氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多數蛋白質在280nm 附近顯示強的吸收。利用這個性質，可以對蛋白質進行定性鑒定。七七.蛋白質的顏色反應蛋白質的顏色反應1.雙縮脲反應：雙縮脲反應： 兩分子雙縮脲與堿性硫酸銅作用，生成粉紅色的復合物含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物，能發(fā)生同樣的反應肽鍵的反應，肽鍵越多顏色越深受蛋白質特異性影響小蛋白質定量測定；測定蛋白質水解程度 2.米倫氏反應米倫氏反應酪氨酸的顯色反應（酚羥基反應）米倫試劑為硝酸、亞硝酸、硝酸汞、亞硝酸汞的混合物蛋白溶液中，加入米倫試劑，產生白色沉