第三章植物細胞培養(yǎng)2014-9

1、植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)1. 植物單細胞培養(yǎng)2. 植物細胞懸浮培養(yǎng)3. 植物細胞大規(guī)模培養(yǎng)及次生物質(zhì)生產(chǎn)4. 原生質(zhì)體培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)植物細胞培養(yǎng)(plant cell culture)指在離體條件下，將分離得到的游離的指在離體條件下，將分離得到的游離的單個細單個細胞或小細胞團胞或小細胞團，通過繼代培養(yǎng)使，通過繼代培養(yǎng)使細胞增殖細胞增殖，從而，從而獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。獲得大量細胞群體的一種技術(shù)。目的目的：獲得的細胞群體可以作獲得的細胞群體可以作為為制備有價值代謝產(chǎn)物制備有價值代謝產(chǎn)物的原料，的原料，也可以作為也可以作為細胞改良細胞改良的材料。的材料。同時也是人工種子，原生質(zhì)體同時也是人

2、工種子，原生質(zhì)體培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)等的支撐技術(shù)培養(yǎng)，花藥培養(yǎng)等的支撐技術(shù)C1.單細胞的分離與培養(yǎng)單細胞的分離與培養(yǎng)一、一、分離單細胞的方法分離單細胞的方法 1、物理方法 2、酶法 3、化學(xué)方法 機械法：機械法：主要通過機械磨碎、切割植物體從而獲主要通過機械磨碎、切割植物體從而獲得游離的單體。如葉肉組織細胞的分離。得游離的單體。如葉肉組織細胞的分離。撕去下表皮撕去下表皮露出葉肉細胞露出葉肉細胞用解剖刀刮下細胞用解剖刀刮下細胞 愈傷組織細胞愈傷組織細胞之間的結(jié)構(gòu)非常松散，因此可以通之間的結(jié)構(gòu)非常松散，因此可以通過高頻率振動從懸浮狀態(tài)的愈傷組織中振蕩下來過高頻率振動從懸浮狀態(tài)的愈傷組織中振蕩下來單個細胞

3、。單個細胞。 酶解法：酶解法：最為有效的一種獲得單細胞的方法。根據(jù)植物細胞壁的組最為有效的一種獲得單細胞的方法。根據(jù)植物細胞壁的組成特點選用成特點選用專一性水解酶專一性水解酶，在溫和條件下將壁物質(zhì)分，在溫和條件下將壁物質(zhì)分解掉，從而釋放出細胞。該法主要用于制備原生質(zhì)體。解掉，從而釋放出細胞。該法主要用于制備原生質(zhì)體。加果膠酶加果膠酶過濾、離心過濾、離心纖維素酶纖維素酶機械法和酶解法比較機械法和酶解法比較機械法機械法酶解法酶解法1. 細胞不受到酶的傷害；細胞不受到酶的傷害；2. 不用質(zhì)壁分離；不用質(zhì)壁分離；3. 細胞產(chǎn)量低；細胞產(chǎn)量低；4. 細胞易破。細胞易破。1. 細胞受到酶的傷害；細胞受到酶

4、的傷害；但易引起細胞生但易引起細胞生理改變理改變2. 要質(zhì)壁分離；要質(zhì)壁分離；3. 細胞產(chǎn)量高；細胞產(chǎn)量高；4. 細胞不易破。細胞不易破。 化學(xué)方法化學(xué)方法 在細胞懸浮培養(yǎng)中加入草酸鹽加入草酸鹽（能結(jié)合細胞間質(zhì)中果膠鈣的鈣離子 ）、秋水仙素秋水仙素、 2,4-D2,4-D或水解乳水解乳蛋白蛋白（對細胞分散有一定的作用)。 單細胞培養(yǎng)技術(shù)單細胞培養(yǎng)技術(shù)平板培養(yǎng)法平板培養(yǎng)法是將懸浮培養(yǎng)的分散細胞均勻分布在一是將懸浮培養(yǎng)的分散細胞均勻分布在一薄層薄層(1mm)(1mm)固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術(shù)。具體步驟：固體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)的技術(shù)。具體步驟： 單細胞懸浮液的制備，并記數(shù)。單細胞懸浮液的制備，并記數(shù)

5、。 調(diào)節(jié)細胞密度。調(diào)節(jié)細胞密度。1 11010 -1 -110105 5個個/ml/ml。 30-3530-35混勻澆平板?；靹驖财桨?。 2525，暗培養(yǎng)暗培養(yǎng)。2-32-3周后計算植板率。周后計算植板率。平板培養(yǎng)的效果一般用平板培養(yǎng)的效果一般用植板率植板率來衡量來衡量植板率植板率：能長出細胞團的單細胞在接種單細能長出細胞團的單細胞在接種單細胞中所占的比例。胞中所占的比例。植板率()形成的細胞團數(shù)接種的細胞數(shù)100平板培養(yǎng)注意事項：平板培養(yǎng)注意事項：應(yīng)選用旺盛分裂期細胞；應(yīng)選用旺盛分裂期細胞；操作時減少細胞損傷；操作時減少細胞損傷；黑暗或弱光培養(yǎng)。黑暗或弱光培養(yǎng)。植板密度不能低于某一植板密度不

6、能低于某一臨界值（臨界密度）臨界值（臨界密度）；110 110 5個個/ml。 臨界密度臨界密度（最低有效密度）：（最低有效密度）：單細胞培養(yǎng)時，初單細胞培養(yǎng)時，初始植板密度低于某值，培養(yǎng)細胞就不能進行分裂始植板密度低于某值，培養(yǎng)細胞就不能進行分裂和發(fā)育成細胞團，則該值就是臨界密度和發(fā)育成細胞團，則該值就是臨界密度; 平板培養(yǎng)中細胞密度和培養(yǎng)基成分是培養(yǎng)成功的平板培養(yǎng)中細胞密度和培養(yǎng)基成分是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，而細胞密度和培養(yǎng)基成分互相依賴（關(guān)鍵，而細胞密度和培養(yǎng)基成分互相依賴（負(fù)相負(fù)相關(guān)）關(guān)）; 初始植板密度應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況而改變，初始植板密度應(yīng)根據(jù)培養(yǎng)基的營養(yǎng)狀況而改變，培養(yǎng)基越復(fù)雜則植

7、板細胞的臨界密度越低，反之培養(yǎng)基越復(fù)雜則植板細胞的臨界密度越低，反之則相反。則相反。液體淺層培養(yǎng) 技術(shù)：先將細胞制成一定密度的細胞懸浮液，用吸管將懸浮液移到培養(yǎng)皿中形成淺層，一般1mm左右，石蠟?zāi)し饪?，靜置培養(yǎng)。優(yōu)點：、培養(yǎng)物與空氣接觸面大，通氣性好； 、細胞代謝產(chǎn)物容易擴散，不會造成有害 物質(zhì)的危害； 、繼代培養(yǎng)方便缺點：由于細胞可以游動，不能進行定點觀察 看護培養(yǎng)看護培養(yǎng) (nursing culture)(nursing culture)l是指用一塊活躍生長的愈傷組是指用一塊活躍生長的愈傷組織來看護單個細胞，使其持續(xù)織來看護單個細胞，使其持續(xù)生長和增殖的一種培養(yǎng)方法。生長和增殖的一種培養(yǎng)

8、方法。這塊愈傷組織被稱為看護組織。這塊愈傷組織被稱為看護組織。飼養(yǎng)層細胞和靶細胞沒有必要來自同一物種。飼養(yǎng)層細胞和靶細胞沒有必要來自同一物種。 飼養(yǎng)層培養(yǎng)（Feeder layer culture）： 把處理過的（如X射線處理）無分裂能力或分裂很慢的細胞來飼養(yǎng)所需培養(yǎng)的細胞，使其分裂和生長。 雙層濾紙培養(yǎng)雙層濾紙培養(yǎng) Horsch Horsch等（等（19801980）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相）將平板培養(yǎng)與飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法。結(jié)合，建立了雙層濾紙植板培養(yǎng)方法。培養(yǎng)基飼養(yǎng)層細胞看護濾紙層轉(zhuǎn)移濾紙培養(yǎng)細胞 微室培養(yǎng)微室培養(yǎng) 進行單細胞活體連續(xù)觀察而建立的一種微量細

9、胞進行單細胞活體連續(xù)觀察而建立的一種微量細胞培養(yǎng)技術(shù)。培養(yǎng)技術(shù)。 微室培養(yǎng)要求：微室培養(yǎng)要求： 采用光學(xué)性能好的材料；材料能使小室與外界隔絕，且能采用光學(xué)性能好的材料；材料能使小室與外界隔絕，且能保證適當(dāng)?shù)臍怏w交換。保證適當(dāng)?shù)臍怏w交換。 合適的培養(yǎng)基。能保證細胞生長和分裂。合適的培養(yǎng)基。能保證細胞生長和分裂。 選擇合適的細胞。處于旺盛分裂期細胞，壁薄，透明度高。選擇合適的細胞。處于旺盛分裂期細胞，壁薄，透明度高。優(yōu)點： 培養(yǎng)基用量少 有利于對細胞特性和單個細胞的生長發(fā)育的全過程進行跟蹤研究缺點：通氣性差，水分難保持，pH易變動。 主要指將主要指將單個游離細胞或小細胞團單個游離細胞或小細胞團在在

10、液體液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)基進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。培養(yǎng)增殖的技術(shù)。 優(yōu)點：優(yōu)點：增加培養(yǎng)細胞與培養(yǎng)液的接觸面，改善營養(yǎng)供應(yīng)改善營養(yǎng)供應(yīng)；在振蕩條件下可避免細胞代謝產(chǎn)生的有害物質(zhì)有害物質(zhì)在局部積累而對細胞自身產(chǎn)生毒害；振蕩培養(yǎng)可以適當(dāng)改善氣體的交換改善氣體的交換；(suspension culture) 細胞懸浮培養(yǎng)一般過程細胞懸浮培養(yǎng)一般過程1.1.疏松易碎愈傷組織誘導(dǎo)疏松易碎愈傷組織誘導(dǎo)：易碎的愈傷組織，震易碎的愈傷組織，震蕩培養(yǎng)蕩培養(yǎng)1-21-2個周；三角瓶和旋轉(zhuǎn)搖床（個周；三角瓶和旋轉(zhuǎn)搖床（80-80-120rpm120rpm）；）；2.2.懸浮細胞的選?。簯腋〖毎倪x?。汉Y網(wǎng)過濾；吸取上部懸

11、浮液；篩網(wǎng)過濾；吸取上部懸浮液； 3.3.懸浮細胞的保持：懸浮細胞的保持：繼代培養(yǎng)。周期與接種量：繼代培養(yǎng)。周期與接種量：1-21-2周，周，1 1：4 41 1：1010。保存好種子細胞系；。保存好種子細胞系；4.4. 以生產(chǎn)代謝產(chǎn)物為目的的細胞懸浮培養(yǎng)以生產(chǎn)代謝產(chǎn)物為目的的細胞懸浮培養(yǎng)，則應(yīng)，則應(yīng)采取適當(dāng)措施分散開不斷聚集的細胞團，使細采取適當(dāng)措施分散開不斷聚集的細胞團，使細胞保持繼續(xù)增殖，胞保持繼續(xù)增殖，達到最高細胞密度達到最高細胞密度，收獲目，收獲目的產(chǎn)物。的產(chǎn)物。愈傷組織形成和植株再生愈傷組織形成和植株再生：懸浮細胞可直接形成胚：懸浮細胞可直接形成胚狀體或經(jīng)愈傷組織分化成再生植株（快

12、繁）狀體或經(jīng)愈傷組織分化成再生植株（快繁） 懸浮細胞生長與增殖懸浮細胞生長與增殖 延遲期，對數(shù)生長期、直線生長期、減緩期、延遲期，對數(shù)生長期、直線生長期、減緩期、靜止期、衰亡期。靜止期、衰亡期。 影響懸浮細胞生長的因素：影響懸浮細胞生長的因素：1 1、 起始愈傷組織的質(zhì)量（增殖快、再生能起始愈傷組織的質(zhì)量（增殖快、再生能力強）力強）2 2、 接種細胞密度接種細胞密度3 3、培養(yǎng)條件：方式、溫度、培養(yǎng)條件：方式、溫度 懸浮培養(yǎng)細胞的生長及測定懸浮培養(yǎng)細胞的生長及測定最低有效密度或臨界起始密度最低有效密度或臨界起始密度：細胞的生長周期細胞的生長周期：從開始培養(yǎng)起至細胞增長停：從開始培養(yǎng)起至細胞增長

13、停止的靜止期為止。止的靜止期為止。有絲分裂指數(shù)有絲分裂指數(shù)：在一個細胞群體中，處于有絲：在一個細胞群體中，處于有絲分裂的細胞占總細胞的百分?jǐn)?shù)。分裂的細胞占總細胞的百分?jǐn)?shù)。 懸浮細胞培養(yǎng)的同步化懸浮細胞培養(yǎng)的同步化定義：定義：細胞同時通過細胞周期的某一特定時期。細胞同時通過細胞周期的某一特定時期。計量同步化的方法：計量同步化的方法：某一瞬間處于細胞周期某一特某一瞬間處于細胞周期某一特定點上的細胞所占的百分?jǐn)?shù)；在一定時間內(nèi)，通過細定點上的細胞所占的百分?jǐn)?shù)；在一定時間內(nèi)，通過細胞周期某一點（如進入有絲分裂）的細胞百分率；全胞周期某一點（如進入有絲分裂）的細胞百分率；全部細胞通過細胞周期某一點（如有絲

14、分裂后期）所需部細胞通過細胞周期某一點（如有絲分裂后期）所需時間占整個細胞周期時間的百分率。時間占整個細胞周期時間的百分率。1、體積選擇法：將培養(yǎng)細胞經(jīng)過一定大小的體積選擇法：將培養(yǎng)細胞經(jīng)過一定大小的篩網(wǎng)過濾，對細胞按大小分別進行收集。篩網(wǎng)過濾，對細胞按大小分別進行收集。 梯度離心法 流式細胞儀2 2、冷處理法：先收集細胞，后在低溫（一般、冷處理法：先收集細胞，后在低溫（一般為為4 4度）下處理一定時間后加培養(yǎng)液培養(yǎng)。度）下處理一定時間后加培養(yǎng)液培養(yǎng)。（一）物理方法（一）物理方法1、饑餓法饑餓法：控制營養(yǎng)使細胞處于饑餓狀態(tài)，：控制營養(yǎng)使細胞處于饑餓狀態(tài)，后加營養(yǎng)培養(yǎng)；后加營養(yǎng)培養(yǎng)；2 2、有絲

15、分裂抑制法有絲分裂抑制法：向培養(yǎng)液中加入化學(xué)抑：向培養(yǎng)液中加入化學(xué)抑制劑抑制細胞分裂，包括尿苷、秋水仙素制劑抑制細胞分裂，包括尿苷、秋水仙素（二）化學(xué)方法（二）化學(xué)方法 注意：注意：沒有普遍實用的細胞同步化方法，沒有普遍實用的細胞同步化方法，在實際操作過程中要綜合應(yīng)用各種方法，在實際操作過程中要綜合應(yīng)用各種方法，即使這樣，要達到即使這樣，要達到高度的細胞同步化也是高度的細胞同步化也是相當(dāng)困難的。相當(dāng)困難的。植物細胞的特點植物細胞的特點機械攪拌式反應(yīng)器鼓泡式反應(yīng)器氣升式反應(yīng)器植物細胞培養(yǎng)反應(yīng)器3. 植物細胞培養(yǎng)制備代謝產(chǎn)物植物細胞培養(yǎng)制備代謝產(chǎn)物 初級代謝產(chǎn)物（初級代謝產(chǎn)物（Primary me

16、tabolitesPrimary metabolites） 是通過初級代謝產(chǎn)生的維持細胞生命活動必需的物質(zhì)維持細胞生命活動必需的物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂類等。在不同種類的細胞中，初級代謝產(chǎn)物的種類基本相同。 次級代謝產(chǎn)物（次級代謝產(chǎn)物（Secondary metabolitesSecondary metabolites） 是通過次級代謝合成的產(chǎn)物，大多是分子結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜的小分子化合物，例如抗生素、激素、生物堿、毒素等。由于次級代謝產(chǎn)物大多具有生物活性，因此是植物代謝產(chǎn)物研究的重點。 工業(yè)生產(chǎn)基本步驟工業(yè)生產(chǎn)基本步驟建立細胞株建立細胞株：包括材料的選擇，愈傷組織和：包括材料的選擇，愈傷組

17、織和懸浮細胞的懸浮細胞的誘導(dǎo)，優(yōu)良細胞系的篩選誘導(dǎo)，優(yōu)良細胞系的篩選及保存，最適生長條件和產(chǎn)量條及保存，最適生長條件和產(chǎn)量條件的研究。件的研究。擴大培養(yǎng)（種子培養(yǎng)）：擴大培養(yǎng)（種子培養(yǎng)）：將優(yōu)良的生產(chǎn)用的細胞株經(jīng)過將優(yōu)良的生產(chǎn)用的細胞株經(jīng)過幾次擴大繁殖，得到大量的培養(yǎng)細胞，為大規(guī)模培養(yǎng)時的幾次擴大繁殖，得到大量的培養(yǎng)細胞，為大規(guī)模培養(yǎng)時的接種材料。接種材料。大罐培養(yǎng)（發(fā)酵）：大罐培養(yǎng)（發(fā)酵）：采用成批的，半連續(xù)的和連續(xù)的培采用成批的，半連續(xù)的和連續(xù)的培養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細胞。如一步培養(yǎng)法，二步培養(yǎng)法。養(yǎng)系統(tǒng)培養(yǎng)細胞。如一步培養(yǎng)法，二步培養(yǎng)法。提取和純化產(chǎn)品提取和純化產(chǎn)品適合工業(yè)生產(chǎn)用細胞株的一般篩選流

18、程適合工業(yè)生產(chǎn)用細胞株的一般篩選流程 1.愈傷組織的誘導(dǎo)與培養(yǎng)：選用植物的目標(biāo)化合物高產(chǎn)部位作為外植體誘導(dǎo)愈傷組織。愈傷組織形成后，進行繼代培養(yǎng)。 2.單細胞分離：選取生長快速而疏松的愈傷組織，通過固體培養(yǎng)基繼代培養(yǎng)，挑選生長快速的細胞。 3.細胞無性系的分離：轉(zhuǎn)移到液體培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng)，從中選擇分散性好、生長速度快的細胞。 4.細胞株篩選：檢測目標(biāo)產(chǎn)物含量，從（3）中選擇目標(biāo)產(chǎn)物含量高的細胞株。 5.性能評價：進行較大規(guī)模培養(yǎng)，考察細胞生長與目標(biāo)產(chǎn)物合成的穩(wěn)定性。 6.細胞株獲得：得到適合工業(yè)化生產(chǎn)的細胞株，保種。培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)基的選擇 適合細胞生長的培養(yǎng)基不一定適合目的產(chǎn)物適合細胞生

19、長的培養(yǎng)基不一定適合目的產(chǎn)物的生產(chǎn)，因此，采用兩步培養(yǎng)法。的生產(chǎn)，因此，采用兩步培養(yǎng)法。 (1)(1)維持培養(yǎng)基維持培養(yǎng)基(maintenance media)(maintenance media) 盡可能快的使細胞量增長盡可能快的使細胞量增長(2)(2)生產(chǎn)培養(yǎng)基生產(chǎn)培養(yǎng)基(production media)(production media)誘發(fā)和保持次生代謝旺盛，積累相應(yīng)代謝產(chǎn)物誘發(fā)和保持次生代謝旺盛，積累相應(yīng)代謝產(chǎn)物影響次級代謝產(chǎn)物的因素影響次級代謝產(chǎn)物的因素 植物生長物質(zhì)：植物生長物質(zhì)：2 2，4-D4-D、NAANAA、IAAIAA、6-BA6-BA、等。、等。 前體：合成代謝物所

20、必需的前體物質(zhì)。前體：合成代謝物所必需的前體物質(zhì)。 誘導(dǎo)子：能引起植物細胞某些代謝強度或代謝途徑誘導(dǎo)子：能引起植物細胞某些代謝強度或代謝途徑發(fā)生改變的物質(zhì)。包括生物（微生物或其提取物等）發(fā)生改變的物質(zhì)。包括生物（微生物或其提取物等）和非生物（輻射、金屬離子等）兩類。和非生物（輻射、金屬離子等）兩類。 培養(yǎng)條件培養(yǎng)條件 光：光照時間、光質(zhì)、光強均有影響。光：光照時間、光質(zhì)、光強均有影響。 溫度：應(yīng)根據(jù)不同細胞培養(yǎng)物及合成不同次溫度：應(yīng)根據(jù)不同細胞培養(yǎng)物及合成不同次生代謝物種類而定。生代謝物種類而定。 PHPH：一般在：一般在5-65-6之間。之間。植物細胞培養(yǎng)技術(shù)的意義：植物細胞培養(yǎng)技術(shù)的意義：

21、1)1)節(jié)約能源，減少耕地占用面積，而且不受季節(jié)、地節(jié)約能源，減少耕地占用面積，而且不受季節(jié)、地域限制。有利于對生態(tài)環(huán)境和珍稀植物資源的保護。域限制。有利于對生態(tài)環(huán)境和珍稀植物資源的保護。2)2)排除病菌和害蟲影響。排除病菌和害蟲影響。3)3)可通過特定生物轉(zhuǎn)化途徑獲得均一的有效成分?？赏ㄟ^特定生物轉(zhuǎn)化途徑獲得均一的有效成分。4)4)利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥物和一些工業(yè)原料已利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)藥物和一些工業(yè)原料已成為工業(yè)化生產(chǎn)植物產(chǎn)品的一條有效途徑。通過植成為工業(yè)化生產(chǎn)植物產(chǎn)品的一條有效途徑。通過植物細胞培養(yǎng)可以生產(chǎn)相當(dāng)于幾倍或幾十倍完整植株物細胞培養(yǎng)可以生產(chǎn)相當(dāng)于幾倍或幾十倍完整植株

22、所產(chǎn)生的次生物質(zhì)。具有極大的經(jīng)濟效益。所產(chǎn)生的次生物質(zhì)。具有極大的經(jīng)濟效益。前提：前提：資源匱乏資源匱乏；引種栽培困難；次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)；引種栽培困難；次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)清楚，藥效肯定；結(jié)構(gòu)清楚，藥效肯定；培養(yǎng)技術(shù)可行培養(yǎng)技術(shù)可行；經(jīng)濟效益高經(jīng)濟效益高。植物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用：藥物代謝產(chǎn)物藥物代謝產(chǎn)物目前采用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物成分主要包括：目前采用植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物成分主要包括：苷類：皂苷、強心苷、甘草皂苷、香豆精苷等。苷類：皂苷、強心苷、甘草皂苷、香豆精苷等。淄醇：菜油、豆、谷、膽、異巖藻淄醇等。淄醇：菜油、豆、谷、膽、異巖藻淄醇等。生物堿：吡啶、喹啉、異

23、喹啉等。生物堿：吡啶、喹啉、異喹啉等。醌類：恩醌、萘醌、返醌等。醌類：恩醌、萘醌、返醌等。蛋白質(zhì)類：胰島素、氨基酸、蛋白酶抑制劑、植物病毒蛋白質(zhì)類：胰島素、氨基酸、蛋白酶抑制劑、植物病毒抑制劑、植物抗生素等。抑制劑、植物抗生素等。紫杉醇、紫草寧、人參。紫杉醇、紫草寧、人參。 天然食品、食品添加劑天然食品、食品添加劑 色素：色素：胡蘿卜素、葉黃素、單寧、黃酮體等。胡蘿卜素、葉黃素、單寧、黃酮體等?？Х瓤Х瓤煽蓧A、咖啡堿；可可堿、咖啡堿；海藻海藻瓊脂；瓊脂；甜菊葉甜菊葉甜菊苷；甜菊苷；辣椒辣椒辣椒素辣椒素。 殺蟲劑、殺菌劑殺蟲劑、殺菌劑從萬壽菊從萬壽菊農(nóng)藥唾吩烷；農(nóng)藥唾吩烷；從鷹嘴豆和掃帚艾從鷹嘴

24、豆和掃帚艾三種魚藤生物堿、灰葉素、三種魚藤生物堿、灰葉素、魚藤酮以及除蟲菊脂等；魚藤酮以及除蟲菊脂等；從葫蘆巴（香草）從葫蘆巴（香草）藍魚藤酮、粉紅魚藤酮等殺藍魚藤酮、粉紅魚藤酮等殺蟲劑；蟲劑；從錦葵葉從錦葵葉生物堿。生物堿。 飼料、精細化工等產(chǎn)品飼料、精細化工等產(chǎn)品蠶飼料：桑、蓖麻、榆等。蠶飼料：桑、蓖麻、榆等。銀膠菌細胞愈傷組織中生產(chǎn)橡膠。銀膠菌細胞愈傷組織中生產(chǎn)橡膠。4.原生質(zhì)培養(yǎng) 原生質(zhì)體(protoplast)：脫去細胞壁、裸露的細胞。又稱原生質(zhì)球 。原生質(zhì)體是為質(zhì)膜所包圍的裸露細胞。 亞原生質(zhì)體(subprotoplast) 在原生質(zhì)體分離過程中，有時會引起細胞內(nèi)含物的斷裂而形成的

25、一些較小的原生質(zhì)體。它可以具有細胞核，也可不具有細胞核 胞質(zhì)體(cytoplast) 不含細胞核，而僅含有細胞質(zhì)的原生質(zhì)體 植物原生質(zhì)體的特點植物原生質(zhì)體的特點：1 1、吸收能力增強：、吸收能力增強：易于攝取外來遺傳物質(zhì)、細胞器、細菌、病毒等；易于吸收氧、養(yǎng)分；2 2、具有全能性：、具有全能性：具有全套的遺傳物質(zhì)，具有細胞壁再生并能進行人工培養(yǎng)分化發(fā)育成完整植株的能力； 3 3、在一定條件下可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合、在一定條件下可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，形成雜種細胞 。4 4、分泌能力提高、分泌能力提高 去除了細胞壁的擴散障礙，使細胞膜的透過性增強，利于胞內(nèi)產(chǎn)物的分泌。5 5、穩(wěn)定性較差、穩(wěn)定性較差 失去

26、了細胞壁的保護作用，穩(wěn)定性較差，易于受到滲透壓等條件變化的影響。a、在基礎(chǔ)理論方面 進行細胞壁的再生、細胞膜離子轉(zhuǎn)運、病毒浸染機理研究的最佳試驗材料； 分離細胞器和易破壞的大分子方面具有優(yōu)越性。b、作物改良方面 通過原生質(zhì)體融合再生植株可克服遠緣雜交的不親和性； 通過體細胞雜交可轉(zhuǎn)移胞質(zhì)基因； 原生質(zhì)體是遺傳轉(zhuǎn)化的理想受體。植物原生質(zhì)體的分離和培養(yǎng)v材料選擇v原生質(zhì)體分離的方法v原生質(zhì)體純化v原生質(zhì)體活力測定v影響原生質(zhì)體數(shù)量和活力的因素v原生質(zhì)體培養(yǎng)方法v影響原生質(zhì)體培養(yǎng)的因素v原生質(zhì)體再生過程一一 原生質(zhì)體的分離原生質(zhì)體的分離 材料來源 最方便的來源是葉片，因為葉片中可以分離出大量的比較均

27、一的細胞，而又不致使植物遭到致命的破壞。 由于葉肉細胞排列疏松，酶的作用很容易達到細胞壁。 植株的年齡和生長條件是十分重要的。 2 2 原生質(zhì)體的分離方法原生質(zhì)體的分離方法 機械分離機械分離先質(zhì)壁分離，然后隨機切片。對高度液泡化的細胞有效先質(zhì)壁分離，然后隨機切片。對高度液泡化的細胞有效，受材料限制，費時費力。，受材料限制，費時費力。優(yōu)點：（1）能排除酶的有害影響；缺點：（1）原生質(zhì)體的產(chǎn)量低；（2）方法繁瑣費力；（3）局限性大酶解法酶解法 1960年英國諾丁漢大學(xué)的科金第一次用酶解法從番茄幼苗根尖中大量制備出原生質(zhì)體； 常用酶：纖維素酶類、果膠酶類、半纖維素酶、蝸牛酶等； 優(yōu)點：條件溫和、原生

28、質(zhì)體完整性好、活力高、得率高，而且?guī)缀跛械闹参锘蛩鼈兊钠鞴俳M織或細胞均可用酶解法獲得原生質(zhì)體。 缺點：酶制劑中均含有核酸酶、蛋白酶、過氧化物酶以及酚類物質(zhì)，影響所獲原生質(zhì)體的活力。 原生質(zhì)體分離常用的商品酶原生質(zhì)體分離常用的商品酶 酶酶 來源來源 生產(chǎn)廠家生產(chǎn)廠家纖維素酶類纖維素酶類onozuka R10 綠色木霉綠色木霉 Yakult Honsha Co. Ltd., Tokyo, JapanCellulysin 綠色木霉綠色木霉 Calbiochem., San Diego, CA 92037, USADriselase Irpex lutens Kayowa Hakko Kogyo C

29、o., Tokyo, Japan果膠酶類果膠酶類Macerozyme R-10 根霉根霉 Yakylt Honsha Co. Ltd.,Tokyo, JapanPectinase 黑曲霉黑曲霉 Sigma Chemical Co., St. Louit, MO 63178,USAPectolyase Y-23 黑曲霉黑曲霉 Seishin Pharm. Co. Ltd., Tokyo, Japan半纖維素酶半纖維素酶Rhozyme HP-150 黑曲酶黑曲酶Rohm and Hass Co., Philadelphia, PA 19105, USAHemicellulase 黑曲霉黑曲霉 Si

30、gma Chemical Co.,St. Louis, MO 63178,USA 步驟步驟： 兩步法：兩步法：解離酶與纖維素酶的使用是解離酶與纖維素酶的使用是一先一后，兩步緊緊相連。開始用解離一先一后，兩步緊緊相連。開始用解離酶將細胞解離，然后在纖維素酶的作用酶將細胞解離，然后在纖維素酶的作用將細胞轉(zhuǎn)化成原生質(zhì)體。將細胞轉(zhuǎn)化成原生質(zhì)體。 一步法：一步法：將植物組織直接放入纖維素將植物組織直接放入纖維素酶和果膠酶的混合酶液中酶解。酶和果膠酶的混合酶液中酶解。圖示：原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）圖示：原生質(zhì)體分離過程（以葉片為例）過濾、離心過濾、離心加果膠酶加果膠酶和纖維素酶和纖維素酶 注意事項：

31、注意事項： 酶溶劑及其滲透壓酶溶劑及其滲透壓 酶溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制，酶溶劑：原生質(zhì)體培養(yǎng)基或特殊配制， PH PH。 滲透壓調(diào)節(jié)劑：滲透壓調(diào)節(jié)劑： 有機有機：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等 濃度范圍濃度范圍450450800mmol/L800mmol/L 無機無機：CaCl2，KCl, Ca(NO3)2 酶處理：酶處理： 酶濃度酶濃度 酶解時間酶解時間 酶解溫度酶解溫度 原生質(zhì)體的純化原生質(zhì)體的純化 （去除酶和非原生質(zhì)體）（去除酶和非原生質(zhì)體） 三種方法三種方法離心沉淀法離心沉淀法漂浮法漂浮法界面法界面法沉 淀 法 利用比重原理，在具有一定滲透壓的溶液中，先進行

32、過濾然后低速離心，使純凈完整的原生質(zhì)體沉積于試管底部。優(yōu)缺點：純化原生質(zhì)體比較簡單。由于原生質(zhì)體沉積于試管底部，造成相互擠壓，常引起原生質(zhì)體的破碎。漂浮法原理：利用比重大于原生質(zhì)體的高滲蔗糖原理：利用比重大于原生質(zhì)體的高滲蔗糖溶液，離心后使原生質(zhì)體漂浮其上，殘渣溶液，離心后使原生質(zhì)體漂浮其上，殘渣碎屑沉到管底碎屑沉到管底。 離心后碎屑沉到管底，一個純凈的原生離心后碎屑沉到管底，一個純凈的原生質(zhì)體帶出現(xiàn)在蔗糖溶液和原生質(zhì)體懸浮液質(zhì)體帶出現(xiàn)在蔗糖溶液和原生質(zhì)體懸浮液培養(yǎng)基的界面上。培養(yǎng)基的界面上。界面法界面法500mmol/L蔗糖蔗糖 140mmol/L蔗糖蔗糖+360mmol/L山梨醇山梨醇原理

33、：原理：選兩種不同滲透濃度的溶液，其選兩種不同滲透濃度的溶液，其中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，中一種溶液密度大于原生質(zhì)體的密度，另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。另一種溶液小于原生質(zhì)體的密度。100mmol/LCaCL2+300mmol/L山梨醇山梨醇+原生質(zhì)體原生質(zhì)體原生質(zhì)體一步酶解和沉淀純化游離流程原生質(zhì)體一步酶解和沉淀純化游離流程離心離心去掉表皮去掉表皮原生質(zhì)體沉降于底部原生質(zhì)體沉降于底部過濾過濾吸去上層液吸去上層液酶解酶解粗原生質(zhì)體液粗原生質(zhì)體液加入清洗液加入清洗液離心離心吸去上層液吸去上層液加入培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基離心離心吸去上層液吸去上層液加入培養(yǎng)基加入培養(yǎng)基取少量記數(shù)取少量記數(shù)純化原

34、生質(zhì)體液純化原生質(zhì)體液 原生質(zhì)體的活力鑒定原生質(zhì)體的活力鑒定 形態(tài)識別形態(tài)識別 形態(tài)完整、富形態(tài)完整、富含細胞質(zhì)、顏色含細胞質(zhì)、顏色新鮮的正常球形，新鮮的正常球形，放入低滲溶液中，放入低滲溶液中，可正常膨大?？烧Ｅ虼?。 FDAFDA (fluorescein diacetate(fluorescein diacetate， 二乙酸熒光素二乙酸熒光素) )： 本身不發(fā)熒光本身不發(fā)熒光也不具有極性，能自由穿過細胞也不具有極性，能自由穿過細胞質(zhì)膜?；罴毎麅?nèi)質(zhì)膜。活細胞內(nèi)FDAFDA可以被酯酶裂可以被酯酶裂解，將能發(fā)熒光的極性部分釋放解，將能發(fā)熒光的極性部分釋放出來。熒光素則不能自由穿越質(zhì)出來。熒光

35、素則不能自由穿越質(zhì)膜，在完整的活細胞內(nèi)積累膜，在完整的活細胞內(nèi)積累。使用濃度：使用濃度：0 0.01%01%熒光顯微鏡識別熒光顯微鏡識別(FDA(FDA法法) ) 酚藏花紅染色法（酚藏花紅染色法（0.1%)0.1%) 酚藏花紅能使無活力的原生質(zhì)酚藏花紅能使無活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體染成紅色，有活力的原生質(zhì)體不著色。體不著色。 伊凡藍伊凡藍(Evans blue)(Evans blue)染色法染色法(0.025%)(0.025%)有活力但受損傷的細胞和死細胞能有活力但受損傷的細胞和死細胞能夠攝取這種染料，活細胞不攝取。夠攝取這種染料，活細胞不攝取。 氧電極法氧電極法 原生質(zhì)體的培

36、養(yǎng)原生質(zhì)體的培養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)基特殊性：需滲透壓穩(wěn)定劑；膜的透性強，需要的特殊性：需滲透壓穩(wěn)定劑；膜的透性強，需要的營養(yǎng)成分更多；脆弱。營養(yǎng)成分更多；脆弱。無機鹽：大量元素濃度；無機鹽：大量元素濃度；NONO3 3和和NHNH4 4+ +的比例；的比例；CaCa2+2+濃度濃度有機成分：維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提有機成分：維生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。取物、水解酪蛋白。 激素：激素：NAANAA、IAAIAA、BABA與與2,4-2,4-D D滲透壓滲透壓：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等原生質(zhì)體培養(yǎng)方法原生質(zhì)體培養(yǎng)方法液體淺層培養(yǎng)法液體

37、淺層培養(yǎng)法v優(yōu)點：優(yōu)點： 原生質(zhì)體在液體環(huán)境中有原生質(zhì)體在液體環(huán)境中有較強的吸收營養(yǎng)物質(zhì)較強的吸收營養(yǎng)物質(zhì)的的能力，表現(xiàn)出較強的細胞分裂能力。操作簡單，能力，表現(xiàn)出較強的細胞分裂能力。操作簡單，對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和對原生質(zhì)體的損傷小，且易于添加新鮮培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。轉(zhuǎn)移培養(yǎng)物。v缺點：缺點： 原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體分布不均勻，常常發(fā)生原生質(zhì)體之間的原生質(zhì)體之間的粘連現(xiàn)象粘連現(xiàn)象而影響其進一步的生長和發(fā)育。此外，而影響其進一步的生長和發(fā)育。此外，難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情況。難以跟蹤觀察某一個細胞的發(fā)育情況。雙層培養(yǎng)法雙層培養(yǎng)法液體液體- -固體雙層培養(yǎng)

38、法固體雙層培養(yǎng)法 優(yōu)點：優(yōu)點： 固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢放到液體固體培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)可以緩慢放到液體培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一培養(yǎng)基中，如果在下層固體培養(yǎng)基中添加一定量的活性炭，則還可能吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的定量的活性炭，則還可能吸附培養(yǎng)物產(chǎn)生的一些有害物質(zhì)，促進原生質(zhì)體的分裂和細胞一些有害物質(zhì)，促進原生質(zhì)體的分裂和細胞團的形成。團的形成。 缺點：缺點： 不易觀察細胞的發(fā)育過程不易觀察細胞的發(fā)育過程。固體薄層培養(yǎng)法固體薄層培養(yǎng)法v 優(yōu)點：優(yōu)點： 使原生質(zhì)體處于固定位置，避免了原生質(zhì)體的漂使原生質(zhì)體處于固定位置，避免了原生質(zhì)體的漂浮游動，有利于對單個原生質(zhì)體的細胞壁再生及浮游動，有利于對單個原生質(zhì)體的細胞壁再生及細胞團形成的全過程進行定點觀察。細胞團形成的全過程進行定點觀察。v 缺點：缺點：固體中單細胞生活能力弱，通氣狀況不良，第一次固體中單細胞生活能力弱，通氣狀況不良，第一次細胞分裂時間會推遲細胞分裂時間會推遲2d2d左右。左右。瓊脂糖珠培養(yǎng)瓊脂糖珠培養(yǎng) 將含有原生質(zhì)體的液態(tài)瓊脂糖培養(yǎng)基用吸管以大約50ml一滴的量滴于直徑6cm的培養(yǎng)皿，待其固化后向其中添加3ml液體培養(yǎng)基并于搖床上低速旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。 改善了培養(yǎng)物的通氣和營養(yǎng)環(huán)境，從而促進了原生質(zhì)體的分裂和細胞團的形成。原生質(zhì)體培養(yǎng)條件 密度： 平板培養(yǎng)10