植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)

1、曠曠植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)主編 張立軍參編 （按姓氏漢語拚音） 樊金娟 郝建軍 劉延吉 阮燕曄 朱延姝沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生理學(xué)教研室2004年1 月序?qū)嶒炚n是提高學(xué)生動手能力，提高分析問題和解決問題能力的重要途徑。植物生理學(xué)教研室的全體教師和實驗技術(shù)人員經(jīng)過多年的教改探索，認(rèn)為實驗課教學(xué)要注意基本實驗技能的訓(xùn)練、要有助于提高學(xué)生的動手能力，有助于使學(xué)生熟悉實驗工作；實驗內(nèi)容要有挑戰(zhàn)性，能夠吸引學(xué)生的興趣。為此，我們在借鑒國外高校和國內(nèi)其他高校的先進教學(xué)經(jīng)驗的基礎(chǔ)上，提出了一系列提高實驗課教學(xué)質(zhì)量的改革措施，這些措施涉及到實驗內(nèi)容的設(shè)置、實驗的設(shè)計、實驗報告的寫作，以及實驗指導(dǎo)書的編寫等多個方面。本學(xué)

2、期的實驗教學(xué)是我們實驗教學(xué)改革探索的一部分。所有的實驗都設(shè)計成研究型的，有適當(dāng)?shù)奶幚?，并盡可能的設(shè)置重復(fù)。同學(xué)們能夠通過實驗解釋一個理論或?qū)嶋H問題。在本次編寫的實驗指導(dǎo)中我們給出了大量的思考題，有的涉及實驗中應(yīng)注意的問題，有的涉及實驗技術(shù)的應(yīng)用，有的涉及實驗方法的應(yīng)用擴展；此外，我們還要求實驗報告的形式類似于正式發(fā)表的科研報告，并附有寫作說明，這有利于培養(yǎng)學(xué)生寫作科研論文的能力。為了培養(yǎng)良好的科研習(xí)慣，對每個實驗還都給出相應(yīng)的記錄方式。本學(xué)期是我們教研室首次按這項教學(xué)改革研究成果組織教學(xué)，希望廣大同學(xué)配合，也希望相關(guān)專業(yè)老師、相關(guān)部門的領(lǐng)導(dǎo)及廣大同學(xué)提出寶貴意見、以便使植物生理學(xué)實驗教學(xué)改革更

3、加完善。張立軍2004 年1月30日附：參加教學(xué)改革人員： 劉延吉 郝建軍 樊金娟 朱延姝 阮燕曄 康宗利 付淑杰 于洋 目 錄Section 1（1h）植物生理學(xué)實驗課簡介1 教學(xué)目的2 教學(xué)要求和考核3 實驗內(nèi)容介紹4 實驗室安全要求Section 2（6h）一、植物的光合速率測定-改良半葉法二、植物葉綠素素含量測定-丙酮提取法Section 3（6h）三、植物組織水勢測定-小液流法四、植物根系活力測定-甲烯藍(lán)法Section 4（6h）五、植物抗逆性鑒定-電導(dǎo)率儀法六、植物組織丙二醛含量測定Section 5（4h）七、植物組織硝態(tài)氮含量的測定Section 6（4h）八、植物呼吸酶活性

4、測定 附錄一、如何寫實驗報告二、簡單常用的生物統(tǒng)計公式三、分光光度計的操作四、電導(dǎo)率儀的操作Section 1（1h）植物生理學(xué)實驗課簡介1教學(xué)目的植物生理學(xué)是一門實驗科學(xué)，植物生命活動的基本規(guī)律和及其生理機制都是通過實驗揭示的。所以掌握植物生理學(xué)的實驗技術(shù)、基本原理以及研究過程對了解植物生理學(xué)的基本理論是非常重要的。本課程的主要目的有：(1) 直接驗證一些植物生理學(xué)理論；(2) 熟悉植物生理學(xué)實驗程序；(3) 學(xué)習(xí)如何提出問題及假設(shè)并用特定實驗證實或解決；(4) 鍛煉協(xié)同工作能力和獨立工作能力；(5) 學(xué)習(xí)植物生理學(xué)實驗報告和科研報告的寫作。(6) 培養(yǎng)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲凶黠L(fēng)。（7）鍛煉自學(xué)能力。2

5、教學(xué)要求和考核選修本門課程的學(xué)生在上實驗前必須熟悉實驗室要求，每次實驗前要對內(nèi)容進行預(yù)習(xí)。實驗課不得缺席。缺席者不得參加期末考試，成績計為不及格。植物生理實驗單獨計成績（100分）?？己税ㄆ綍r表現(xiàn)（20分）、實驗前作業(yè)（10分）、實驗報告（30分）、實驗后作業(yè)（10分）和期末考試（30分）五個部分。只要有一次不提交實驗作業(yè)或不提交實驗報告，不得參加期末考試，最終成績計為不及格。期末考試覆蓋植物生理學(xué)實驗教學(xué)的全部內(nèi)容。期末考試時間為1學(xué)時。平時表現(xiàn)包括是否按時到達(dá)實驗室，是否預(yù)習(xí)實驗內(nèi)容，是否遵守實驗室紀(jì)律，是否認(rèn)真操作，是否做好實驗記錄，是否作風(fēng)嚴(yán)謹(jǐn)，是否整潔，是否按要求值日，是否按時提交

6、作業(yè)和實驗報告。作業(yè)和實驗報告都要標(biāo)明同組同學(xué)姓名。作業(yè)指回答每個實驗所給出的思考題。思考題分為兩部分。一部分是實驗前的預(yù)習(xí)題，另一部分是實驗后的思考題。回答問題所涉及的知識不局限于本實驗指導(dǎo)書，需要參考理論課教科書、其他實驗指導(dǎo)書和網(wǎng)絡(luò)資料。由于植物生理學(xué)理論教學(xué)和實驗教學(xué)并不同步，因此作業(yè)要靠同學(xué)們自學(xué)完成。作業(yè)可由同組同學(xué)合作完成。但每個同學(xué)必須獨立提交作業(yè)。預(yù)習(xí)作業(yè)在每次實驗開始前提交，做為預(yù)習(xí)情況檢查的一部分，由指導(dǎo)老師檢查后再返回，預(yù)習(xí)作業(yè)不合格者不得參加實驗。返回的預(yù)習(xí)作業(yè)完善后再與實驗后作業(yè)本以及實驗報告一并于實驗后一周內(nèi)由課代表統(tǒng)一提交。實驗報告的寫作見附錄。實驗報告在實驗后

7、的一周內(nèi)提交。實驗報告最好打印。同組同學(xué)可分享數(shù)據(jù)，但是所有的寫作、圖表繪制、數(shù)據(jù)計算和分析必須獨立完成。如果發(fā)現(xiàn)雷同報告兩次者，取消雷同報告者的實驗課考試資格，最終成績評定為不及格。實驗報告成績綜合下列各個方面評定：（1） 是否提出問題和假設(shè)并清楚的進行闡述；（2） 是否清楚地敘述實驗程序；（3） 實驗數(shù)據(jù)是否清楚的既用表又用圖表示；（4） 結(jié)果部分是否有語言描述；（5） 結(jié)論是否適當(dāng)以及是否與測定數(shù)據(jù)有關(guān)；（6） 是否解釋數(shù)據(jù)支持或否定假設(shè)的原因，或有沒有解釋實驗是否解決所提問題；（7） 是否提出存在問題并做出解釋，以及提出后續(xù)試驗；（8） 實驗報告是否簡潔；（9） 實驗報告是否組織良好；

8、（10） 實驗報告是否完整；（11） 實驗報告語法和書寫是否正確。3實驗內(nèi)容介紹全部植物生理學(xué)實驗包括五個部分8個內(nèi)容，涉及光合作用、呼吸作用、水分生理、根系生理、發(fā)育生理、抗性生理、衰老生理等，總計27學(xué)時。共上5次實驗，section為 1 學(xué)時；Secton 2、Secton 3、Secton 4，各包括兩個實驗內(nèi)容，各6 學(xué)時；Secton 5、Secton 6各一個內(nèi)容，各 4學(xué)時。每次實驗都設(shè)計成研究型實驗，有處理，在可能的情況下都設(shè)有重復(fù)，實驗結(jié)果需要整理分析。每個同學(xué)都要根據(jù)實驗內(nèi)容提出問題和假設(shè)，并寫出類似科研報告的實驗報告。4實驗室工作和安全要求(1) 發(fā)生任何事故都必須立

9、即報告；(2) 上實驗課不要穿好衣服，最好穿實驗服，在操作中注意防止腐蝕性物質(zhì)損壞衣物；(3) 不準(zhǔn)在實驗室吃食品，不準(zhǔn)喝水或飲料，不準(zhǔn)吸煙，避免用手接觸口鼻，防止有害物質(zhì)的侵害；(4) 易燃物質(zhì)必須遠(yuǎn)離火源；(5) 打壞的玻璃器具碎片必須小心的從地上、實驗臺上或水池中拾起放入垃圾筒中，以防傷害他人；(6) 隨手關(guān)閉水龍頭，特別是遇到停水的時候；(7) 在教師未講解前不得擅動儀器設(shè)備，不得擅動實驗室內(nèi)與實驗內(nèi)容無關(guān)的儀器設(shè)備；(8) 保持實驗臺清潔，以最大限度的減少事故的發(fā)生；(9) 實驗結(jié)束后，必須清潔自己所用的實驗用具和實驗臺；(10) 離開實驗室前需向指導(dǎo)教師報告，經(jīng)老師檢查實驗用具清潔

10、、擺放以及實驗臺衛(wèi)生合格后，方可離開；(11) 離開實驗室前將手清洗干凈。(12) 每個班同學(xué)分組負(fù)責(zé)實驗后的實驗室清潔工作，包括清潔實驗臺、擺放實驗用品、關(guān)閉儀器及電源、清理水池、檢查水龍頭是否關(guān)閉、拖地和倒垃圾。值日生清潔工作結(jié)束得到老師認(rèn)可后方可離開。其他要求見實驗室墻上的有關(guān)規(guī)章制度。第一次實驗的第一內(nèi)容是熟悉實驗室墻上的各種實驗室規(guī)章制度。Section 2（6h）一、植物的光合速率測定-改良半葉法光合作用是綠色植物特有的生理功能，是綠色植物吸收光能將CO2和H20合成為有機物質(zhì)并釋放O2的過程。光合作用及其有關(guān)過程的測定是植物生理學(xué)實驗的重要組成部分。 光合作用是由原初反應(yīng)、同化力

11、形成和二氧化碳同化3個主要階段組成。原初反應(yīng)包括光合色素對光能的吸收、光能的傳遞和光化學(xué)反應(yīng)，主要與葉綠素和其他光合色素有關(guān)；而同化力(ATP和NADPH2)的形成主要與膜的特性有關(guān)，二氧化碳同化除受同化力供應(yīng)影響外，還受與暗反應(yīng)有關(guān)酶活性的影響。光合作用強弱與環(huán)境條件變化密切相關(guān)。 光合速率是植物生理性狀的一個重要指標(biāo)，也是估測植株光合生產(chǎn)能力的主要依據(jù)之一。光合速率可根據(jù)植物對CO2的吸收量，O2的釋放量或干物質(zhì)(有機物質(zhì))的積累量來進行測定。隨著光合作用研究的深入，光合作用測定技術(shù)的水平也在不斷提高，方法和手段也越來越多。本次實驗學(xué)習(xí)光合速率測定最經(jīng)典的方法之一-改良半葉法。原理植物葉片

12、的主脈兩側(cè)對稱部分葉面積基本相等，其形態(tài)和生理功能也基本一致。用物理或化學(xué)方法處理葉柄或莖的韌皮部，保留木質(zhì)部，以阻斷葉片光合產(chǎn)物的外運，同時保證正常水分供應(yīng)。然后，將對稱葉片的一側(cè)取下置于暗中，另一側(cè)留在植株上保持光照，繼續(xù)光合作用。一定時間后，測定光下和暗中葉片的干重差，即為光合作用的積累的干物質(zhì)量。通過公式計算出光合速率。乘以系數(shù)后還可計算出C02的同化量。 材料、儀器、藥品 1材料：任選戶外一種植物。 2儀器及用品：(1) 剪刀；(2) 4塊濕紗布；（3）帶蓋磁盤；(4) 30個小紙牌，去戶外之前用鉛筆編號（115；115）；(5) 鑷子；(6) 打孔器；（7）鉛筆；（8）記號筆；(9

13、) 12個稱量瓶；(10) 烘箱；(11) 分析天平；（12）干燥器。 3藥品：5三氯乙酸。 方法 1取樣：在戶外選擇較綠和較黃的同種植物葉片各15片，要注意葉齡、葉色、著生節(jié)位、葉脈兩側(cè)和受光條件的一致性。綠葉和黃葉分別用紙牌編號（例如綠葉為1、2、315，黃葉為1、2、315）。增加葉片的數(shù)目可提高測定的精確度。 2處理葉柄：為阻止葉片光合作用產(chǎn)物的外運，可選用以下方法破壞韌皮部。(1) 環(huán)割法：用刀片將葉柄的外層(韌皮部)環(huán)割0.5cm左右。為防止葉片折斷或改變方向，可用錫紙或塑膠套管包起來保持葉柄原來的狀態(tài)。(2) 燙傷法：用棉花球或紗布條在90以上的開水中浸一浸，然后在葉柄基部燙半分

14、鐘左右，出現(xiàn)明顯的水浸狀就表示燙傷完全。若無水浸狀出現(xiàn)可重復(fù)做一次。對于韌皮部較厚的果樹葉柄，可用融熔的熱蠟燙傷一圈。（3）抑制法：用棉花球蘸取5三氯乙酸或0.3mol/L的丙二酸涂抹葉柄一周。本實驗統(tǒng)一使用三氯乙酸。注意勿使抑制液流到植株上。選用何種方法處理葉柄，視植物材料而定。一般雙子葉植物韌皮部和木質(zhì)部容易分開宜采用環(huán)割法；單子葉植物如小麥和水稻韌皮部和木質(zhì)部難以分開，宜使用燙傷法；而葉柄木質(zhì)化程度低，易被折斷葉片采用抑制法可得到較好的效果。 3剪取樣品：葉柄處理完畢后即可剪取樣品，并開始記錄時間，進行光合作用的測定。首先按編號次序（綠葉和黃葉交替進行）剪下葉片對稱的一半(主脈留下)，并

15、按順序夾在濕潤的紗布中（綠葉與黃葉分開保存），放入磁盤中，帶回室內(nèi)存于暗處。23h后，再按原來的順序依次剪下葉片的另一半。按順序夾在濕潤的紗布中（綠葉與黃葉分開保存）。注意兩次剪葉速度應(yīng)盡量保持一致，使各葉片經(jīng)歷相同的光照時間。 4稱干重：取12個稱量瓶分別標(biāo)上綠葉光照1、2、3，綠葉黑暗1、2、3，黃葉光照1、2、3，黃葉黑暗1、2、3，將各同號葉片照光與暗中的兩半葉疊在一起，用打孔器打取葉圓片，分別放入相應(yīng)編號的稱量瓶中（即光下和暗中的葉圓片分開）。每5 個葉片打下的葉圓片放入一個稱量瓶中，做為一個重復(fù)。記錄每個稱量瓶中的小圓片數(shù)量。打孔器直徑根據(jù)葉片面積大小進行選擇，盡可能多的打取葉圓片

16、。注意不要忘記用卡尺量打孔器的直徑。將稱量瓶中疊在一起的葉圓片分散，開蓋置于105烘箱中烘10min以快速殺死細(xì)胞，然后將溫度降到7080，烘干至恒重(24h左右)。取后取出加蓋于干燥器中冷卻至室溫，用分析天平稱重。 5結(jié)果計算： W2-W1A×t光合速率(mgDW·m-2 s-1)= 式中 W2：照光半葉的葉圓片干重(mg)；W1：暗中半葉的葉圓片干重(mg)；A：葉圓片面積(m2)；t：照光時間(S)。 若將干物質(zhì)重乘以系數(shù)1.5，便可得CO2的同化量，以mgC02·m -2S-1表示。實驗記錄1實驗材料：植物名稱：種植地點：發(fā)育時期：試驗處理：植物的生長狀況

17、：取樣部位及數(shù)量：2實驗時間： 年 月 日 時 分 至 時 分3實驗條件記錄項目實驗開始時實驗結(jié)束時平均值時間溫度光強風(fēng)速二氧化碳濃度4測定數(shù)據(jù)記錄重復(fù)葉圓片數(shù)量葉圓片總面積m2暗中半葉干重mgW1照光半葉干重mgW2光合速率mgDW·m-2 S-1綠葉123平均值標(biāo)準(zhǔn)差黃葉123平均值標(biāo)準(zhǔn)差5其他問題記載：實驗前思考題（1） 通過光合作用測定你能夠解決什么理論和實踐問題？（2） 說明光合作用的生理意義及其測定光合作用的重要性。（3） 根據(jù)光合作用的反應(yīng)方程式，光合作用涉及到二氧化碳、水、氧氣、有機物質(zhì)和光能的吸收，哪些因子可作為光合作用測定的指標(biāo)？為什么？請簡述各種光合作用測定方法

18、的基本原理？比較各種方法的優(yōu)缺點？（4） 為什么選擇葉齡、葉色、著生部位和受光一致，以及主脈兩側(cè)對稱的葉片？（5） 為什么將待測葉片編號？（6） 在改良半葉法中為什么要殺死韌皮部？（7） 三氯乙酸在本實驗中起什么作用？為什么？ （8） 有三種殺死韌皮部的方法，各適用何種試材？（9） 在取樣稱重時，為什么將同號葉片的兩個半葉疊在一起用打孔器打取葉圓片？（10）烘干時為什么樣品放入稱量瓶，在烘箱中不加蓋，而從烘箱取出時需要加蓋，并放入干燥器中？（11）如果將先取回的半片立即打孔取樣烘干，對最后的測定數(shù)據(jù)將會產(chǎn)生什么樣的影響？為什么？（12）在烘干過程中，為什么需要用105的高溫10min殺死細(xì)胞？

19、如若不然，將對實驗數(shù)據(jù)產(chǎn)生什么樣的影響？（13）測定時間過短對所測定的光合作用速率會產(chǎn)生什么樣的影響？為什么？測定時間過長又會產(chǎn)生什么樣的影響？為什么？（14）為使不同時間測定的數(shù)據(jù)具有可比性，你認(rèn)為需要控制什么環(huán)境條件？為什么？（15）寫出實驗時間安排和操作流程圖。 實驗后思考題（挑戰(zhàn)題）（1）測定時間過長對不同光合產(chǎn)物輸出類型植物的影響大小相同嗎？（2）從原理上講，改良半葉法還可用于何種植物生理生化指標(biāo)的測定并需要做何修改？請說明之。二、植物葉綠素含量測定-丙酮提取法高等植物光合作用過程中利用的光能是通過葉綠體色素(光合色素)吸收的。葉綠體色素由葉綠素a、葉綠素b、胡蘿卜素和葉黃素組成。葉

20、綠體色素的提取、分離和測定是研究它們的特性以及在光合中作用的第一步。葉片葉綠素含量與光合作用密切相關(guān)，是反眏葉片生理狀態(tài)的重要指標(biāo)。在植物光合生理、發(fā)育生理和抗性生理研究中經(jīng)常需要測定葉綠素含量。葉綠素含量也是指導(dǎo)作物栽培生產(chǎn)和選育作物品種的重要指標(biāo)。原理葉綠素不溶于水，溶于有機溶劑，可用多種有機溶劑，如丙酮、乙醇或二甲基亞砜等研磨提取或浸泡提取。葉綠色素在特定提取溶液中對特定波長的光有最大吸收，用分光光度計測定在該波長下葉綠素溶液的吸光度(也稱為光密度)，再根據(jù)葉綠素在該波長下的吸收系數(shù)即可計算葉綠素含量。利用分光光計測定葉綠素含量的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即當(dāng)一束單色光通過溶液

21、時，溶液的吸光度與溶液的濃度和液層厚度的乘積成正比。其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：A=Kbc式中： A為吸光度；K為吸光系數(shù)；b為溶液的厚度；c為溶液濃度。葉綠素a、b的丙酮溶液在可見光范圍內(nèi)的最大吸收峰分別位于663、645nm處。葉綠素a和b在663nm處的吸光系數(shù)（當(dāng)溶液厚度為1cm，葉綠素濃度為g·L-1時的吸光度）分別為82.04和9.27；在645nm處的吸光系數(shù)分別為16.75和45.60。根據(jù)Lambert-Beer定律,葉綠素溶液在663nm和645nm處的吸光度（A663和A645）與溶液中葉綠素a、b和總濃度（a+b）（Ca、Cb 、Ca十b，單位為g·L-1），的

22、關(guān)系可分別用下列方程式表示：A663=82.04Ca+9.27Cb （1）A645=16.76Ca+45.60Cb （2）解方程（1）和（2）得：Ca=12.7 A6632.59 A645 (3)Cb=22.9 A6454.67 A663 (4)Ca十b20.3 A6458.04 A663 (5) 從公式（3）、（4）、（5）可以看出，只要測得葉綠素溶液在663nm和645nm處的吸光度，就可計算出提取液中的葉綠素a、b濃度和葉綠素總濃度（a+b）。在652nm處，葉綠素a和b的吸光系數(shù)相同，因此提取液中葉綠素的總濃度（a+b）也可通過測定溶液在波長652nm處的吸光度（A652）求得，其計算

23、公式為： A652×100034.5Ca十b （6） 式中：34.5為葉綠素a和b在波長652nm處的吸光系數(shù)。 但Inskeep等（1985）認(rèn)為葉綠素a和b吸光系數(shù)相等時的波長位于吸收光譜斜率很陡的位置上，因此儀器波長很小的偏差都可能導(dǎo)致很大的測定誤差。 所測定材料的單位面積或單位重量的葉綠素含量可按下式進行計算：C×VA×1000 葉綠素含量（mg·g-1或mg·dm-2）= （7） 式中：C為葉綠素濃度（mg·L-1）或mg·dm-2）；V為提取液總體積（ml）；A為取樣鮮重（g）或取樣面積（dm-2）。材料、儀器、

24、藥品 1材料：植物綠色葉片。在本實驗中利用光合速率測定實驗中取回室內(nèi)的綠色半葉和黃色半葉為試材。 2儀器：(1) 分光光度計；（2）天平；(3) 研缽；(4) 濾紙；(5) 漏斗；(6) 5ml移液管；(7) 打孔器；（8）滴管；（9）剪刀；（10）25ml容量瓶；（11）毛刷；（12）擦鏡紙。方法 1取樣：用毛筆或毛刷清除葉片表面的灰塵，用打孔器從綠葉和黃葉上各打取0.25dm-2的葉圓片，立即稱重，剪碎后放入研缽中。（在正規(guī)實驗中應(yīng)各重復(fù)3次，本實驗為減少丙酮向環(huán)境中的排放，故不設(shè)重復(fù)）。注意取樣時要避開大的葉脈。如果需要計算葉片干樣葉綠素含量，另取一份相同樣品置于烘箱中烘干，用于測定干重

25、。2研磨提?。合蜓欣徶屑尤?0%丙酮2.5ml，以及少許CaCO3 (中和酸性，防止葉綠素酯酶分解葉綠素) 和石英砂，研磨成勻漿，再加入3ml 80%丙酮，繼續(xù)研磨至組織變白，在暗處靜止35min后，用一層干濾紙過濾到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮將研缽洗凈，清洗液也要過濾到容量瓶中，并用80%丙酮沿濾紙的周圍洗脫色素，待濾紙和殘渣全部變白后，用80%丙酮定容至刻度。3讀取吸光度：取厚度為lcm的潔凈比色皿，注意不要用手接觸比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗23次，注意清洗時要使清洗液接觸比色皿內(nèi)壁的所有部分，然后將色素提取液倒入比色皿中，液面高度約為比色皿高度的4/5，將撒在比色皿

26、外面的溶液用濾紙吸掉（注意不能擦），再用擦鏡紙擦干擦凈。將比色皿放入儀器的比色皿架上，注意不要將溶液撒入儀器內(nèi)。第一個位置放盛有80%丙酮的比色皿，做為空白對照。將儀器波長分別調(diào)至663、645、652nm處，以80%丙酮做為空白對照調(diào)透光率100%，分別測定溶液在上述三個波長下的吸光度。每個樣品重復(fù)測定3次。注意，每次在轉(zhuǎn)換波長時，都要用80%丙酮調(diào)透光率100%。 4結(jié)果計算：將645、663、652nm處測得的吸光度代入公式（3）、（4）、（5）、（6）中計算葉綠素a、b濃度和總濃度。再將葉綠素a、b濃度和總濃度代入公式（7）中求出所測材料單位重量或單位面積的葉綠素a、b含量和總含量。實

27、驗結(jié)果記錄1實驗材料：植物名稱：種植地點：發(fā)育時期：試驗處理：植物的生長狀況：取樣時間：取樣部位及數(shù)量：2測定地點：3測定時間： 年 月 日 時 分 至 時 分4測定條件記錄： 5數(shù)據(jù)記錄及結(jié)果記載：表1 測定數(shù)據(jù)記錄及計算結(jié)果重復(fù)光密度葉綠素含量 mg/g FW 或mg/dm2645nm652nm663nmchlachlbChla+b公式（5）Chla+b公式（6）Chla/chlb綠葉123平均值標(biāo)準(zhǔn)差黃葉123平均值標(biāo)準(zhǔn)差 注：本實驗中由于數(shù)值都來自同一樣品，所以平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差計算只做為練習(xí)。6其他問題記載：實驗前思考題（1）通過葉綠素含量測定你能夠解決什么理論和實踐問題？（2）說明葉綠

28、素的生理意義以及葉綠素含量測定的重要性？（3）請簡述各種葉綠素含量測定方法的基本原理？比較各種方法的優(yōu)缺點？（4）為什么取樣時避免打取主脈，樣品中含有葉脈，對測定數(shù)據(jù)會產(chǎn)生什么樣的影響？（5）為什么葉綠素提取液用80%丙酮而不用100%的丙酮？（6）在研磨提取葉綠素時為什么向研缽中加入少量石英砂和CaCO3？（7）在強光下提取葉綠素對測定結(jié)果會有什么樣的影響？為什么？ （8）在用分光光度計測定葉綠素提取液的光密度時，為什么要用80%丙酮將儀器的透光率調(diào)到100%？如果用蒸餾水調(diào)100%對測定數(shù)據(jù)會有什么影響？（9）為什么在測定時需要洗凈比色皿？洗凈的比色皿在倒入提取液時為什么還要用提取液洗2-

29、3遍？（10）在使用分光光度計時，為什么每改變一次波長，就需要重新調(diào)零和調(diào)透光率100%？（11）什么是吸光系數(shù)？在本實驗中葉綠素的吸收系數(shù)的單位是什么？（12）為使不同時間測定的數(shù)據(jù)具有可比性，你認(rèn)為需要控制什么環(huán)境條件？為什么？（12） 寫出實驗時間按排和操作流程圖。（13）寫出光合速率測定和葉綠素含量測定實驗的統(tǒng)一時間安排和實驗流程圖。實驗后思考題（挑戰(zhàn)題）（1）葉片中的類胡蘿卜素和花色素是否影響葉綠素含量測定？為什么？（2）如果你不知道葉綠素的吸收系數(shù)，但有葉綠素的純品，如何測定樣品中的葉綠素含量？（3）根據(jù)你所掌握的知識，如何提純?nèi)~綠素？如何檢驗葉綠素的純度？（4）能否根據(jù)物品上的綠

30、色殘跡分析出植物的種類？為什么？（5）如果實驗室中沒有我們通常用的厚度為1cm的比色杯，只有1.5cm的，若用其測定葉綠素含量，在結(jié)果計算時需要用對計算公式做何種改變？（6）比較你用波長652nm、波長645nm以及663nm測定的葉綠素總量，是否有差異？若有差異分析其原因？Section 3（6h）三、植物組織水勢測定-小液流法植物的水分代謝包括植物體從外界吸收水分、植物體內(nèi)水分運轉(zhuǎn)以及植物通過表面向外界散失水分。這種水分運動的動力是相鄰部位的水勢差。水勢是以壓力單位表示的水的化學(xué)勢，代表水的能量水平。植物組織的水勢愈低，吸水能力愈強，反之則愈弱。因此水勢是研究植物與環(huán)境的水分關(guān)系的重要指標(biāo)

31、。在栽培生產(chǎn)上水勢也是了解植物體內(nèi)水分狀態(tài)，制訂灌溉計劃的重要指標(biāo)。水勢的測定有多種方法，可分為氣態(tài)平衡法和液態(tài)平衡法。前者要求精密的儀器設(shè)備，靈敏度高，如熱電偶溫濕度計法；后者要求設(shè)備簡單，操作方便，但靈敏度低，如小液流法和折射儀法。小液流法亦稱比重法或著色法，是水勢測定的最經(jīng)典方法之一。該方法是前蘇聯(lián)學(xué)者夏爾達(dá)科夫(Chardakov)提出的，經(jīng)過多次改進，成為一個簡單而實用的方法。 原理水的流向是：是從高的勢流向低的勢（人往高處走水往低處流） 在恒溫恒壓下，由植物組織與外界溶液組成的體系的水勢包含有植物組織的水勢和溶液的滲透勢。如果植物組織的水勢低于外液的滲透勢，則植物組織吸水而使外液濃

32、度變大；反之，植物組織失水而使外液濃度變?。蝗舳呦嗟?，則外液濃度不變，此時外界溶液的滲透勢等于植物組織的水勢。同一種溶液濃度不同，比重亦不同。當(dāng)兩個不同濃度的溶液相遇時，稀的溶液由于比重小而上浮，濃的溶液比重大而下沉。當(dāng)把浸過植物組織的溶液滴回到原濃度的溶液中時，液滴會發(fā)生下降、上升或基本不動幾種情況。如果液滴下降，說明浸泡液的滲透勢高于植物組織的水勢；若液滴上升，說明浸泡液的滲透勢低于植物組織的水勢；如果液滴不動，則表示植物組織與浸泡液的水分交換處于動態(tài)干衡中，浸泡液的滲透勢等于植物組織的水勢。浸泡液的滲透勢依據(jù)范特荷夫公式計算： 一iCRT式中：為滲透勢，單位為MPa；i為范特荷夫系數(shù)或

33、等滲系數(shù)，對于不解離的蔗糖溶液為1.0，對于NaCl溶液為2.0；C為浸泡液的摩爾濃度；R是理想氣體常數(shù)，0.0082；T是絕對溫度。浸泡液的液滴不動時，植物組織的水勢（MPa）w一iCRT 材料、儀器、藥品 1材料：高濃度NaCl處理的以及沒有處理的對照小麥幼苗葉片。2儀器：(1) 5ml試管8支；(2) 10ml刻度試管8支；(3) 細(xì)滴管810支；（4）移液管8支；(5) 試管架1個；(6) 打孔器(0.5 cm2左右)1個或刀片1個；(7) 鑷子、解剖針、濾紙。 3藥品：（1） 甲烯藍(lán)粉末；(2) 蔗糖溶液，濃度為lmol·L-1。 方法1準(zhǔn)備器具：將試驗所需要試管和滴管洗凈

34、烘干。2配制不同濃度的蔗糖溶液：測定植物組織水勢時所用的溶液，一般最常用的是蔗糖溶液。但也可用無機鹽溶液，以9份NaCI與1份CaCl2混合而成的平衡溶液較好。為簡便，亦可用純CaCl2溶液。本實驗采用蔗糖溶液。取潔凈干燥的10ml刻度試管8支編號（甲組），將1mol的蔗糖溶液稀釋成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8mol·L-1的8種濃度。按下表配制不同濃度的蔗糖溶液。配制好的溶液要充分混勻。蔗糖系列濃度溶液配制試管號123456781mol蔗糖加入量ml12345678加蒸餾水量ml98765432蔗糖濃度mol/L0.10.20.30.40.50.6

35、0.70.8 3準(zhǔn)備浸泡液：取潔凈干燥的5ml試管8支編號（乙組），從甲組中依次取出0.10.8 mol的蔗糖溶液1ml，分別加入乙組的各個試管中，蓋上蓋防止蒸發(fā)，放到試管架上，做為浸泡液。 4向浸泡液中加待測樣品：取10個待測小麥葉片，用毛刷清潔葉表面，將基部和項部切掉。所有葉片放在一起，用刀片切成0.3cm左右的切段，分別放入浸泡試管（乙組）中，每個試管中的葉切段數(shù)量要一致，并且每個試管中來自每個葉片的切段數(shù)量相同，以保證各個試管中的樣品水勢盡可能的一致，將葉片切段全部浸沒在溶液中，蓋上蓋子。5溶液平衡：葉切段浸泡30min，期間輕輕搖動試管數(shù)次，以加速水分平衡。 6平衡情況檢測：葉切段浸

36、泡30min后，用解剖針分別放入少許甲烯藍(lán)粉末在乙組每個試管中，使溶液著色，但甲烯藍(lán)粉末不宜加過多。將浸泡液充分混勻。用細(xì)滴管吸取有色溶液少許，插入相應(yīng)濃度的甲組試管中，使滴管尖端位于溶液中部，然后輕輕擠出1小滴有色溶液，小心抽出滴管(注意勿攪動溶液)，放回相應(yīng)的浸泡試管中。觀察有色小液滴的升降情況并做好記錄。如果有色液滴下降，則說明葉片組織吸水，葉片組織的水勢小于該濃度溶液的滲透勢；如果有色液滴上升，表示浸過組織的溶液濃度變小(即植物組織中有水分排出)，說明葉片組織的水勢大于該濃度溶液的滲透勢；如果有色液滴靜止不動，說明葉片組織與外液的水分交換達(dá)到動態(tài)平衡，葉片組織的水勢等于該濃度溶液的滲透

37、勢；如果在前一濃度中下降，而在后一濃度中上升，則植物組織的水勢取兩種濃度溶液滲透勢的平均值。7結(jié)果計算：將確定的蔗糖溶液濃度帶入公式 一iCRT中計算植物組織的水勢。實驗結(jié)果記錄1實驗材料：植物名稱：種植地點：發(fā)育時期：試驗處理：植物的生長狀況：取樣時間：取樣部位及數(shù)量：2測定地點：3測定時間： 年 月 日 時 分 至 時 分4測定條件記錄 5實驗數(shù)據(jù)記錄有色浸泡液小滴在原濃度溶液中的運動情況記載液滴表現(xiàn)蔗糖濃度 mol/L樣品水勢MPa0.10.20.30.40.50.60.70.8鹽處理對照液滴表現(xiàn)為上升、靜止不動或下降，用“”“”“”表示。6其他問題記載：實驗前思考題(1) 通過水勢測定

38、你能夠解決什么理論和實踐問題？(2) 說明水分的生理意義以及水勢測定的重要性？(3) 請簡述各種水勢測定方法的基本原理？比較各種方法的優(yōu)缺點？(4) 在取樣時，為什么將所取葉片全部疊在一起用切成切段，然后分別放入不同的試管并保證每個試管中來自每個葉片的切段數(shù)量一致？(5) 在本實驗中蔗糖起什么作用？(6) 為什么實驗中所用的試管、滴管都要洗凈烘干？(7) 葉切段在蔗糖溶液中保持時間長短對測定結(jié)果會產(chǎn)生什么影響？為什么？(8) 浸泡液數(shù)量多少對實驗有什么影響？(9) 為什么向浸泡葉切段的蔗糖溶液中加入甲烯藍(lán)溶液？又為什么不能多加？(10) 在用滴管從浸泡液中取溶液前為什么要充分混勻？（11）為什

39、么從滴管中擠出液滴時要輕輕擠壓？(12) 有色液滴為什么會在原濃度溶液中上升、下降或靜止不動？(13) 在測定時為什么要在試管上加蓋以防止水分蒸發(fā)？(14) 為了使不同時間測定的數(shù)據(jù)具有可比性，你認(rèn)為需要控制什么環(huán)境條件？為什么？(15) 寫出實驗時間按排和操作流程圖實驗后思考問題題（挑戰(zhàn)題）(1) 你認(rèn)為在實驗的那一步最容易產(chǎn)生誤差？為什么？(2) 什么溶液可代替蔗糖作為浸泡液？選擇浸泡溶液的標(biāo)準(zhǔn)是什么？(3) 從原理上講，小液流法還可用于何種生理活動的測定？請說明其原理。(4) 從理論上講，浸泡液的濃度變化還可以用何種方法檢測？請說明原理。四、植物根系活力測定-甲烯藍(lán)法 植物的根系是吸收水

40、分和礦質(zhì)營養(yǎng)的主要器官，又是物質(zhì)合成和轉(zhuǎn)化的器官，因此根系的生長發(fā)育狀況和活力直接影響植物體的生命活動。在植物營養(yǎng)和環(huán)境生理研究中常需測定根系活力。本實驗學(xué)習(xí)用甲烯藍(lán)法測定根系表面積和根系活力。 原理 根據(jù)沙比寧等的理論，認(rèn)為植物根系對溶質(zhì)吸收最初具有吸附的特點，并假定此時被吸附物質(zhì)是以單分子層形式均勻地覆蓋在根系表面，因此可以根據(jù)根系對某種物質(zhì)的吸附量來測定根的吸收面積。一般常用甲烯藍(lán)作為被吸附物質(zhì)，其被吸附的數(shù)量可以根據(jù)供試溶液濃度的變化用比色法準(zhǔn)確地測出。現(xiàn)已知lmg甲烯藍(lán)成單分層時可覆蓋1.1m2的面積，據(jù)此可求出根系的總吸收面積。當(dāng)根系在甲烯藍(lán)溶液中已達(dá)吸附飽和而仍留在溶液中時，根系

41、的活躍部分能把原來吸附在表面的物質(zhì)吸收到細(xì)胞中去，因而可繼續(xù)吸附甲烯藍(lán)。從后一個吸收量求出活躍吸收面積，可作為根系活力的指標(biāo)。 材料、儀器、藥品 1材料：用高溶度NaCl處理的以及沒有處理的對照小麥幼苗根系，在取樣時應(yīng)十分小心，以免將根系折斷或損傷。 2儀器：(1) 分光光度計；(2) 小燒杯6個；(3) 吸水紙；(4) 10或25ml量筒1個(依根系大小而定)；(5) 移液管lml和10ml各1支；(6) 10ml試管16支；（7）試管架1個。3藥品：(1) 0.075mg/ml 甲烯藍(lán)溶液；（2）0.01mg/ml 甲烯藍(lán)溶液。方法 1繪制甲烯藍(lán)溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線：取7支試管，編號，按下表配制

42、標(biāo)準(zhǔn)溶液。甲烯藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制試管號12345670.01g甲烯藍(lán)加入量ml0123456加蒸餾水量ml10987654甲烯藍(lán)溶液濃度mg/ml0.0.0010.0020.0030.0040.0050.006 把各試管中的溶液混勻后，利用分光光度計測定在波長660nm下的吸光度，測定時以1號試管(蒸餾水)為空白對照調(diào)透光率100%。然后，以甲烯藍(lán)系列濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2測定體系體積：取待測小麥5株，將根系洗凈控干后，浸在事先裝有一定體積水的10ml或25ml量筒里(或用體積計)，用排水法測定根系體積。3測定根系活力：（1）取3個小燒杯編號，各加入0.075mg/ml甲

43、烯藍(lán)溶液5ml（每杯中溶液量約10倍于根系的體積），從每個燒杯中取出0.5ml溶液，分別加入到3個10ml試管中，稀釋15倍，混勻，在660nm下測定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出對應(yīng)的濃度，然后計算出0.075mg/ml溶液的甲烯藍(lán)的精確含量。記住，取潔凈的比色皿，在比色時先用少量溶液清洗比色皿數(shù)次。（2）從量筒中取出根系，用濾紙把水吸干，勿傷根系。然后放入第一個盛有甲烯藍(lán)溶液的小燒杯里，浸1.5min之后立即取出，將根系上多余的甲烯藍(lán)液控回到原燒杯中去，再放入到第二個小燒杯中浸1.5min，取出后，同樣控凈溶液，再放到第三個小燒杯中浸1.5min，取出控凈溶液。 （3）從上述浸過根系的3個小燒杯

44、中，分別取出甲烯藍(lán)溶液lml，分別放入三支試管中，稀釋10倍，搖勻，用分光光度計在660nm波長下讀取吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的濃度，最后算出每杯溶液中剩余甲烯藍(lán)的毫克數(shù)。 4結(jié)果計算：測定數(shù)據(jù)填入表36，并按下列公式求出根的吸收面積。 總吸收面積=（ C1C1）×V1+(C2C2)×V2×1.1 活躍吸收面積=(C3C3)×V3×1.1活躍吸收面積（m2）×100總吸收面積（m2） 活躍吸收面積(%)=根的總吸收面積（cm2）根的體積（cm3） 比面積=實驗結(jié)果記錄1實驗材料：植物名稱：種植地點：發(fā)育時期：試驗處理：植物的生長狀

45、況：取樣時間差：取樣部位及數(shù)量：2測定地點：3測定時間： 年 月 日 時 分 至 時 分4實驗條件記錄 5實驗數(shù)據(jù)記錄及結(jié)果記載表1 甲烯藍(lán)標(biāo)準(zhǔn)溶液的光密度記錄試管號1234567甲烯藍(lán)濃度 mg/ml00.0010.0020.0030.0040.0050.006光密度表2 甲烯藍(lán)浸泡液的光密度記錄及吸附量計算結(jié)果樣 品鹽 處 理對 照杯 號123123浸泡前光密度浸泡前濃度mg/ml浸泡后光密度浸泡后濃度mg/ml吸附量mg表3 根系活力和比活力樣品根吸收面積m2百分活躍吸收面積%根體積cm3比表面總面積活躍吸收面積m2總比表面m2/cm3活躍比表面m2/cm3鹽處理對照6其他問題記載：實驗

46、前思考題（1）通過根系活力測定你能夠解決什么理論和實踐問題？（2）說明根系吸收活力大小的生理意義以及根系活力測定的重要性？（3）簡述各種根系活力測定方法的基本原理？比較各種方法的優(yōu)缺點？（4）測定根系活力時最好選擇根的哪個部位？為什么？（5）為什么選用甲烯藍(lán)測定根系表面積？（6）為什么要嚴(yán)格控制根系在甲烯藍(lán)溶液中的浸泡時間？（7）為什么根系在測定液中轉(zhuǎn)移時要控干溶液？（）為什么在測定時需要洗凈比色皿？洗凈的比色皿在倒入提取液時為什么還要用提取液洗2-3遍？（）為什么用于浸泡根系的0.075mg/ml甲烯藍(lán)溶液還要測光密度，然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其甲烯藍(lán)含量？（10）為使不同時間測定的數(shù)據(jù)具有可比

47、性，你認(rèn)為需要控制什么環(huán)境條件？為什么？（11）寫出實驗時間按排和操作流程圖（12）與水勢測定實驗結(jié)合在一起寫出實驗時間按排和操作流程圖實驗后思考題（挑戰(zhàn)題）（1）如果甲烯藍(lán)濃度過大，其濃度和光密度還成線性關(guān)系嗎？為什么？（2）如果有甲烯藍(lán)吸光系數(shù)，還需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線嗎？為什么？（3）為什么在用分光光度計測定物質(zhì)含量時，有時用吸光系數(shù)，有的需要做標(biāo)準(zhǔn)曲線？Section 4（6h）五、植物抗逆性鑒定-外滲電導(dǎo)法 植物生存的環(huán)境條件是經(jīng)常變化的，在植物的一生中，約有90的時間是處在不利的環(huán)境條件下。寒冷、干旱、高溫、鹽堿等是常見的自然災(zāi)害，隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展，又出現(xiàn)了大氣、土壤和水體污染等災(zāi)害。此

48、外，還有病蟲侵染和雜草的危害。這些不良的環(huán)境條件統(tǒng)稱為逆境，它對植物的生理過程和生長發(fā)育可造成各種危害，輕則生長發(fā)育不良，重則絕產(chǎn)或死亡。對于農(nóng)作物來說，逆境條件是限制產(chǎn)量的重要因素，據(jù)Boyer(1982)對美國8種主要農(nóng)作物的統(tǒng)計，由于病、蟲、雜草等生物脅迫造成的減產(chǎn)不過10，而70左右的減產(chǎn)是來自氣象和土壤因素引起的理化環(huán)境脅迫。因此，研究植物在逆境條件下的生理反應(yīng)及其忍耐或抵抗能力，采取有效措施提高植物的抗逆性，對于進一步發(fā)展農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，具有十分重要的意義。 逆境傷害以及植物在逆境條件下的生理反應(yīng)是多種多樣的，近年來人們采用各種方法，進行了廣泛的研究，從生態(tài)、形態(tài)、生理、生化等方面，提出

49、了一些有關(guān)植物抗性的鑒定指標(biāo)和研究方法。其中一些已在理論研究和生產(chǎn)實踐中得到了普遍的承認(rèn)和廣泛的應(yīng)用。本實驗介紹其中的外滲電導(dǎo)法。原理 細(xì)胞膜不僅是分隔細(xì)胞質(zhì)和胞外環(huán)境的屏障，而且也是細(xì)胞與環(huán)境發(fā)生物質(zhì)交換的主要通道，又是細(xì)胞感受環(huán)境變化刺激的部位。細(xì)胞膜的選擇透性是其維持生理功能的最重要的條件之一。各種逆境傷害都會造成質(zhì)膜選擇透性的改變或喪失，例如低溫、冰凍、干旱脫水等導(dǎo)致的細(xì)胞膜機械損傷以及逆境和衰老過程中的膜脂過氧化作用，都可以增大細(xì)胞膜通透性。因此，細(xì)胞質(zhì)膜透性的測定常作為植物抗性研究中的一個重要生理指標(biāo)。當(dāng)質(zhì)膜的選擇透性因逆境傷害而明顯改變或喪失時，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)(尤其是電解質(zhì))大量外

50、滲，從而引起組織浸泡液的電導(dǎo)率發(fā)生變化，通過測定外滲液電導(dǎo)率的變化，就可反映出質(zhì)膜的傷害程度和所測材料抗逆性的大小。Dexter (1930)首先用電導(dǎo)法測定了植物的抗凍性，經(jīng)過不斷地改進和完善，目前已得到廣泛應(yīng)用。 材料、儀器、藥品1材料：菠菜或其他植物葉片。 2儀器：(1) 20ml具塞試管；(2) l0ml移液管；(3) 洗瓶；(4) 溫度計；(5) 玻棒、鑷子；(6) 打孔器；(7) 剪刀及定距離刀片；(8) 帶蓋白瓷盤2個；(9) 濾紙、紗布、鉛筆；(10) 電導(dǎo)率儀；(11) 天平(1萬或1千)；(12) 溫箱；(13) 水浴鍋；(14) 恒溫水??；(15) 真空泵；(16) 真空干燥器；(17) 負(fù)壓表；(18) 振蕩器。 ， 3藥品：(1) 洗液；(2) 去污粉；(3) 無離子水。 方法 1清洗用具：由于電導(dǎo)率儀對溶液中的電解質(zhì)含量變化極為靈敏，所用玻璃器皿或其他用具如不潔凈，就會嚴(yán)重影響實驗結(jié)果，所以實驗開始前必須首先清潔實驗用具。玻璃用具和打孔器先用去污粉(或洗液)清洗，再分別用自來水、無離子水沖洗數(shù)遍，然后放入(或倒置在)洗凈且墊有潔凈濾紙的瓷盤中，并用蓋子或潔凈紗布蓋好。2材料準(zhǔn)備：本實驗選取顏色、大小、厚度相對一致的綠色較小葉片30枚，另選取30枚較黃的葉片。先用自來水沖洗除去表面的污物，再用無離子水清洗葉片，然后用潔凈濾紙將葉